多特异性抗体的制作方法

本发明涉及一种多特异性抗体，其包含两个特异性结合间皮素的基于抗体的结合结构域(msln-bd)；和至少一个特异性结合cd3的基于抗体的结合结构域(cd3-bd)；其中所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白fc区多肽，并且其中当通过spr测量时，每个所述msln-bd结合间皮素(msln)的单价解离常数(kd)的范围为0.5至20nm。本发明还涉及编码所述多特异性抗体的核酸序列、包含所述核酸序列的载体、包含所述核酸序列或所述载体的宿主细胞，以及生产所述多特异性抗体的方法。此外，本发明涉及包含所述多特异性抗体的药物组合物及其使用方法。

背景技术：

1、尽管癌症的治疗取得了相当大的进展，但癌症仍然是一个尚未得到满足的主要医疗需求。近年来，随着各种分子类型的免疫疗法的出现，在癌症治疗中取得了一些最实质性的进展，包括但不限于：单克隆抗体(mab)、双特异性抗体(bsab)、重组蛋白、和嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)疗法。这些疗法通过以下方式诱导抗肿瘤免疫：a)主动将免疫效应细胞导向肿瘤驻留细胞，和/或b)刺激免疫效应细胞，和/或c)解除肿瘤介导的免疫抑制。这些免疫疗法通常利用肿瘤驻留细胞(例如，恶性细胞、肿瘤脉管系统细胞、基质细胞、免疫细胞等)的特异性抗原的过表达(与肿瘤外位点相比)，将它们的药理活性靶向肿瘤。在这些抗原中，肿瘤相关抗原(taa)包含恶性细胞选择性过表达的细胞表面蛋白。通过以高亲和力(affinity)结合taa，免疫疗法可以在一定程度上将其免疫调节活性限制在肿瘤细胞和免疫效应细胞之间的免疫突触。

2、一类常见的taa结合免疫治疗剂是mab，其通过调理肿瘤细胞并通过表达fcγ受体(fcγr)的细胞(主要是自然杀伤(nk)细胞)触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)来引发抗肿瘤免疫。其他taa结合免疫治疗剂利用细胞毒性t淋巴细胞(ctl)来诱导恶性细胞的靶向清除，例如car-t细胞以及同时与t细胞抗原cd3结合的bsab(taa/cd3 bsab)。

3、虽然taa-(再)靶向ctl和常规taa/cd3 bsab的治疗效用已经过临床验证，但剂量限制性毒性(dlt)通常会阻止以最大有效剂量(med)给药或导致治疗中断，从而导致疗效有限。

4、dlt的一个原因是，常规taa/cd3 bsab也通常与细胞因子释放综合征(crs)相关，推测是由于抗cd3结构域的过度活性。免疫疗法的肿瘤外活性导致健康组织中促炎细胞因子的分泌，这可导致不良的安全性。此外，尽管taa/cd3bsab能有效地耗尽taa过表达细胞，但它们是通过募集和刺激ctl来做到这一点的，无论这些细胞是否表达识别肿瘤抗原的t细胞受体(tcr)(即肿瘤反应性t细胞)。因此，taa/cd3 bsab不是刺激或重新激活宿主的天然抗肿瘤免疫，而是不加选择地刺激ctl，潜在地造成安全风险。

5、虽然此类dlt产生的确切途径可有所不同，但通常可通过增强药理学活性的肿瘤定位来最小化或消除免疫疗法相关毒性的风险。

6、几乎只在癌细胞上表达的taa，如癌胚瘤抗原，被称为纯净taa(clean taa)。也在正常的非癌细胞上表达——通常与癌细胞相比水平较低——的taa被认为是非纯净taa。由于taa/cd3 bsab方法的高效性，非纯净taa是一个挑战，因为它们会损伤同样表达taa的非肿瘤细胞。间皮素(msln)是非纯净taa的一个实例；它不仅在肿瘤细胞上表达，也在各种其他组织中表达，尽管水平较低。因此，当靶向非纯净taa时，需要新的疗法来提高taa/cd3bsab方法对肿瘤组织的选择性，并最小化脱肿瘤/靶向效应(off tumor/on targeteffect)。这尤其适用于msln/cd3 bsab方法。

