缀合的铁调素模拟物的制作方法

本发明尤其涉及某些铁调素肽类似物，包含肽单体和肽二聚体两者，以及其缀合物和衍生物，以及包括肽类似物的组合物，并且涉及肽类似物用于治疗和/或预防各种疾病、病状或病症的用途，包含治疗和/或预防红细胞增多，如真性红细胞增多症、铁超负荷疾病，如遗传性血色素沉着症、铁负荷性贫血以及本文所描述的其它病状和病症。

背景技术：

1、铁调素(也被称为leap-1)，一种由肝产生的肽激素，是人和其它哺乳动物的铁稳态调节剂。铁调素通过与其受体，即铁出口通道铁转运蛋白结合从而引起其内化和降解而起作用。人铁调素是25-氨基酸肽(hep25)。参见krause等人(2000)《欧洲生化学会联合会快报(febs lett)》480:147-150和park等人(2001)《生物化学杂志(j biol chem)》276:7806-7810。铁调素的生物活性25-氨基酸形式的结构是简单的发夹，其具有8个半胱氨酸，形成4个二硫键，如jordan等人《生物化学杂志》284:24155-67所描述。铁调节功能需要n端区，并且5个n端氨基酸残基的缺失引起铁调节功能的丢失。参见nemeth等人(2006)《血液(blood)》107:328-33。

2、铁调素活性异常与铁超负荷疾病相关，包含遗传性血色素沉着症(hh)和铁负荷性贫血。遗传性血色素沉着症是遗传性铁超负荷疾病，其主要由铁调素缺乏引起，或者在一些情况下由铁调素抗性引起。这允许过量吸收饮食中的铁并发展铁超负荷。hh的临床表现可以包含肝病(例如，肝硬化nash和肝细胞癌)、糖尿病和心力衰竭。目前，hh的唯一治疗方法是常规的静脉切开术，这对于患者来说负担沉重。铁负荷性贫血是遗传性贫血，其具有无效性红细胞生成，如β-地中海贫血，其伴有严重的铁超负荷。铁超负荷引起的并发症是这些患者发病和死亡的主要原因。铁调素缺乏是非输血患者的铁超负荷的主要原因，并且导致输血患者的铁超负荷。目前对这些患者的铁超负荷的治疗是铁螯合，其非常繁重，有时无效，并且伴有频繁的副作用。

3、铁调素具有限制其用作药物的若干限制，包含部分由于折叠期间的蛋白质聚集和沉淀而难以合成的过程，这进而导致低生物利用度、注射部位反应、免疫原性和高商品成本。本领域需要的是具有铁调素活性并且还具有其它有益的物理性质，如改善的溶解度、稳定性和/或效力的化合物，使得可负担地生产铁调素样化合物，并且用于治疗与铁调素相关的疾病和病症，例如本文所述的那些疾病和病症。

4、本发明解决了此类需求，提供了新型肽类似物，包含肽单体类似物和肽二聚体类似物，其具有铁调素活性，并且还具有使本发明的肽适合于替代铁调素的其它有益性质。

技术实现思路

1、本发明总体上涉及表现出铁调素活性的肽类似物，包含单体和二聚体两者，以及使用所述肽类似物的方法。

2、一方面，本发明包含包括式(i)肽的铁调素类似物：

3、r1-x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-x9-x10-x11-x12-x13-x14-r2(ia)

4、或其药学上可接受的盐或溶剂化物，

5、其中：

6、r1为氢、c1-c6烷基、c6-c12芳基、c6-c12芳基-c1-c6烷基、c1-c20烷酰基或c1-c20环烷酰基；

7、r2为nh2、经取代的氨基、oh或经取代的羟基；

8、x1不存在，或者为asp、isoasp、asp(ome)、glu、gluome、bhglu、bglu、gly、n取代的gly、gla、glp、ala、arg、dab、leu、lys、dap、orn、(d)asp、(d)arg、tet1、或tet2、lys、经取代的lys、(d)lys或经取代的(d)lys；

9、x2为ala、thr、gly、n取代的gly或ser；

10、x3为ala、gly、n取代的gly、his或经取代的his；

11、x4为ala、phe、dpa、gly、n取代的gly、bhphe、a-mephe、nme-phe、d-phe或2pal；

12、x5为pro、d-pro、bhpro、d-bhpro、npc、d-npc、gaba、2-吡咯烷丙酸(ppa)、2-吡咯烷丁酸(pba)、glu、lys、经取代的lys、(d)lys或经取代的(d)lys；

