实现牙齿干细胞向神经元分化的基于培养基的方法
发明领域
1.本发明涉及基于培养基的方法用于诱导牙齿干细胞向多巴胺能神经元的特异性分化的用途。
2.发明背景人体中的间充质干细胞的来源之一是牙齿组织。表征了从牙齿不同部位分离的干细胞。这些的实例是从牙髓、牙周结缔组织和未萌出的阻生牙分离的细胞[1]。牙源干细胞(ddsc)是引人注目的，因为它们来源于在胚胎期期间由神经管的外胚层形成的神经外胚层细胞(神经嵴细胞)[2]。这些细胞具有分化成许多不同类型的细胞和组织的能力。除牙齿发生外，发现这些细胞还具有骨发生、脂肪发生、软骨发生和神经发生的能力[1]。因为它们来源于神经嵴细胞，并展现出一些神经特异性表达概况，ddsc被视为是治疗神经退行性疾病的有前景的细胞类型。神经退行性疾病的发病率日益增加，所述神经退行性疾病的发生是由神经细胞的不断增加且不可逆的功能缺失或死亡而导致。诸如中枢神经系统中新神经元的形成有限，存在延迟恢复的因子，以及使外科手术介入难以进行的头骨结构的原因使得这类疾病难以治疗。
[0003]
用于治疗由神经细胞损伤或损失造成的这类疾病的重要方法之一是干细胞的应用[3]。已经观察到在以适当的技术应用于确定位置之后，干细胞能够迁移至损伤区域，具有分化能力，并且通过刺激内源干细胞而有助于损伤修复过程[4]。现在，诸如牙齿、骨髓、血液、软骨、脂肪的那些组织可以作为成体干细胞的来源[5]。这些类型的干细胞分化成在神经退行性疾病中损失的细胞类型的能力，将使得有可能在实验室环境中，利用从可以更容易地取自患者的中枢神经系统组织的组织制备的细胞，创建个体-特异性疾病模型[6]。研究这些不同类型干细胞的神经源性分化能力将能够确定细胞类型和方法，其可以对于神经退行性疾病的治疗中的死亡神经细胞替换，以及对于通过创建这些疾病的个体-特异性细胞培养模型开发各种疗法做出最大贡献。
[0004]
诱导多能干细胞向神经元的分化具有如下的缺点，诸如培养中的低分化产率，高突变率，比培养和分化间充质细胞的成本更高，源细胞含有病毒基因并因此在体内细胞转移中具有相当高的导致致癌性的潜力。此外，由于牙齿干细胞在胚胎学起源方面更接近神经组织的事实，已知用于神经源性分化中的脂肪和骨髓衍生的间充质干细胞转化为神经细胞所花费的时间段更长，并且不具有如牙齿干细胞一样高的潜在能力。在获得间充质干细胞时，出现如下的缺点，诸如(特别是从骨髓和软骨)获取细胞的方法学上的困难，以及无法获得大量的细胞。最后，在不同来源的干细胞的分化中，在培养基中使用的破坏细胞形态结构并导致细胞中的伪神经发生的物质，诸如dmso、bha或β-巯基乙醇，使得无法继续培养分化的细胞。
[0005]
在本领域已知的申请，中国专利文献号cn104726406公开了诱导牙髓间充质干细胞分化成神经细胞的方法。在我们的专利申请中，如在方法部分中所述且如图-1中所示，在干细胞向神经元的分化期间，当细胞密度在40-50%之间时，添加额外的化学品(vpa和ibmx)以停止细胞周期。这样，以健康的方式分化所述细胞，并向神经谱系诱导，其不是由于高密
度而是由于所应用的方法。
[0006]
在本领域已知的申请，中国专利文献号cn1590537公开了分离和培养外胚间充质干细胞的方法。在该发明的范围内，所述方法可用于骨组织工程化、肌肉组织工程化、牙齿组织工程化和修复外周神经细胞。此外，在所述专利申请中，使用神经胶质谱系而不是神经谱系的分化过程，以确保外周神经细胞的再生。此外，它从方法学上与我们的专利申请不同，因为仅使用毛喉素(forskolin)化学品并且它由单个步骤组成。如文献中已知的，显示在分化中使用环腺苷酸活化剂，诸如单独的毛喉素，是不够的。同时，通过形态学和通过使用甲酚紫染色二者，均证明了在我们的专利申请中的分化方法的可靠性(图2-3)。出于以上解释的所有原因，观察到我们的专利申请中的方法更为有效。
[0007]
现有技术申请之一，美国专利申请文献号us2016296669公开了用于生产治疗神经损伤的移植材料的方法。所述发明的方法包括在培养基中培养牙髓干细胞的步骤，所述培养基不含除fgf2 (或bfgf (碱性成纤维细胞生长因子))之外的生长因子。此外，已知在所述专利文献中使用的fgf2因子仅激活与牙髓衍生干细胞的神经谱系相关的基因。然而，已知许多信号通路，包括细胞周期，在干细胞的分化中发挥关键作用。因此，显然仅向干细胞施用fgf2因子没有提供有效的神经细胞转化。考虑到这些，已经显示我们专利申请的发明具有如图-4所示的成熟且功能性的神经元基因表达，这是由于遵循由两个步骤组成的方案，以激活分化通路和使神经细胞成熟，也如该方法中所述。
技术实现要素：
[0008]
本发明的目的是基于培养基的牙源干细胞向多巴胺能神经元的分化。
[0009]
本发明的另一目的是开发细胞应用，其用于治疗退行性神经疾病以及与所述疾病相关的药物。
[0010]