7、间皮素(msln)已被提议作为可靶向治疗msln+实体癌，例如间皮瘤的肿瘤相关抗原(taa)。许多其他类型的癌症也是msln+，包括某些形式的卵巢癌和胰腺癌，以及三阴性乳腺癌。目前间皮瘤的治疗标准包括肿瘤切除、化疗和放疗，以及减少体液和疼痛管理等缓解措施。针对持续生长的肿瘤的免疫疗法包括使用pd-1/pd-l1阻断剂，如pembrolizumab和nivolumab，或抗ctla4抗体，如ipilimumab，用于刺激免疫系统，以及vegf抑制剂，如贝伐单抗(bevacizumab)，用于阻断血管新生。虽然这些疗法已经取得了临床成功，但它们具有更高的全身副作用风险。因此，需要一种靶向msln的特异性方法。

8、已经进行了或正在进行大量临床前和早期临床研究，以评估通过几种不同方法靶向msln的可行性，包括基于抗体的药物和car-t细胞。基于抗体的药物包括用以下药剂靶向msln表达细胞：抗msln片段ss1p免疫毒素与化疗药物如培美曲塞(pemetrexed)和顺铂(cisplatin)一起或与pe38偶联；阿麦妥单抗(amatuximab)，一种诱导adcc的嵌合单克隆抗体；抗体药物缀合物，例如anetumab ravtansine(bay 94-9343:抗msln+微管蛋白抑制剂dm4)或dmot4039a(抗msln+抗有丝分裂单甲基auristatin e)以抑制肿瘤生长。hpn536是一种多特异性结合物(抗msln+抗cd3+抗白蛋白)，具有更长的半衰期，它似乎可以在体内和体外重新引导t细胞杀伤表达msln的靶细胞，并且食蟹猴似乎对其耐受性良好。几种抗msln嵌合抗原受体(car)-t疗法也被很好地耐受，包括瞬时mrna转染的car-t(rna cartmeso)和用自杀基因(icasp9m28z)工程化的car-t。到目前为止，对大多数抗msln疗法的反应是不太大的，这表明治疗实体肿瘤存在挑战。

9、对于抗msln疗法，该问题因msln脱落到癌症患者的血清中而进一步复杂化，在血清中它被称为可溶性间皮素相关蛋白(smrp)。对msln具有高亲和力的抗体也强烈结合smrp，这显著抵消了它们的活性，降低了对癌细胞的有效剂量。

10、因此，需要能够在smrp的存在下有效定位于肿瘤并促进t细胞反应的新分子。

11、具有至少三个结合结构域的多特异性抗体(其中两个结构域特异性结合间皮素(msln-bd)，一个结构域特异性结合cd3(cd3-bd)，其中两个msln-bd的结合亲和力在良好平衡的范围内)理论上可以解决许多前述的安全性和有效性方面的限制。这种多特异性抗体理论上能够引起高肿瘤定位和选择性提高，这可以为多种癌症提供更安全且更有效的治疗。此外，这种分子将进一步限制联合施用额外免疫疗法以增强患者反应的需要，支持开发的简易性并使治疗成本最小化。然而，由于其分子结构、其组分抗原结合结构域的性质、其可生产性和/或不良的生物物理性质的问题，用于治疗用途的多特异性抗体的实施已经变得很复杂。综上所述，仍然明显需要新型多特异性抗体，这些抗体表现出更高的肿瘤细胞定位并引起有效的t细胞激活，同时具有可容忍的毒理学特征，并且具有适合于药物开发的生物物理特性。

12、此外，尽管已经存在许多对msln和/或cd3具有特异性的抗体，但这些多特异性抗体的复杂性和特殊要求需要开发具有量身定做的特性的新型抗体域。

13、因此，尽管对于患有癌症的患者有许多治疗选择，但是仍然需要有效和安全的治疗剂，并且需要以更有针对性的方式优先使用它们。免疫调节生物制剂由于其作用方式而为癌症的治疗提供了有前途的方法，但是，整体免疫刺激以及这种免疫调节对病理相关细胞和部位没有任何限制，会导致许多副作用和明显的毒性，这有可能导致患者的发病率和死亡率增加。因此，本发明的目的是提供一种药物，以改善对增生性疾病，特别是癌症的治疗。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种药物，以改善对增生性疾病，特别是癌症的治疗。特别地，本发明的一个目的是提供一种具有增加的靶向效力从而改善毒理学特征的药物。

2、第一方面，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含：

3、a)两个特异性结合间皮素的基于抗体的结合结构域(msln-bd)；和

4、b)至少一个特异性结合cd3的基于抗体的结合结构域(cd3-bd)；

5、其中所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白fc区多肽，并且其中当通过spr测量时，每个所述msln-bd结合间皮素(msln)的单价解离常数(kd)的范围为0.5至20nm。

