与猪肌内脂肪性状相关的SNP分子标记及其应用与检测方法

与猪肌内脂肪性状相关的snp分子标记及其应用与检测方法
技术领域
1.本发明涉及分子遗传学领域，尤其涉及与猪肌内脂肪性状相关的snp分子标记及其应用与检测方法。


背景技术：

2.中国是猪肉生产及消费大国，猪肉在国民生活中占有重要地位。2021年，全国肉类产量8887.0万吨，其中猪肉产量5296.0万吨，占肉类总产量的59.6％，生猪及猪肉产业关系着社会的稳定与民生的根本。目前国内猪肉市场主要以瘦肉型猪为主，其生长速度快，瘦肉率高，然而早期猪选种计划中没有将肉质纳入选种改良目标，使得市场上猪肉的肉品质与风味情况良莠不齐。随着人民生活水平的提高，消费者们在选购时会更加关注猪肉的肉质。这种需求在推动市场转变的同时也带动了行业的革新。生产肉质鲜嫩、风味独特、营养丰富的猪肉成了养殖业及相关工作者的新目标。
3.猪肉肉质狭义的定义为人对猪肉最直观的感官品质，如视觉、嗅觉、味觉和触觉等，具体的猪肉品质可以通过下列指标进行评价：肉色、肌肉系水力、风味、ph值、滴水损失、大理石纹、系水力、嫩度、风味、多汁性等。而广义的肉品质还包括肉的深加工品质、营养价值和卫生质量等。已有大量文献报道肌内脂肪含量及其脂肪酸组成既是肌肉呈现大理石纹的原因，也与猪肉多汁性、嫩度和风味等肉质性状高度相关，是公认的生产和研究中重点关注的影响肉质风味和肉质评定的主要指标之一。
4.然而通常情况下的肉质指标都为屠宰后测定，不仅检测成本高，而且测定比较困难。此外，肉质性状除了受自身遗传因素影响，季节、温度及屠宰前处理等环境因素都会对其造成重要影响，这些因素都可能降低遗传评估的准确性，进而影响肉质性状的遗传改良。因此，研发出快速、简便、有效的猪肌内脂肪性状的分子遗传标记，可以应用于大群体的快速检测，增加肌内脂肪性状的选择压，加快遗传改良工作的进程。
5.dkk2(dickkopf wnt signaling pathway inhibitor 2)基因编码的蛋白质是dickkopf家族的一员，是wnt信号的抑制剂。wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，其功能最常见于胚胎发育和癌症，也参与成年动物的正常生理过程等。已有研究表明wnt信号通过参与进脂肪沉积与分化中，通过β-catenin通路，结合tcf/lef转录因子家族结合启动转录，进而结合不同的转录辅激活物，促进前脂肪细胞的增殖、维持或影响分化。那么dkk2作为该通路的抑制剂，也将影响脂肪细胞的增殖或分化。在秦川牛上的研究显示，存在于dkk2第一外显子的snp(c29t)与肌内脂肪含量相关。也有研究者利用小鼠3t3-l1胚胎成纤维细胞、c3h/10t1/2间充质干细胞，验证了dkk2基因有抑制成脂的作用。此外，同属于dkk家族的dkk1基因目前研究相较更为透彻和全面，已有多项研究在人和鼠上证明dkk1基因可以减少和调节脂肪的生成。然而从前期研究和文献资料查阅情况来看，dkk2基因功能尚未在猪物种上进行验证，其具体作用机制尚不明晰，亦不清楚是否存在snp位点与猪肌内脂肪性状相关，进而能够作为分子标记应用于遗传育种之中。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供与猪肌内脂肪性状相关的snp分子标记及其应用与检测方法。
7.本发明提供了与猪肌内脂肪性状相关的snp分子标记，所述snp分子标记位于猪dkk2基因内含子区第12726位碱基或猪八号染色体第114874954位碱基，该位点的碱基为a或c。
8.本发明提供了所述snp分子标记在检测猪肌内脂肪性状中的应用。
9.本发明所述的应用中，所述脂肪性状包括肌内脂肪含量。所述snp分子标记的基因型为aa，则待测猪为肌内脂肪低型；所述snp分子标记的基因型为cc，则待测猪为肌内脂肪高型；所述snp分子标记的基因型为ac，则待测猪为肌内脂肪中间型。
10.本发明还提供了检测所述snp分子标记基因型的引物对，所述引物对分为上游引物和下游引物，所述上游引物具有如seq id no.1所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如seq id no.2所示的核苷酸序列。所述上游引物的序列为aggcttcctgcttgtca(sdeq id no.1)，引物在8号染色体第114874697-114874714bp；所述下游引物的序列为tcttatgtttgttggctgt(seq id no.2)，引物在8号染色体第114874686-114874705bp。该引物对产物长度578bp，退火温度59℃。
11.本发明还提供了检测所述snp分子标记基因型的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。