13、x6不存在，或者为除cys、(d)cys、amecys、hcys或pen之外的任何氨基酸；

14、x7不存在，或者为ala、gly、n取代的gly、ile、val、leu、nleu、lys、经取代的lys、(d)lys或经取代的(d)lys；

15、x8不存在，或者为ala、(d)ala、ile、gly、n取代的gly、glu、val、leu、nleu、phe、bhphe、lys、经取代的lys、(d)lys、经取代的(d)lys、amelys或123三唑；

16、x9不存在，或者为ala、ile、gly、n取代的gly、val、leu、nleu、phe、bhphe、lys、经取代的lys、(d)lys或经取代的(d)lys；

17、x10不存在，或者为ala、gly、n取代的gly、ile、phe、bhphe、lys、经取代的lys、(d)lys或经取代的(d)lys；

18、x11不存在，或者为ala、pro、bhphe、lys、经取代的lys或(d)lys；

19、并且

20、x12-x14中的每一个不存在或者独立地为任何氨基酸；

21、前提是：

22、i)所述肽可以进一步在任何氨基酸处缀合；

23、ii)所述肽的氨基酸中的任何氨基酸可为所述氨基酸的对应(d)-氨基酸，或者可为n取代的；并且

24、iii)所述肽是线性肽或者是环化内酰胺；并且

25、其中dapa为二氨基丙酸；dpa或dip为3,3-二苯基丙氨酸或b,b-二苯基丙氨酸；bhphe为b-高苯丙氨酸；bip为联苯基丙氨酸；bhpro为b-高脯氨酸；tic为l-1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-甲酸；npc为l-六氢烟碱酸；bhtrp为b-高色氨酸；1-nal为1-萘基丙氨酸；2-nal为2-萘基丙氨酸；orn为鸟苷酸；nleu为正亮氨酸；2pal为2-吡啶基丙氨酸；ppa为2-(r)-吡咯烷丙酸；pba为2-(r)-吡咯烷丁酸；经取代的phe为苯丙氨酸，其中苯基被f、cl、br、i、oh、甲氧基、二甲氧基、二氯、二甲基、二氟、五氟、烯丙氧基、叠氮基、硝基、4-氨基甲酰基-2,6-二甲基、三氟甲氧基、三氟甲基、苯氧基、苄氧基、氨基甲酰基、t-bu、羧基、cn或胍取代；经取代的bhphe为b-高苯丙氨酸，其中苯基被f、cl、br、i、oh、甲氧基、二甲氧基、二氯、二甲基、二氟、五氟、烯丙氧基、叠氮基、硝基、4-氨基甲酰基-2,6-二甲基、三氟甲氧基、三氟甲基、苯氧基、苄氧基、氨基甲酰基、t-bu、羧基、cn或胍取代；经取代的trp为n-甲基-l-色氨酸、a-甲基色氨酸或被f、cl、oh或t-bu取代的色氨酸；经取代的bhtrp为n-甲基-l-b-高色氨酸、a-甲基-b-高色氨酸或被f、cl、oh或t-bu取代的b-高色氨酸；tet1为(s)-(2-氨基)-3-(2h-四唑-5-基)丙酸；并且tet2为(s)-(2-氨基)-4-(1h-四唑-5-基)丁酸；

26、123三唑为并且

27、dab为

28、一方面，本发明包含包括式(i)肽的铁调素类似物：

29、r1-x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-x9-x10-x11-x12-x13-x14-r2(ib)

30、或其药学上可接受的盐或溶剂化物，

31、其中：

32、r1为氢、c1-c6烷基、c6-c12芳基、c6-c12芳基-c1-c6烷基、c1-c20烷酰基或c1-c20环烷酰基；

33、r2为nh2、经取代的氨基、oh或经取代的羟基；

34、x1不存在，或者为asp、isoasp、asp(ome)、glu、bhglu、bglu、gly、n取代的gly、gla、glp、ala、arg、leu、lys、dap、orn、(d)asp、(d)arg、tet1或tet2；