6、第二方面，本发明涉及一种特异性msln结合结构域。

7、第三方面，本发明涉及一种核酸序列或两种核酸序列，其编码本发明的多特异性抗体或特异性msln结合结构域。

8、第四方面，本发明涉及一种载体或两种载体，其包含本发明的所述核酸序列或所述两种核酸序列。

9、第五方面，本发明涉及一种宿主细胞或多种宿主细胞，其包含本发明的所述载体或所述两种载体。

10、第六方面，本发明涉及一种生产本发明的多特异性抗体或特异性结合结构域的方法，包括：(i)提供本发明的一种核酸序列或两种核酸序列或本发明的一种载体或两种载体，表达所述一种核酸序列或多种核酸序列或所述一种载体或多种载体，并从所述表达系统中收集所述多特异性抗体或所述特异性结合结构域，或者(ii)提供本发明的一种宿主细胞或多种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或多种宿主细胞；并从细胞培养物中收集所述多特异性抗体或所述特异性结合结构域。

11、第七方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本发明的多特异性抗体和药学上可接受的载体。

12、第八方面，本发明涉及本发明的多特异性抗体用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自癌症、炎性疾病和自身免疫疾病的人类疾病，其中所述多特异性抗体是包含三个或四个结合结构域的单链蛋白质。

13、第九方面，本发明涉及本发明的多特异性抗体用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自癌症、炎性疾病和自身免疫疾病的人类疾病，其中所述多特异性抗体是包含三个或四个结合结构域的异源二聚体蛋白质。

14、第十方面，本发明涉及一种用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自癌症、炎性疾病和自身免疫疾病的人类疾病的方法，包括施用上述定义的本发明的单链多特异性抗体的步骤，所述单链多特异性抗体包含三个或四个结合结构域。

15、第十一方面，本发明涉及一种用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自癌症、炎性疾病和自身免疫疾病的人类疾病的方法，包括施用上述定义的本发明的异源二聚体多特异性抗体的步骤，所述异源二聚体多特异性抗体包含三个或四个结合结构域。

16、分别单独地或组合地在以下各项中概述的本发明的方面、有利特征和优选实施方案进一步有助于解决本发明的目的：

17、1.一种多特异性抗体，其包含：

18、a)两个特异性结合间皮素的基于抗体的结合结构域(msln-bd)；和

19、b)至少一个特异性结合cd3的基于抗体的结合结构域(cd3-bd)；

20、其中所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白fc区多肽，并且其中当通过spr测量时，每个所述msln-bd结合间皮素(msln)的单价解离常数(kd)的范围为0.5至20nm。

21、2.根据项目1所述的多特异性抗体，其中通过针对靶细胞的t细胞驱动细胞毒性试验测定，在至少200ng/ml，特别是至少300ng/ml，特别是至少400ng/ml，特别是至少500ng/ml可溶性间皮素的存在下，所述多特异性抗体用于杀死靶细胞的ec50增加不超过25倍，其中，通过流式细胞术测定，所述靶细胞的msln表达水平比met-5a细胞(atcc crl-9444)高6至8倍。

22、3.根据项目1所述的多特异性抗体，其中通过针对靶细胞和met-5a细胞的t细胞驱动细胞毒性试验测定，所述多特异性抗体能够杀死靶细胞，其ec50比杀死met-5a细胞的ec50小至少10倍，特别是至少20倍，特别是至少25倍，其中，通过流式细胞术测定，所述靶细胞的msln表达水平比所述met-5a细胞(atcc crl-9444)高6至8倍。

23、4.根据项目1至3中任一项所述的多特异性抗体，其中当通过spr测量时，每种所述msln-bd结合间皮素(msln)的单价解离常数(kd)的范围为0.5至15nm，特别是范围为0.6至10nm，特别是范围为0.7至5nm。

24、5.一种多特异性抗体，其包含：

25、a)两个特异性结合间皮素的基于抗体的结合结构域(msln-bd)；和

26、b)至少一个特异性结合cd3的基于抗体的结合结构域(cd3-bd)；

27、其中所述多特异性抗体不包含免疫球蛋白fc区多肽，并且其中当通过spr测量时，每个所述msln-bd结合间皮素(msln)的单价解离常数(kd)的范围为0.1至5nm。

28、6.根据项目5所述的多特异性抗体，其中通过针对靶细胞的t细胞驱动细胞毒性试验测定，在至少200ng/ml，特别是至少300ng/ml，特别是至少400ng/ml，特别是至少500ng/ml可溶性间皮素的存在下，所述多特异性抗体用于杀死靶细胞的ec50增加不超过50倍，其中，通过流式细胞术测定，所述靶细胞的msln表达水平比met-5a细胞(atcc crl-9444)高6至8倍。

