一株魏氏梭菌噬菌体PM11、其噬菌体组合物及其应用的制作方法

本发明涉及微生物，尤其涉及一株魏氏梭菌噬菌体pm11、其噬菌体组合物及其应用。

背景技术：

1、随着集约化养禽产业的迅速发展，细菌性疾病日益成为危害养禽业发展的首要疾病。而细菌性腹泻是危害养禽业重要的细菌性疾病，它不但影响蛋禽的产蛋量、肉禽的增重，严重的可导致禽群死亡，给养殖业造成严重的经济损失。引起禽发生腹泻的细菌性疾病包括禽大肠杆菌病、禽沙门氏菌病以及禽魏氏梭菌病等。

2、魏氏梭菌病又称产气荚膜菌病，是常见的一种急性致死性腹泻病，其发病率和死亡率均高，造成严重的经济损失。据统计，在全球范围内，由魏氏梭菌造成的经济损失约20亿美元/年。魏氏梭菌广泛分布于自然界，在土壤、污水、食物、粪便中均有生长，在动物体内能形成夹馍，具有强抵抗力。家禽感染a型和c型产气荚膜梭菌易患禽坏死性肠炎，临床症状表现为精神沉郁、眼闭合，采食量下降、腹泻，增重率下降，甚至排红褐色粪便或黑褐色焦油样粪便，严重影响动物的生长和健康，给养殖主带来较大的经济损失。

3、禽大肠杆菌病是由某些致病性或条件致病性大肠杆菌引起的禽类不同种类疾病的总称，是危害养禽业最为严重的细菌性疾病之一。该病可以感染各个日龄的鸡、鸭以及火鸡等多种类型的禽，但雏鸡较成年鸡易感，肉鸡较蛋鸡易感。呼吸道、消化道以及交配均可成为该病的传播途径，但消化道为主。发病禽类临床症状主要由食欲减退、精神沉郁、羽毛蓬乱、走路摇摆、跛行以及消瘦等，当侵害消化道时，会出现腹泻或排绿色粪便等症状。

4、禽沙门氏菌病是由沙门氏菌属种的一种沙门氏菌所引起的禽类的急性或慢性疾病的总称，分为鸡白痢、禽伤寒和禽副伤寒。鸡是家禽沙门氏菌最大的宿主，鸡群爆发死亡率最高可达80％；其中最为常见的是鸡白痢，鸡白痢是雏鸡的一种急性、败血性传染病。2周龄以内的雏鸡发病率和死亡率都很高，成年鸡感染沙门菌则多表现为慢性症状。但这些定植在禽肠道中的非伤寒沙门菌常以蛋和禽肉制品为主要传播媒介，是引发人食源性疾病的首要病原菌。禽感染沙门氏菌后不仅会降低其生产性能，甚至导致自身死亡或带入卵中，给养殖产业增加生产成本等等。

5、由于目前临床上抗生素滥用导致细菌的耐药性严重，造成抗生素对家禽细菌性腹泻防治难度增大，且根据我国饲料添加剂禁止添加抗生素的政策的实施，导致家禽腹泻疾病日益严重。噬菌体是一种新型安全无残留的新型抑菌生物制剂，对耐药细菌具体同样的杀灭效果，具有很好的应用前景。

6、但是目前，可高效防治魏氏梭菌病的魏氏梭菌噬菌体少且单一，极大的制约了其应用范围，还需要继续研发繁殖速度快、裂解谱宽的魏氏梭菌噬菌体；同时，还需继续研发具有更广应用范围、裂解谱更宽、利用各噬菌体的优势互补的噬菌体组合物，以更好的防治由多种不同细菌病原菌引发的禽细菌性腹泻类疾病。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了一种魏氏梭菌噬菌体pm11以及基于鸡尾酒噬菌体防控方法建立的具有宽裂解谱、强裂解作用的一种包括魏氏梭菌噬菌体pm11的噬菌体组合物，所述魏氏梭菌噬菌体 pm11可高效裂解魏氏梭菌，而所述噬菌体组合物可有效防控禽大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌等多种致病菌引起的腹泻；同时，所述魏氏梭菌噬菌体pm11及其噬菌体组合物还可用于制备药物制剂、禽类饲料添加剂、环境消毒剂、试剂盒等。

2、为了解决上述问题，本发明的技术方案具体如下：

3、第一方面，本发明提供一种用于防控禽细菌性腹泻的魏氏梭菌噬菌体pm11，保藏号为cgmcc no.22372，该噬菌体于2021年4月12日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号）。在电子显微镜下观察到，该噬菌体pm11的形态，其呈头部呈多面体结构，头部直径约44nm，具有6个短尾丝，属短尾噬菌体。

