一种基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法与流程

本发明属于分子生物学领域，涉及一种PCR检测方法，具体为基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法。

背景技术：

丽草蛉(Chrysopa formosa Brauer)，脉翅目，草蛉科，主要分布于我国的黑龙江、辽宁、吉林、北京、河北、山东、山西、河南、湖北、天津、甘肃、新疆、上海、四川、陕西等地区。成虫和幼虫的捕食能力都很强，主要捕食蚜虫、介壳虫、红蜘蛛和多种昆虫卵，也捕食蛾类幼虫等。是田间生物防治的主要捕食性天敌。

集团内捕食(Intraguild predation,简称IGP)作用是一种更为复杂的种间关系,广泛存在于各种生态系中,充分认识IGP作用的内在本质和作用机理,对发展和完善更有效的生物防治理论和策略、增强生物控害的功能、推进生物防治工程的建设有重大的意义。而常规的肠道解剖、行为观察等传统研究方法不能准确评价草蛉之间的捕食作用。目前，对丽草蛉的特异性检测的方法尚未建立。

同时，传统的草蛉鉴定是依据形态的差异，需具有一定的专业知识才能准确鉴定，而通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术进行鉴定只需常规分子生物学方面的知识就能解决，并且准确可靠、简便快速。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述问题，提供一种基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法，具有检测速度快的优点。

本基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法包括以下步骤：

(1)制备特异性SS-COI引物：根据丽草蛉的线粒体DNA序列(genbank:KJ592501.1)，设计一对丽草蛉的特异性SS-COI引物，其包括：

正向引物CfF5：5'-TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3’

反向引物CfR1：5'-TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3’；

(2)提取样品总DNA：在棉田采集丽草蛉，将单头虫体放入离心管中将其磨碎，用提取试剂盒提取单头虫体基因组溶液，将基因组溶液保存备用，进行PCR扩增时吸取基因组溶液作为DNA模板；

(3)以步骤2)提取的总DNA为模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1进行PCR扩增反应；PCR反应体系以20μL计为：

(4)分析PCR产物：对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如出现大小为250bp的DNA扩增条带，则表明样品为丽草蛉。

在上述的基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法中，所述步骤(1)中，通过genbank的KJ592501.1，结合DNA条形码技术中的通用引物：

LepF1：(5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’)和

LepR1：(5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)

扩增出丽草蛉的COI产物，进行多条引物设计，从中筛选出特异性SS-COI引物，即正向引物CfF5和反向引物CfR1。

在上述的基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法中，所述步骤(3)中PCR反应条件为：首先，94℃3分钟；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分钟，共45循环次；最后，72℃10分钟。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：采用SS-COI PCR技术检测丽草蛉，该技术操作简单、快速、高效，灵敏度较高，丽草蛉的DNA最低检出浓度为0.143ng/μL。

附图说明

图1为本发明丽草蛉特异性引物CfF5/CfR1的PCR检测结果图。其中，M：100bp DNA ladder；1-64为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。

图2为本发明丽草蛉特异性引物CfF5/CfR1的DNA浓度梯度检测结果图。其中，M：100bp DNA ladder；1-8为丽草蛉DNA原模板浓度89.54ng/μL依次4倍稀释浓度梯度，-为阴性对照。

具体实施方式

如图1、图2所示，本方案包括以下步骤：

(1)制备特异性SS-COI引物：根据丽草蛉的线粒体DNA序列(genbank:KJ592501.1)，设计一对丽草蛉的特异性SS-COI引物，其包括：

正向引物CfF5：5'-TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3’

反向引物CfR1：5'-TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3’；

(2)提取样品总DNA：在棉田采集丽草蛉，将单头虫体放入1.5mL离心管中将其磨碎，用OMEGA Insect Genomic DNA Kit提取试剂盒(OMEGA公司，美国)提取单头虫体基因组溶液。将基因组溶液保存于-20℃备用，进行PCR扩增时吸取1μL溶液作为DNA模板；

(3)以步骤2)提取的总DNA为模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1进行PCR扩增反应；PCR反应体系以20μL计为：

(4)分析PCR产物：对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，取8μL PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统中，根据扩增产物的大小来鉴定丽草蛉，如出现大小为250bp的DNA扩增条带，则表明样品为丽草蛉。

在上述的基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法中，所述步骤(1)中，通过genbank的KJ592501.1，结合DNA条形码技术中的通用引物：

LepF1：(5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’)和

LepR1：(5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)

扩增出丽草蛉的COI产物，进行多条引物设计，从中筛选出特异性SS-COI引物，即正向引物CfF5和反向引物CfR1。

在上述的基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法中，所述步骤(3)中PCR反应条件为：首先，94℃3分钟；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分钟，共45循环次；最后，72℃10分钟。

利用引物CfF5/CfR1，以丽草蛉DNA为模板，以丽草蛉同域的44种其他昆虫(见表1)为对照进行SS-COI PCR扩增，结果如图1所示。1、2泳道对应的丽草蛉扩增出了250bp的目的条带，表明根据丽草蛉线粒体DNA CO1基因设计的SS-COI引物的特异性强，其250bp序列如SEQ ID No.3所示。

表1引物特异性检测中所涉及的昆虫种类

第二部分，引物CfF5/CfR1对丽草蛉最低检出量的测定

按第一部分中的方法提取单头丽草蛉基因组DNA，然后原模板浓度89.54ng/μL以5倍进行递减稀释至检测不出条带，取1μL作为PCR检测的模板，进行PCR反应，PCR反应条件为：首先，94℃3分钟；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分钟，共45循环次；最后，72℃10分钟。

利用引物CfF5/CfR1做最低检出量的测定，丽草蛉的DNA最低检出浓度为0.143ng/μL，结果如图2所示。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

序列表:

SEQ ID No.1

CfF5: 5'- TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG -3’

SEQ ID No.2

CfR1: 5’- TTGAAGATGCCAGTAATAAG -3’

SEQ ID No.3

1 TAGTTTAAGT TTATTAATTC GGGCTGAATT AGGTCAACCA GGATCTTTAATTGGTGATGA

61 TCAAATTTAT AATGTAATTG TAACAGCACA TGCTTTTATT ATAATTTTTTTTATAGTAAT

121 ACCAATTGTA ATTGGAGGTT TTGGTAATTG ATTAGTACCT TTAATACTTGCGGCTCCTGA

181 TATAGCTTTT CCACGTATAA ATAATATAAG TTTTTGAATA CTTCCTCCTTCATTAACCTT

241 ATTACTGGCA TCTTCAA

SEQ ID No.4

LepF1：5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’

SEQ ID No.5

LepR1：5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’