29、7.根据项目5或6中任一项所述的多特异性抗体，其中当通过spr测量时，每种所述msln-bd结合间皮素(msln)的单价解离常数(kd)的范围为0.1至3nm，特别是范围为0.15至2nm，特别是范围为0.2至1nm。

30、8.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中每个所述msln-bd特异性结合人间皮素。

31、9.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中每个所述msln-bd与msln的i区、ii区和/或iii区结合，优选与msln的i区和/或ii区结合，特别是与msln的i区结合。

32、10.根据项目1至9中任一项所述的多特异性抗体，其中所述两个msln-bd结合msln上的相同表位。

33、11.根据项目1至4及8至10中任一项所述的多特异性抗体，其中所述msln-bd包含：

34、(i)分别为seq id no:1、2(或10)和3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，和分别为seqid no:4、5和6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；或者分别为seq id no:11、12和13的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，和分别为seq id no:14、15和16的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；和

35、(ii)vh3或vh4结构域框架序列fr1至fr4；特别是vh3结构域框架序列fr1至fr4；和

36、(iii)vl结构域，其包含vl框架，所述vl框架包含vκ框架fr1、fr2和fr3，特别是vκ1或vκ3fr1至fr3，特别是vκ1fr1至fr3，以及框架fr4，所述框架fr4选自vκfr4，和vλfr4，特别地，vλfr4包含与seq id no:132至seq id no:139中的任意一个具有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列，更特别地，vλfr4选自seq id no:132至seq id no:139中的任意一个，特别是根据seq id no:132或139的vλfr4。

37、12.根据项目1至4及8至11中任一项所述的多特异性抗体，其中所述msln-bd包含：

38、a.1)分别为seq id no:1、2(或10)和3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，

39、b.1)分别为seq id no:4、5、和6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，

40、c.1)与氨基酸序列seq id no:7至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vh序列，和

41、d.1)与氨基酸序列seq id no:9至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vl序列；

42、或

43、a.2)分别为seq id no:1、2(或10)和3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，

44、b.2)分别为seq id no:4、5、和6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，

45、c.2)与氨基酸序列seq id no:8至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vh序列，和

46、d.2)与氨基酸序列seq id no:9至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vl序列；

47、或

48、a.3)分别为seq id no:11、12、和13的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，

49、b.3)分别为seq id no:14、15、和16的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，

50、c.3)与氨基酸序列seq id no:17至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vh序列，和

51、d.3)与氨基酸序列seq id no:18至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vl序列；

52、或

53、a.4)分别为seq id no:11、12、和13的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，

54、b.4)分别为seq id no:14、15、和16的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，

55、c.4)与氨基酸序列seq id no:19至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vh序列，和

56、d.4)与氨基酸序列seq id no:21至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vl序列；

57、或

58、a.5)分别为seq id no:11、12、和13的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，

59、b.5)分别为seq id no:14、15、和16的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，

60、c.5)与氨基酸序列seq id no:20至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vh序列，和

61、d.5)与氨基酸序列seq id no:21至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vl序列；

62、或

63、a.6)分别为seq id no:11、12、和13的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，

64、b.6)分别为seq id no:14、15、和16的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，

65、c.6)与氨基酸序列seq id no:22至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vh序列，和

66、d.6)与氨基酸序列seq id no:24至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vl序列；

67、或

68、a.7)分别为seq id no:11、12、和13的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，

69、b.7)分别为seq id no:14、15、和16的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，

70、c.7)与氨基酸序列seq id no:23至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vh序列，和

71、d.7)与氨基酸序列seq id no:24至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vl序列。

72、13.根据项目5至10中任一项所述的多特异性抗体，其中所述msln-bd包含：

73、(i)分别为seq id no:25、26和27的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，和分别为seq idno:28、29和30的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；和

74、(ii)vh3或vh4结构域框架序列fr1至fr4；特别是vh3结构域框架序列fr1至fr4；和

75、(iii)vl结构域，其包含vl框架，所述vl框架包含vκ框架fr1、fr2和fr3，特别是vκ1或vκ3fr1至fr3，特别是vκ1fr1至fr3，以及框架fr4，所述框架fr4选自vκfr4，和vλfr4，特别地，vλfr4包含与seq id no:132至seq id no:139中的任意一个具有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列，更特别地，vλfr4选自seq id no:132至seq id no:139中的任意一个，特别是根据seq id no:132或139的vλfr4。