发明详述在附图中图示说明了所开发的用于实现本发明目标的“用于牙齿干细胞向神经元分化的基于培养基的方法”，其中：图1：显示在本发明范围内创建的神经源性诱导培养基取决于天数对细胞的细胞周期的影响的图示。[((a) 用神经源性诱导培养基处理0、2、4和6天((a-1)、(a-2)、(a-3)和(a-4))的细胞的细胞周期图)，(b) 处于g0/g1期的细胞百分比的图示，(c) 处于s期的细胞百分比的图示，(d) 处于g2/m期的细胞百分比的表示]图2：显示在本发明范围内，经神经源性诱导培养基处理6天的细胞的形态学检测；神经元特异性的细胞胞体(cell soma)，所述细胞中的延长的轴突和生长锥的显微图像。图3：显示在本发明范围内，经神经源性诱导培养基处理6天的细胞以及仅在培养基中生长的对照细胞，在用神经源性细胞特异性甲酚紫染料染色后的光学显微镜图像。[((a) 神经源性培养基，(b) 对照]图4：显示在本发明范围内，经神经源性诱导培养基处理6天的细胞以及仅在培养基中生长的对照细胞中，神经源性细胞特异性基因的测量结果的图示。[(a) neun基因，(b) nurr 1基因，(c) dat基因，(d) snap 25基因，(e) nf-h基因，(f) map2基因，(g) th基因和(h) bcl
‑ꢀ
2基因]。
[0011]
在图中所示的组分各自的参考编号如下：
a.轴突s.胞体gc.生长锥。
[0012]
在本发明范围内，进行细胞应用领域的研究，其用于治疗神经退行性疾病和与这些疾病相关的药物的开发，实验室中的细胞分化研究，用于治疗诸如神经母细胞瘤的癌症类型的药物开发。因此，在本发明范围内，开发了新的基于培养基的应用，以特异性地诱导从牙齿获得的干细胞向多巴胺能神经元的分化。
[0013]
在干细胞向神经元分化的应用中，考虑到牙齿干细胞在胚胎学起源方面更接近于神经组织，并且在现有技术中用于神经源性分化中的脂肪(软骨)和骨髓衍生的间充质干细胞转化为神经元所花费的时间段更长，可见与本领域已知的应用相比，牙齿干细胞具有更高的向神经元分化的潜在能力。
[0014]
本发明范围内进行的牙齿干细胞的神经源性分化方法包括以下步骤：-以5000个细胞/cm2的浓度接种牙齿干细胞-孵育24小时后，将所述细胞引入至第一部分的神经源性诱导培养基并继续应用该培养基培养4天，-随后，将所述细胞引入至第二部分的神经源性诱导培养基并继续应用该培养基培养2天，-在6天结束时，终止分化。
[0015]
上述方法中所述的第一部分和第二部分的神经源性诱导培养基的内容物如下：神经源性诱导培养基部分1：
●
补充glutamax的dmem/f12
●
b-27补充物%1
●
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)100
µm●
丙戊酸钠盐(vpa)2mm
●
毛喉素0.1
µm●
碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20ng/ml
●
表皮生长因子(egf)20ng/ml。
[0016]
神经源性诱导培养基部分2：
●
补充glutamax的dmem/f12
●
b-27补充物%1
●
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)100
µm●
丙戊酸钠盐(vpa)2mm
●
毛喉素0.1
µm●
碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20ng/ml
●
表皮生长因子(egf)20ng/ml
●
脑源性神经营养因子30ng/ml。
[0017]
凭借本发明提供的优点可以列出如下：
●
在间充质干细胞而不是诱导多能干细胞中提供有效的神经元分化。
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与其它分化培养基和方案相比，在更短的时间段中观察到神经元分化。
●ꢀ
与其它分化培养基和方案相比，观察到更有效的神经元形成。
●ꢀ
通过其它培养基分化的细胞的神经元分化是可逆的，而在本发明范围内分化的细胞呈现终末转化。
●ꢀ
同样如图所示，细胞周期在第2天停止，这是有效分化所必需的。
●ꢀ
当与其它培养基相比时，没有对细胞造成任何毒性。
●ꢀ
这些神经元细胞可以用于组织再生和移植，同时它们也为神经科学研究做出巨大的贡献。
[0018]
实验研究细胞周期测定为了观察其在细胞周期中的时期的变化，对经神经源性培养基处理的牙齿干细胞进行流式细胞术分析。对于细胞周期测定，通过rnase a和nonidet p40处理，以及碘化丙啶染色，对在神经源性分化过程中第2、4、6天固定的细胞进行分析。
[0019]
实时聚合酶链式反应进行实时聚合酶链式反应测定以观察用神经源性培养基处理的细胞在基因水平上的变化。这些改变在形态学水平和基因表达水平上。所使用的引物是使用primer blast软件设计的(美国国家生物技术中心 = ncbi)。从细胞分离总rna，对其应用凝胶组合并合成cdna。在fermentas maxima sybr green混合产物中，将合成的cdna与引物混合，如此将使最终体积为20
ꢀµ
l，并使用bio-rad装置分析基因的表达水平。
[0020]
分化细胞的形态学分析在使用神经源性培养基处理细胞的分化过程的最后一天，在光学显微镜下对细胞进行形态学分析。在分析分化的细胞时，从形态学上检查了特征性细胞的发育和存在，以及神经元中的结构。
[0021]
分化细胞的甲酚紫染色在使用神经源性培养基处理细胞的分化过程的最后一天，对见于神经元特异性的细胞中的特征性尼氏小体进行染色。应用于细胞的甲酚紫染料对见于神经细胞的胞体(s)中的颗粒内质网的核糖体染色，并显示出深蓝紫色。另一方面，可以检测到淡粉色的未分化的牙齿干细胞。
[0022]
参考文献