4、本发明还提供一种用于防控家禽细菌性腹泻的大肠杆菌噬菌体pd205，保藏号为cgmcc no.22361，于2021年4月12日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号）。本发明在电子显微镜下观察到噬菌体pd205的形态为：其具有呈多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部宽80-87nm，长113-120nm，尾长107-113nm，属肌尾噬菌体。

5、本发明还提供一种用于防控禽细菌性腹泻的沙门氏菌噬菌体pc192，其保藏号为cgmcc no.22367，于2021年4月12日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号）。在电子显微镜下观察了噬菌体pc192的形态，噬菌体具有呈多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部宽60-67nm，长 60-67nm，尾长167-200nm，属长尾噬菌体。

6、经噬菌体全基因组分析，得到：噬菌体pd205、pc192、pm11的全基因组大小分别为168652bp、 39095bp和109054bp，其中噬菌体pd205基因组g+c含量为37.60％，含有269个开放阅读框(orfs)，噬菌体pc192基因组g+c含量为48.29％，含有47个开放阅读框(orfs)，噬菌体pm11基因组 g+c含量为39.09％，含有183个开放阅读框(orfs)。噬菌体pd205、pc192和pm11不含耐药基因及毒力基因，不含溶原性相关基因。

7、第二方面，本发明提供一种噬菌体组合物，其包括前述的魏氏梭菌噬菌体pm11和其他噬菌体。

8、或者，提供一种噬菌体组合物，包括前述的大肠杆菌噬菌体pd205和其他噬菌体。

9、或者，提供另一种噬菌体组合物，其包括前述的沙门氏菌噬菌体pc192和其他噬菌体。

10、第三方面，本发明提供一种用于防控禽细菌性腹泻的噬菌体组合物，其包括如上所述的大肠杆菌噬菌体pd205、沙门氏菌噬菌体pc192和魏氏梭菌噬菌pm11。

11、可选地，大肠杆菌噬菌体与沙门氏菌噬菌体与魏氏梭菌噬菌体的活体数量之比为1:1:1；每种噬菌体的的含量不低于1×108pfu/ml。

12、本技术中，魏氏梭菌噬菌体pm11包括进行点突变或缺失突变或添加突变的同源性高于98％或99％的杀菌活性相同的突变株。由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，上述噬菌体的突变体也在本技术请求保护的范围内。pm11的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状极度相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。大肠杆菌噬菌体pd205和沙门氏菌噬菌体pc192也分别包括进行点突变或缺失突变或添加突变的同源性高于98％或99％的杀菌活性相同的突变株，解释同魏氏梭菌噬菌体pm11。

13、第四方面，本发明还提供上述魏氏梭菌噬菌体pm11或上述噬菌体组合物在制备预防和治疗禽细菌性腹泻药物、环境消毒剂、饲料添加剂、检测试剂盒中的应用。中的应用。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

14、所述禽细菌性腹泻包括由魏氏梭菌引发的魏氏梭菌病或由魏氏梭菌和其他病原菌(如大肠杆菌和沙门氏菌)共同感染导致的禽类腹泻类疾病。所述禽细菌性腹泻包括禽坏死性肠炎、沙门氏菌引起的腹泻、大肠杆菌感染引起的肠炎或混合感染导致的其它类型的肠炎。

15、此外，本发明还提供上述大肠杆菌噬菌体pd205或含该噬菌体的组合物在制备预防和治疗禽细菌性腹泻药物、环境消毒剂、饮用水添加剂以及试剂盒中的应用。

16、本发明也提供沙门氏菌噬菌体pc192或含有该噬菌体的噬菌体组合物在制备预防和治疗禽细菌性腹泻药物、环境消毒剂、饮用水添加剂以及试剂盒中的应用。

17、第五方面，本发明提供一种噬菌体药物制剂，该制剂的活性成分包括前述的魏氏梭菌噬菌体pm11 或前述的噬菌体组合物；优选的，所述噬菌体组合物包括大肠杆菌噬菌体pd205、沙门氏菌噬菌体 pc192和魏氏梭菌噬菌pm11。

18、所述噬菌体药物制剂还包括辅料；所述辅料为sm缓冲液、海藻酸钠、蔗糖、麦芽糖糊精、葡萄糖中的一种或多种。优选的，所述噬菌体药物制剂还包括不同种类细菌的特定病原菌的噬菌体。

19、其他方案中提供的噬菌体药物制剂中，其活性成分包括前述的大肠杆菌噬菌体pd205或含该噬菌体的组合物；或者活性成分包括沙门氏菌噬菌体pc192或含有该噬菌体的噬菌体组合物。

20、具体地，所述噬菌体药物制剂的剂型为粉剂、水剂、冻干剂、胶囊剂、气雾剂、丸剂或片剂。

21、所述药物制剂的应用方法为：将药物制剂添加到患有细菌性腹泻的禽饮水中，或对禽类体表灌服、肌肉注射，或添加到饲料中的方式，其中优选的使用饮水方式预防及治疗禽细菌性腹泻，降低禽腹泻率，提高禽的存活率，提高蛋其产蛋率以及料肉比等。所述禽包括鸡、鸭、鹅等。