76、14.根据项目5至10及13中任一项所述的多特异性抗体，其中所述msln-bd包含：

77、a.1)分别为seq id no:25、26、和27的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，

78、b.1)分别为seq id no:28、29、和30的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，

79、c.1)与氨基酸序列seq id no:31至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vh序列，和

80、d.1)与氨基酸序列seq id no:33至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vl序列；

81、或

82、a.2)分别为seq id no:25、26、和27的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，

83、b.2)分别为seq id no:28、29、和30的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，

84、c.2)与氨基酸序列seq id no:32至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vh序列，和

85、d.2)与氨基酸序列seq id no:33至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vl序列；

86、或

87、a.3)分别为seq id no:25、26、和27的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，

88、b.3)分别为seq id no:28、29、和30的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，

89、c.3)与氨基酸序列seq id no:34至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vh序列，和

90、d.3)与氨基酸序列seq id no:36至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vl序列；

91、或

92、a.4)分别为seq id no:25、26、和27的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，

93、b.4)分别为seq id no:28、29、和30的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，

94、c.4)与氨基酸序列seq id no:35至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vh序列，和

95、d.4)与氨基酸序列seq id no:36至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的vl序列。

96、15.根据项目11至14中任一项所述的多特异性抗体，其中所述vh结构域包含c51氨基酸残基(aho编号)，且所述vl结构域包含c141氨基酸残基(aho编号)。

97、16.根据项目8至15中任一项所述的多特异性抗体，其中每个所述msln-bd均与食蟹猴msln交叉反应，特别是通过spr测量，与食蟹猴msln结合的单价kd在0.2至75nm范围内，特别是在0.3至60nm范围内，特别是0.4至50nm，特别是0.5至40nm。

98、17.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述cd3-bd与cd3ε结合。

99、18.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含一个或两个cd3-bd，特别是一个cd3-bd。

100、19.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中通过spr测量，所述cd3-bd结合cd3ε的单价kd小于50nm，特别地kd为0.5至50nm，特别地kd为1至40nm，特别地kd为2至30nm。

101、20.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述cd3-bd包括：

102、(i)分别为seq id no:45、46和47的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，位于人抗体vh框架，特别是vh3框架中；和

103、(ii)分别为seq id no:48、49、和50的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，位于人抗体vl框架中，其中vl框架包括vκ框架fr1、fr2和fr3，特别是vκ1框架，以及框架fr4，所述框架fr4选自vκfr4和vλ框架4。

104、21.根据项目20所述的多特异性抗体，其中所述cd3-bd包含：

105、(i)vh结构域，其包含seq id no:51、140、141或142的氨基酸序列；和

106、(ii)vl结构域，其包含seq id no:52的氨基酸序列。

107、22.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体还包含至少一个人血清白蛋白结合结构域(hsa-bd)，特别是一个hsa-bd。

108、23.根据项目22所述的多特异性抗体，其中所述hsa-bd包含

109、(i)分别为seq id no:53、54和55的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，位于人抗体vh框架，特别是vh3框架中；和

110、(ii)分别为seq id no:56、57、和58的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，位于人抗体vl框架中，其中vl框架包括vκ框架fr1、fr2和fr3，特别是vκ1框架，以及框架fr4，所述框架fr4选自vκfr4，特别是vκ1fr4，以及vλ框架4；

111、或

112、(i)分别为seq id no:63、64和65的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，位于人抗体vh框架，特别是vh3框架中；和

113、(ii)分别为seq id no:66、67、和68的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，位于人抗体vl框架中，其中vl框架包括vκ框架fr1、fr2和fr3，特别是vκ1框架，以及框架fr4，所述框架fr4选自vκfr4，特别是vκ1fr4，以及vλ框架4；

114、或

115、(i)分别为seq id no:63、64和65的hcdr1、hcdr2、和hcdr3序列，位于人抗体vh框架，特别是vh3框架中；和

116、(ii)分别为seq id no:66、67、和68的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，位于人抗体vl框架中，其中vl框架包括vκ框架fr1、fr2和fr3，特别是vκ1框架，以及框架fr4，所述框架fr4选自vκfr4，特别是vκ1fr4，以及vλ框架4。