12.进一步的，本发明提供的试剂盒中还包括taq dna聚合酶、pcr缓冲液，该试剂盒使用方便、快捷、高效、结果准确。
13.本发明还提供了检测与猪肌内脂肪性状相关的snp分子标记的方法，其包括使用所述的引物对和/或所述的试剂盒检测待测物。
14.本发明所述的方法中，所述方法包括使用所述的引物对或所述的试剂盒，pcr扩增待测猪基因组dna，对pcr产物用bsphi内切酶进行酶切，若酶切产物为399bp和179bp，(两条产物)突变处碱基为a；若酶切产物为578bp，(一条产物)则突变处碱基为c。
15.本发明所述的方法中，所述pcr扩增反应程序为：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃35s，共35个循环；72℃10min；4℃∞；所述酶切反应程序为：37℃，过夜；65℃20min；4℃∞。
16.本发明提供了如下i～iii中的任一项在猪种质资源改良和/或选育高或适宜肌内脂肪猪种中的应用:
17.i：所述的snp分子标记；ii：所述的引物对；iii：所述的试剂盒。
18.本发明还提供了猪的育种方法，所述方法包括使用所述的引物对或所述的试剂盒对亲本或子代的基因型进行检测。本发明提供了方法依据所述snp分子标记区分或预期猪只的肌内脂肪含量。
19.本发明所述的方法中，所述方法具体包括在猪dkk2基因内含子区第12726碱基或猪八号染色体第114874954碱基突变位置上游利用特异性引物扩增出突变所创造bsphi内切酶位点，利用pcr-rflp方法检测snp分子标记基因型。
20.本发明所述的猪分为七个类型：华北型、华中型、华南型、西南型、高原型、江海型和外来型；具体包括民猪、枣庄黑盖猪、沙子岭猪、大围子猪、宁乡猪、金华猪、小梅山猪、兰
塘猪、莆田猪、鄂西猪、内江猪、藏猪、大白猪、巴克夏猪和杜洛克猪。
21.以沙子岭猪为中国地方猪种代表，大白猪、巴克夏猪为外来猪种代表，进行全基因组重测序。在前期的表型研究中发现，沙子岭猪作为中国地方猪种，其肉质和肉风味较好，尤其体现在肌内脂肪较高。为寻找肌内脂肪差异的基因组数据基础，对3个群体共41头猪的全基因组重测数据的snp和选择信号进行分析和研究。最终富集、注释后发现dkk2基因与脂肪合成和分化有关。结合snp calling结果，筛选出了影响猪肌内脂肪的位点，即dkk2基因内含子区第12726碱基或猪八号染色体第114874954碱基，该位点的碱基为a或c。
22.以299头猪(共15个群体)为验证材料(主要为中国地方猪种为主，包括6种类型，个体之间无亲缘关系，如表1)，利用pcr-rflp技术对这些猪进行分型工作。结合测序结果最终发现，杜洛克的a基因频率为优势，且只具有aa和ac个体，相应的a基因频率为82.86％，其肌内脂肪含量在所检验的猪种中最低；而包括巴克夏猪(外来偏肥肉脂兼用型)和所有中国地方猪种的c基因频率为优势，且均高于70％(除巴克夏外，可能由于样本数偏少)。大白猪作为一个例外，其作为外来引用猪种，肌内脂肪含量较低，按理来说应当a基因频率为优势，但实际其分型与部分中国地方猪种相近，猜测可能与国外大白猪种曾与国内引进梅山猪杂交改良有关。在此基础上，试验中以a基因频率为x，肌内脂肪含量为y，利用已有的表型数据和分型结果进行回归分析，最终得到两者之间的线性回归模型为y＝-1.973979263x+4.700316512，p＝0.048694825，达到显著水平，由此可以看出该snp位点的a基因频率是与肌内脂肪含量成显著负相关关系。
23.本发明提供一种与猪肌内脂肪性状相关的snp分子标记及其应用与检测方法。本发明对不同猪品种dkk2基因外显子区进行检测，发现dkk2基因内含子区第12726碱基或猪八号染色体第114874954一处snp位点(a-c)，等位基因a与低肌内脂肪性状呈正相关，而等位基因c与高肌内脂肪性状呈正相关。本发明提供了检测该snp分子标记的方法，利用核苷酸序列如seq id no.1～2所示的引物对扩增待测猪基因组dna并用bsphi酶切，若酶切产物为399bp和179bp(两条)，突变处碱基为a，若酶切产物为578bp(一条)，则突变处碱基为c。本发明方法能够早期、快速、低成本、有效的预测猪肌内脂肪含量，可作为一个有用的分子标记应用于猪种的遗传改良，快速、早期、低成本地预测猪肌内脂肪情况；在猪种改良方面具有广阔的应用前景，具有广阔的市场，针对此发明开发的试剂盒，可以产生可观的经济效益和良好的社会效益。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
25.图1示bsphi酶切位点等相关信息；