22、经实验验证，在感染大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌引起腹泻的7日龄雏鸡中，使用5×109pfu/ml 的噬菌体组合物进行饮用水混拌饲喂，连用3天。在14天内可以有效降低患病雏鸡的90％左右的腹泻率。

23、第六方面，本发明还提供一种环境消毒剂，其有效成分包括魏氏梭菌噬菌体pm11、大肠杆菌噬菌体pd205、沙门氏菌噬菌体pc192或这三株噬菌体中至少两株组合的噬菌体组合物；优选的，环境消毒剂的有效成分包括魏氏梭菌噬菌体pm11、大肠杆菌噬菌体pd205、沙门氏菌噬菌体pc192这三株噬菌体；进一步优选地，每种噬菌体的浓度为5×108pfu/ml以上。优选地，还包含其他用于抑制或消灭环境中细菌的其他活性成分，以提高其灭菌或抑菌效果；还可包括其他助剂，如能延长噬菌体持效期的助剂。

24、上述消毒剂的应用方法为：将消毒剂在鸭屠宰场、鸭产品加工车间及器具、鸭养殖环境中使用，防止环境中魏氏梭菌或魏氏梭菌和其他病原菌的污染。所述养殖环境包括棚舍、料槽、地面、墙壁、粪便和垫料等。包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、养殖业设施、饲养器具或其他环境表面进行消毒去污，并对饲料进行消毒防腐，这种消毒剂可用于代替抗生素或传统消毒产品，而且其对人体及家禽不会造成损害。

25、第七方面，本发明还提供一种饲料添加剂或饮用水添加剂，用于预防家禽细菌性腹泻，其活性成分包括魏氏梭菌噬菌体pm11、或大肠杆菌噬菌体pd205、或沙门氏菌噬菌体pc192、或这三株噬菌体中至少两株组合的噬菌体组合物；优选的，添加剂的有效成分包括魏氏梭菌噬菌体pm11、大肠杆菌噬菌体pd205、沙门氏菌噬菌体pc192这三株噬菌体；饮用水中每种噬菌体的浓度至少为 1×108pfu/g。

26、第八方面，本发明还提供一种检测试剂盒，包括前述的魏氏梭菌噬菌体pm11、大肠杆菌噬菌体 pd205、沙门氏菌噬菌体pc192中的一种或多种。本技术提供的三株噬菌体的裂解特异性强，可利用噬菌体制备检测对应的宿主菌检测试剂盒，用于检测其特异侵染的魏氏梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌或用于防控由其宿主菌侵染导致的疾病。

27、本发明实施例提供的噬菌体组合物及其应用具有以下有益效果：

28、1、本发明提供了三株自行分离的具有优异裂解性能的魏氏梭菌噬菌体pm11、大肠杆菌噬菌体 pd205和沙门氏菌噬菌体pc192，并提供了基于这三种噬菌体的复配形成的用于防控禽细菌性腹泻的噬菌体组合物，该组合物通过大肠杆菌噬菌体pd205、沙门氏菌噬菌体pc192和魏氏梭菌噬菌体pm11 组合作为有效预防及治疗禽细菌性腹泻的活性成分，也可以作为环境消毒剂，有效控制养殖环境被污染；与单一裂解性噬菌体相比，具有宽裂解谱的特点，扩宽了杀菌范围，提高杀菌活性，可有效防控家禽大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌引起的腹泻；同时，可提高蛋鸡产蛋率、提高肉鸡料肉比以及增强鸡体免疫力，降低因细菌性腹泻引起的死亡率。

29、2、本发明涉及的噬菌体组合物均从自然界中获得，来源广，数量庞大，易分离，属于天然生物。经雏鸡安全性试验证明安全、无残留、没有毒副作用，不会影响雏鸡体内正常菌群。因此，以裂解性大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体以及魏氏梭菌噬菌体为主要成分的噬菌体组合物具有特异性高、不良反应小、不易产生抗药性、无残留且成本低等优点，为防控禽细菌性腹泻提供了一种绿色新型生物制剂。

30、3、本发明设计的噬菌体组合物应用广泛，不仅可用于养殖过程中，可特异、高效、快速安全杀灭致病性大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌乃至耐药性菌株引起的腹泻，有效降低雏鸡的腹泻率以及发病鸡只的死亡率；还可以用于环境消毒剂，防控大肠杆菌、沙门氏菌及魏氏梭菌的传播、增殖；还可用于生物抑菌剂，用于禽类产品的消毒，抑制产品加工以及保鲜过程中致病菌株乃至耐药菌株的生长。