117、24.根据项目22或23所述的多特异性抗体，其中所述hsa-bd包含：

118、(i)vh结构域，其包含seq id no:59的氨基酸序列，和vl结构域，其包含seq idno:60的氨基酸序列；或者

119、(ii)vh结构域，其包含seq id no:61的氨基酸序列，和vl结构域，其包含seq idno:62的氨基酸序列；或者

120、(ii)vh结构域，其包含seq id no:69的氨基酸序列，和vl结构域，其包含seq idno:70的氨基酸序列；或者

121、(iv)vh结构域，其包含seq id no:71的氨基酸序列，和vl结构域，其包含seq idno:72的氨基酸序列；或者

122、(v)vh结构域，其包含seq id no:79或143的氨基酸序列；和vl结构域，其包含seqid no:80或144的氨基酸序列；或者

123、(vi)vh结构域，其包含seq id no:81或145的氨基酸序列；和vl结构域，其包含seqid no:82或146的氨基酸序列。

124、25.根据项24所述的多特异性抗体，其中所述vh结构域包含c51氨基酸残基(aho编号)，且所述vl结构域包含c141氨基酸残基(aho编号)。

125、26.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述结合结构域独立地选自由以下组成的组：fab、fv、scfv、dsfv、scab、和stab。

126、27.根据项26所述的多特异性抗体，其中每个所述结合结构域独立地选自：

127、(a)vl结构域和vh结构域的同源对(fv片段)；或者

128、(b)由寡肽或多肽接头连接的vl结构域和vh结构域的同源对(scfv片段)。

129、28.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的形式选自由以下组成的组：串联scdb(tandab)、线性二聚体scdb(ld-scdb)、环状二聚体scdb(cd-scdb)、串联tri-scfv、三体(fab-(scfv)2)、fab-fv2、三抗体(triabody)、scdb-scfv、四抗体(tetrabody)、双-双抗体(di-diabody)、codv、串联-di-scfv、串联tri-scfv、fab-(scfv)2、fab-fv2、或与异二聚fc结构域以外的异二聚化结构域的n-和/或c-末端融合的codv、和match。

130、29.根据项目1至28中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体不包含ch1和/或cl区。

131、30.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体是scdb-scfv、三体、match，特别是其中所述多特异性抗体是match或三体形式，更特别是其中所述多特异性抗体是match形式，更特别是其中所述多特异性抗体是match3或match4。

132、31.根据项目1至30所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是单链蛋白质。

133、32.根据项31所述的多特异性抗体，其中所述单链蛋白质包含由以下组成的氨基酸序列：

134、(i)第一vl结构域，

135、(ii)第一多肽接头，

136、(iii)第一vh结构域，

137、(iv)第二多肽接头，

138、(v)第二vl结构域，

139、(vi)第三多肽接头，以及

140、(vii)第二vh结构域，

141、以所述的顺序一个接一个地排列，

142、其中所述第一vl结构域与所述第二vh结构域缔合形成第一结合结构域，且所述第二vl结构域与所述第一vh结构域缔合形成第二结合结构域，

143、并且其中所述单链蛋白质还包含

144、(viii)第三结合结构域，其由通过第四多肽接头连接的第三vl结构域和第三vh结构域形成，其中所述第三结合结构域在c-末端或n-末端通过第五多肽接头与所述氨基酸序列融合，

145、其中所述三个结合结构域具有以下特异性：

146、a)第一结合结构域特异性结合人cd3(cd3-bd)；并且

147、b)第二和第三结合结构域特异性结合间皮素(msln-bd)。

148、33.根据项目32所述的多特异性抗体，其中所述单链蛋白质还包含hsa-bd，其由通过第六多肽接头连接的第四vl结构域和第四vh结构域形成，其中所述hsa-bd在c-末端或n-末端通过第七多肽接头与所述氨基酸序列融合。

149、34.根据项目1至30所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是异源二聚体蛋白，所述异源二聚体蛋白包含第一和第二单链蛋白，其中，所述第一单链蛋白包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列由以下组成(从n末端至c末端)：

150、(ia)第一vl结构域，

151、(iia)第一多肽接头，以及

152、(iiia)第二vl结构域，并且

153、其中所述第二单链蛋白包含第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列由以下组成(从n末端至c末端)：

154、(ib)第一vh结构域，

155、(iib)第二多肽接头，以及

156、(iiib)第二vh结构域，并且

157、其中所述第一vl结构域与所述第一或所述第二vh结构域缔合形成第一结合结构域，且所述第二vl结构域与所述vh结构域中的另一个缔合形成第二结合结构域，

158、并且，其中所述第一和所述第二单链蛋白中的至少一个还包含

159、(iv)第三结合结构域，其由通过第三多肽接头连接的第三vl结构域和第三vh结构域形成，其中所述第三结合结构域通过第四多肽接头与所述第一或所述第二氨基酸序列融合，