26.图2示三种基因型bsphi酶切后琼脂糖电泳结果图，左：基因型aa；中：基因型ac；右：基因型cc。
具体实施方式
27.本发明提供了与猪肌内脂肪性状相关的snp分子标记及其应用与检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
28.表1：验证群体及其表型数据(猪肌内脂肪含量数据来源于《中国畜禽遗传资源志
·
猪志》2011年5月)
[0029][0030][0031]
本发明实施例1用以筛选与肌内脂肪性状相关snp的重测序数据的dna耳样来源于湘潭市家畜育种站。实施例2中所用的各品种猪种质资源来自各个原产地地区的保种场，如藏猪来自于西藏藏猪保种场，实施例中的杜洛克猪来源于广州温氏集团。
[0032]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0033]
实施例1与猪肌内脂肪性状相关的snp分子标记的获得
[0034]
以沙子岭猪、巴克夏猪、大白猪共41头猪(沙子岭猪20头、巴克夏猪10头、大白11头)重测序数据为基础。首先对使用fastqc软件和trimmomatic软件对reads数据进行质控和筛选；质控后的clean reads利用bwa、samtools和gatk软件比对到猪参考基因组上(版本号：sscrofa11.1-release100)，获得排序且已标记重复序列的bam文件。之后使用gatk软件
中haplotypecaller、selectvariant和variantfiltration模块对每一个个体的bam文件进行变异检测，得到质控筛选后的snps，并使用snpeff对snps信息情况进行注释。获得的snps利用fst&θπ进行选择信号分析，并对群体选择信号检测中显著的基因区域进行go和kegg分析。根据富集分析信息，基本实验功能验证后筛选到与肌内脂肪沉积和分化相关的dkk2基因，该基因显示主要与胚胎发育相关，也与脂肪的合成和分化有关。
[0035]
根据测序数据，实验者在dkk2基因区域一共发现了34个差异snp，其中在猪dkk2基因内含子区第12726碱基或猪八号染色体第114874954碱基疑似与肌内脂肪性状相关，因为该位点在杜洛克(低肌内脂肪)参考基因组中为a，而在沙子岭猪(高肌内脂肪)中基本全为c(基因频率0.975)。随后，实验者对不同肌内脂肪含量的15个猪种(包括299头猪)进行snp等位基因频率进行分析，发现只有杜洛克中有较多的aa型，其中a基因频率为82.26％，而其他高肌内脂肪型猪种都是c基因频率为优势，且均高于70％(除巴克夏外)。该群体验证结果进一步印证了该snp位点可能与肌内脂肪含量相关的猜想，随后，实验者以a基因频率为x，肌内脂肪含量为y，利用已有的表型数据和分型结果在excel中进行回归分析，最终得到两者之间的线性回归模型为y＝-1.973979263x+4.700316512，p＝0.048694825，达到显著水平，上述结果进一步证实了肌内脂肪含量与该snp位点的关联性：即这一snp位点与肌内脂肪含量显著关联，其等位基因a与低肌内脂肪呈正相关，而等位基因c则与高肌内脂肪正相关。
[0036]
实施例2检测与肌内脂肪性状相关的snp分子标记方法的建立
[0037]
根据实施例1的研究结果以及序列的特性选择利用限制性内切酶长度多态性(rflp,restriction fragment length polymorphism)对实施例1的snp分子标记进行群体水平检测。在突变位置上游利用特异性引物引入突变创造bsphi内切酶位点，该位置碱基为a时则能被bsphi酶切，为c时则不能被bsphi酶切，借此用于分型(如图1)。利用表2引物进行pcr扩增，之后将pcr产物用表3的酶切体系进行酶切处理。
[0038]
表2：利用bsphi酶切检测a/c突变特异性引物
[0039][0040]
表3：酶切反应体系(30μl)
[0041][0042]
经过过夜酶切之后将5μl酶切产物用于1.5％的琼脂糖凝胶电泳150v，25min后，可根据电泳条带位置具体进行分型如图2。结果发现该位置c基因型在中国地方猪种中频率较高，而a基因型只有在国外猪种中如杜洛克猪种中频率较高，具体分型情况如下表4：
[0043]
表4：不同猪种基因型鉴定及基因频率情况
[0044][0045]
将个体的基因型与表型之间进行关联分析，发现本发明的snp分子标记的突变位点显著关联猪肌内脂肪含量，且a等位基因在杜洛克瘦肉型猪品种分布频率相对较高，显著高于中国脂肪型猪品种如金华猪、内江猪等。由此可见，a/c位点与猪肌内脂肪显著相关，可作为标记用于群体选育改良工作。
[0046]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。