35、x2为ala、thr、gly、n取代的gly或ser；

36、x3为ala、gly、n取代的gly、his或经取代的his；

37、x4为phe、dpa、gly、n取代的gly、bhphe、a-mephe、nme-phe、d-phe或2pal；

38、x5为pro、d-pro、bhpro、d-bhpro、npc、d-npc、gaba、2-吡咯烷丙酸(ppa)或2-吡咯烷丁酸(pba)；

39、x6不存在，或者为除cys、(d)cys、amecys、hcys或pen之外的任何氨基酸；

40、x7不存在，或者为ala、gly、n取代的gly、ile、val、leu、nleu、lys、经取代的lys、(d)lys或经取代的(d)lys；

41、x8不存在，或者为ala、(d)ala、ile、gly、n取代的gly、glu、val、leu、nleu、phe、bhphe、lys、经取代的lys、(d)lys、经取代的(d)lys或amelys；

42、x9不存在，或者为ala、ile、gly、n取代的gly、val、leu、nleu、phe、bhphe、lys、经取代的lys、(d)lys或经取代的(d)lys；

43、x10不存在，或者为ala、gly、n取代的gly、ile、phe、bhphe、lys、经取代的lys、(d)lys或经取代的(d)lys；

44、x11不存在，或者为ala、pro、bhphe、lys、经取代的lys或(d)lys；

45、并且

46、每个x12-x14不存在或者独立地为任何氨基酸；

47、前提是

48、i)所述肽不包括二硫键或硫醚键；ii)所述肽可以进一步在任何氨基酸处缀合；iii)所述肽的氨基酸中的任何氨基酸可以是所述氨基酸的对应(d)-氨基酸，或者可以是n取代的；其中dapa为二氨基丙酸；dpa或dip为3,3-二苯基丙氨酸或b,b-二苯基丙氨酸；bhphe为b-高苯丙氨酸；bip为联苯基丙氨酸；bhpro为b-高脯氨酸；tic为l-1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-甲酸；npc为l-六氢烟碱酸；bhtrp为b-高色氨酸；1-nal为1-萘基丙氨酸；2-nal为2-萘基丙氨酸；orn为鸟苷酸；nleu为正亮氨酸；2pal为2-吡啶基丙氨酸；ppa为2-(r)-吡咯烷丙酸；pba为2-(r)-吡咯烷丁酸；经取代的phe为苯丙氨酸，其中苯基被f、cl、br、i、oh、甲氧基、二甲氧基、二氯、二甲基、二氟、五氟、烯丙氧基、叠氮基、硝基、4-氨基甲酰基-2,6-二甲基、三氟甲氧基、三氟甲基、苯氧基、苄氧基、氨基甲酰基、t-bu、羧基、cn或胍取代；经取代的bhphe为b-高苯丙氨酸，其中苯基被f、cl、br、i、oh、甲氧基、二甲氧基、二氯、二甲基、二氟、五氟、烯丙氧基、叠氮基、硝基、4-氨基甲酰基-2,6-二甲基、三氟甲氧基、三氟甲基、苯氧基、苄氧基、氨基甲酰基、t-bu、羧基、cn或胍取代；经取代的trp为n-甲基-l-色氨酸、a-甲基色氨酸或被f、cl、oh或t-bu取代的色氨酸；经取代的bhtrp为n-甲基-l-b-高色氨酸、a-甲基-b-高色氨酸或被f、cl、oh或t-bu取代的b-高色氨酸；tet1为(s)-(2-氨基)-3-(2h-四唑-5-基)丙酸；并且

49、tet2为(s)-(2-氨基)-4-(1h-四唑-5-基)丁酸。

50、在一个实施例中，x1为glu，x2为thr，x4为dpa，或者x5为pro。

51、另一方面，本发明包含包括式(ii)肽的铁调素类似物：

52、r1-glu-thr-x3-[dpa]-pro-x6-x7-x8-x9-x10-x11-x12-x13-x14-r2   (ii)

53、或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中r1、r2、x3、x6-x14如针对式(i)所描述。

54、另一方面，本发明包含包括式(ixa)肽的铁调素类似物：

55、r1-glu-thr-his-[dpa]-pro-ala-ile-[(d)lys]-[bhphe]-[lys(ahx_palm)]-x11-x12-x13-x14-r2  (ixa)；

56、或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中r1、r2以及x11-x14如针对式(i)所描述。