160、并且，其中任选地，所述第一和所述第二单链蛋白中的至少一个还包含

161、(v)第四结合结构域，其由通过第五多肽接头连接的第四vl结构域和第四vh结构域形成，其中所述第四结合结构域通过第六多肽接头与所述第一或所述第二氨基酸序列融合，

162、其中所述三个或任选地四个结合结构域具有以下特异性：

163、a)一个基于抗体的结合结构域特异性结合人cd3(cd3-bd)；

164、b)另两个基于抗体的结合结构域特异性结合间皮素(msln-bd)，并且当存在任选的第四结合结构域时，

165、c)剩余的结合结构域特异性结合人血清白蛋白(hsa-bd)。

166、35.根据项目34所述的多特异性抗体，其中所述任选的第四结构域存在，并且其中所述第一和第二结合结构域之一是cd3-bd，并且所述第一和第二结合结构域中的另一个是hsa-bd。

167、36.根据项目34或35所述的多特异性抗体，其中所述任选的第四结构域存在，并且其中所述第三结合结构域与所述第一或第二氨基酸序列融合，并且所述第四结合结构域与所述两个氨基酸序列中的另一个融合。

168、37.根据项目34至36中任一项所述的多特异性抗体，其中所述异源二聚体蛋白中包含的任何结合结构域排外性地仅由排列在所述第一和第二单链蛋白中的免疫球蛋白可变结构域组成。

169、38.根据项目34至37中任一项所述的多特异性抗体，其中除了所述第一和第二vl和vh结构域之外，所述异源二聚体蛋白质不包含第一和第二蛋白质相互作用结构域的同源对，其中所述第一蛋白质相互作用结构域被包含在所述第一单链蛋白中，并且其中所述第二蛋白质相互作用结构域被包含在所述第二单链蛋白中。

170、39.根据项目34至38中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一单链蛋白和所述第二单链蛋白以平行方向异源二聚化，即，所述第一vl结构域与所述第一vh结构域缔合，并且所述第二vl结构域与所述第二vh结构域缔合。

171、40.根据项目34至38中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一单链蛋白和所述第二单链蛋白以反平行方向异源二聚化，即，所述第一vl结构域与所述第二vh结构域缔合，并且所述第二vl结构域与所述第一vh结构域缔合。

172、41.根据项目34至40中任一项所述的多特异性抗体，其中

173、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:83的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:83的氨基酸序列，尤其是由seqid no:83的氨基酸序列组成；并且

174、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:84的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:84的氨基酸序列，尤其是由seqid no:84的氨基酸序列组成；或者

175、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:85的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:85的氨基酸序列，尤其是由seqid no:85的氨基酸序列组成；并且

176、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:86的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:86的氨基酸序列，尤其是由seqid no:86的氨基酸序列组成；或者

177、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:87的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:87的氨基酸序列，尤其是由seqid no:87的氨基酸序列组成；并且

178、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:88的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:88的氨基酸序列，尤其是由seqid no:88的氨基酸序列组成；或者

179、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:89的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:89的氨基酸序列，尤其是由seqid no:89的氨基酸序列组成；并且

180、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:90的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:90的氨基酸序列，尤其是由seqid no:90的氨基酸序列组成；或者

181、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:91的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:91的氨基酸序列，尤其是由seqid no:91的氨基酸序列组成；并且

182、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:92的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:92的氨基酸序列，尤其是由seqid no:92的氨基酸序列组成；或者

183、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:93的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:93的氨基酸序列，尤其是由seqid no:93的氨基酸序列组成；并且

184、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:94的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:94的氨基酸序列，尤其是由seqid no:94的氨基酸序列组成；或者

185、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:95的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:95的氨基酸序列，尤其是由seqid no:95的氨基酸序列组成；并且

186、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:96的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:96的氨基酸序列，尤其是由seqid no:96的氨基酸序列组成；或者

187、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:97的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:97的氨基酸序列，尤其是由seqid no:97的氨基酸序列组成；并且

188、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:98的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:98的氨基酸序列，尤其是由seqid no:98的氨基酸序列组成；或者

189、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:99的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:99的氨基酸序列，尤其是由seqid no:99的氨基酸序列组成；并且

190、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:100的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:100的氨基酸序列，尤其是由seqid no:100的氨基酸序列组成；或者

191、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:101的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:101的氨基酸序列，尤其是由seqid no:101的氨基酸序列组成；并且

192、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:102的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:102的氨基酸序列，尤其是由seqid no:102的氨基酸序列组成；或者

193、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:103的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:103的氨基酸序列，尤其是由seqid no:103的氨基酸序列组成；并且

194、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:104的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:104的氨基酸序列，尤其是由seqid no:104的氨基酸序列组成；或者

195、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:105的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:105的氨基酸序列，尤其是由seqid no:105的氨基酸序列组成；并且

196、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:106的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:106的氨基酸序列，尤其是由seqid no:106的氨基酸序列组成；或者

197、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:107的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:107的氨基酸序列，尤其是由seqid no:107的氨基酸序列组成；并且

198、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:108的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:108的氨基酸序列，尤其是由seqid no:108的氨基酸序列组成；或者

199、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:109的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:109的氨基酸序列，尤其是由seqid no:109的氨基酸序列组成；并且

200、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:110的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:110的氨基酸序列，尤其是由seqid no:110的氨基酸序列组成；或者

201、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:111的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:111的氨基酸序列，尤其是由seqid no:111的氨基酸序列组成；并且

202、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:112的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:112的氨基酸序列，尤其是由seqid no:112的氨基酸序列组成；或者

203、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:113的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:113的氨基酸序列，尤其是由seqid no:113的氨基酸序列组成；并且

204、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:114的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:114的氨基酸序列，尤其是由seqid no:114的氨基酸序列组成；或者

205、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:115的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:115的氨基酸序列，尤其是由seqid no:115的氨基酸序列组成；并且

206、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:116的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:116的氨基酸序列，尤其是由seqid no:116的氨基酸序列组成；或者

207、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:117的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:117的氨基酸序列，尤其是由seqid no:117的氨基酸序列组成；并且

208、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:118的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:118的氨基酸序列，尤其是由seqid no:118的氨基酸序列组成；或者

209、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:119的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:119的氨基酸序列，尤其是由seqid no:119的氨基酸序列组成；并且

210、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:120的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:120的氨基酸序列，尤其是由seqid no:120的氨基酸序列组成；或者

211、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:121的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:121的氨基酸序列，尤其是由seqid no:121的氨基酸序列组成；并且

212、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:122的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:122的氨基酸序列，尤其是由seqid no:122的氨基酸序列组成；或者

213、所述第一单链蛋白质包含与seq id no:123的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:123的氨基酸序列，尤其是由seqid no:123的氨基酸序列组成；并且

214、所述第二单链蛋白质包含与seq id no:124的氨基酸序列具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，更特别地包含seq id no:124的氨基酸序列，尤其是由seqid no:124的氨基酸序列组成。

215、42.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体可变结构域中的至少一个包含源自亲本兔抗体的cdr区域。

216、43.根据前述项目中任一项所述的多特异性抗体，其中msln-bd中的至少一个和cd3-bd能够同时结合它们各自的抗原，特别是其中两个msln-bd和cd3-bd能够同时结合它们各自的抗原。

217、44.根据项目11至15中任一项所定义的msln结合结构域。

218、45.一种核酸序列或两种核酸序列，其编码项目1至43中任一项所述的多特异性抗体或项目44的msln结合结构域。

219、46.一种载体或两种载体，其包含项目45的所述一种核酸序列或所述两种核酸序列。

220、47.一种宿主细胞或多种宿主细胞，其包含项目46的所述一种载体或所述两种载体。

221、48.一种生产项目1至43中任一项所述的多特异性抗体或项目44的msln结合结构域的方法，包括(i)提供项目45的一种核酸序列或两种核酸序列或项目46的一种载体或两种载体，表达所述一种核酸序列或多种核酸序列或所述一种载体或多种载体，并从所述表达系统中收集所述多特异性抗体或所述msln结合结构域，或者(ii)提供根据项目47的一种宿主细胞或多种宿主细胞，培养所述一种宿主细胞或多种宿主细胞；并从细胞培养物中收集所述多特异性抗体或所述msln结合结构域。

222、49.一种药物组合物其包含项目1至43中任一项所述的多特异性抗体和药学上可接受的载体。

223、50.根据项目1至43中任一项所述的多特异性抗体，其用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自癌症、炎性疾病和自身免疫疾病的人类疾病的方法。

224、51.根据项目1至43中任一项所述的多特异性抗体，用于治疗根据项目50的疾病，其中所述疾病是癌症，特别是选自间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌的癌症。

225、52.一种用于治疗疾病，特别是人类疾病，更特别是选自癌症、炎性疾病和自身免疫疾病的人类疾病的方法，包括施用项目1至43中任一项所述的多特异性抗体的步骤。

226、53.根据项目52所述的方法，其中所述疾病是癌症，特别是选自间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌的癌症。