57、另一方面，本发明包含包括式(xxi)肽的铁调素类似物：

58、r1-glu-thr-his-[dpa]-pro-x6-x7-x8-x9-x10-x11-x12-x13-x14-r2  (xxi)，

59、其中r1、r2以及x10-x14如针对式(i)所描述；

60、x6不存在，为ala或经取代的lys；x7不存在，为ile、经取代的lys或经取代的(d)lys；x9不存在或为bhphe；

61、并且x8为lys(l1z)或(d)lys(l1z)，其中l1为接头，并且z为半衰期延长部分。

62、在一个实施例中，r1为iva或异戊酸。

63、在一个实施例中，r2为nh2。在一个实施例中，r2为oh。

64、在本发明的铁调素类似物中的任一种的特定实施例中，所述经取代的lys或经取代的(d)lys是直接地或通过接头被选自以下的酸取代的lys或(d)lys：c12(月桂酸)、c14(肉豆蔻酸)、c16(棕榈酸)、c18(硬脂酸)、c20、c12二酸、c14二酸、c16二酸、c18二酸、c20二酸、生物素和异戊酸，或其残基。在一个实施例中，所述接头是ahx、peg或peg-ahx。

65、在本发明的铁调素类似物中的任一种的特定实施例中，x8或x10为lys或被l1z取代的(d)lys；其中l1不存在，为dapa、d-dapa、或isoglu、peg、ahx、isoglu-peg、peg-isoglu、peg-ahx、isoglu-ahx或isoglu-peg-ahx；ahx为氨基己酸部分；peg为-[c(o)-ch2-(peg)n-n(h)]m-或-[c(o)-ch2-ch2-(peg)n-n(h)]m-；并且peg为-och2ch2-，m为1、2或3；并且n为1-100k之间的整数；并且z为半衰期延长部分。在一个实施例中，所述半衰期延长部分为c10-c21烷酰基。

66、在某些实施例中，本发明的肽类似物或二聚体包括与n端x1残基缀合的异戊酸部分。在某些实施例中，本发明的肽类似物或二聚体包括与n端asp残基缀合的异戊酸部分。在某些实施例中，本发明的肽类似物或二聚体包括与n端glu残基缀合的异戊酸部分。

67、在某些实施例中，本发明的肽类似物包括酰胺化的c端残基。

68、在一相关实施例中，本发明包含编码本发明的铁调素类似物或二聚体(或二聚体的单体亚基)的肽的多核苷酸。

69、在一另外的相关实施例中，本发明包含包括本发明的多核苷酸的载体。在特定实施例中，所述载体是包括启动子的表达载体，所述启动子例如以促进所述多核苷酸的表达的方式与所述多核苷酸可操作地连接。

70、在另一个实施例中，本发明包含药物组合物，所述药物组合物包括本发明的铁调素类似物、二聚体、多核苷酸或载体，以及药学上可接受的载体、赋形剂或媒剂。

71、在另一个实施例中，本发明提供了一种结合铁转运蛋白或诱导铁转运蛋白内化和降解的方法，所述方法包括使所述铁转运蛋白与本发明的至少一种铁调素类似物、二聚体或组合物接触。

72、在另外的实施例中，本发明包含一种用于治疗有需要的受试者的铁代谢疾病的方法，所述方法包括向所述受试者提供有效量的本发明的铁调素类似物或药物组合物。在某些实施例中，所述铁调素类似物或药物组合物通过口服、静脉内、腹膜、皮内、皮下、肌肉内、鞘内、吸入、气化、雾化、舌下、口腔、肠胃外、直肠、阴道或局部施用途径向所述受试者提供。在某些实施例中，所述铁调素类似物或药物组合物通过口服或皮下施用途径向所述受试者提供。在某些实施例中，所述铁代谢疾病是铁超负荷疾病。在某些实施例中，所述铁调素类似物或药物组合物至多或约每天两次、至多或约每天一次、至多或约每两天一次、至多或约每周一次或者至多或约每月一次向所述受试者提供。在特定实施例中，所述铁调素类似物以约1mg至约100mg或约1mg至约5mg的剂量向所述受试者提供。

73、在另一个实施例中，本发明提供了包括本发明的铁调素类似物或药物组合物的装置，所述装置用于向受试者任选地口服或皮下递送本发明的铁调素类似物或二聚体。

74、在又另一个实施例中，本发明包含试剂盒，所述试剂盒包括本发明的铁调素类似物或药物组合物，所述试剂盒与试剂、装置或说明材料或其组合一起包装。