用于肿瘤学诊断的无细胞核酸和单细胞组合分析的制作方法

用于肿瘤学诊断的无细胞核酸和单细胞组合分析
1.相关申请
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求2020年11月17日提交的美国临时专利申请系列第63/114,851号的权益，该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
3.背景
4.领域
5.本公开内容总体上涉及患者中的癌症的鉴定，并更具体地涉及对从患者获得的测试样品进行测定，以及分析测定结果。
6.对相关技术的描述
7.癌症可以由个体的正常细胞内的遗传变异的积累引起，这些遗传变异中的至少一些导致不当调控的细胞分裂。这样的变异通常包括拷贝数变异(cnv)、单核苷酸变异(snv)、基因融合、插入和/或缺失(插入缺失(indel))，表观遗传变异包括胞嘧啶的5-甲基化(5-甲基胞嘧啶)以及dna与染色质和转录因子的缔合。癌症通常通过对肿瘤进行活检，然后分析细胞、标志物或从细胞中提取的dna来检测。但最近已提出癌症也可以从体液诸如血液或尿液中的无细胞核酸来检测。这样的测试具有的优点在于它们是非侵入性的，并且可以在无需在活检中鉴定疑似癌细胞的情况下进行。使用下一代测序(ngs)分析循环无细胞核苷酸，诸如无细胞dna(cfdna)或无细胞rna(cfrna)被认为是用于检测和诊断癌症的有价值的工具。与传统的肿瘤活检方法相比，分析cfdna可以是有利的；然而，在肿瘤来源的cfdna中鉴定癌症指示信号面临着独特的挑战，特别是对于诸如癌症指示信号尚不明显的癌症的早期检测的目的。作为一个实例，可能难以实现肿瘤来源片段的必需测序深度。作为另一实例，在样品制备和测序期间引入的误差可能使准确鉴定癌症指示信号变得困难。这些不同挑战的组合阻碍了通过使用从受试者获得的cfdna以足够的灵敏度和特异性准确预测受试者的癌症特征。对增加液体活检测定的灵敏度和/或特异性的系统和方法存在需求。
8.概述
9.本文的公开内容包括鉴定受试者中癌症的存在的方法。在一些实施方案中，方法包括：从源自受试者的生物样品分离免疫细胞、白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从源自受试者的生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的免疫细胞、白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自序列读段的一种或更多种特性的值，其中一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于一种或更多种特性的值产生预测评分；当预测评分大于预定截止值时，鉴定受试者中癌症的存在。方法可以包括：从生物样品分离白细胞和ctc，任选地分离ctc包括捕获表达上皮细胞黏附分子(epcam)的细胞；以及从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生序列读段。
10.本文的公开内容包括检测正在接受癌症治疗的受试者中的微小残留病(mrd)的方法。在一些实施方案中，方法包括：从源自受试者的生物样品分离免疫细胞、白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从源自受试者的生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一
个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的免疫细胞、白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自序列读段的一种或更多种特性的值，其中一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于一种或更多种特性的值产生mrd评分；以及当mrd评分大于预定截止值时，检测到受试者中的mrd。方法可以包括：从生物样品分离白细胞和ctc，任选地分离ctc包括捕获表达上皮细胞黏附分子(epcam)的细胞；以及从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生序列读段。
11.本文的公开内容包括在患有癌症的受试者中监测治疗性干预的效力的方法。在一些实施方案中，方法包括：从分别在第一时间点和第二时间点源自受试者的第一生物样品和第二生物样品分离免疫细胞、白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从分别在第一时间点和第二时间点源自受试者的第一生物样品和第二生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的免疫细胞、白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自序列读段的一种或更多种特性的值，其中一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于在第一时间点和第二时间点的一种或更多种特性的值产生效力评分；当效力评分低于预定截止值时，鉴定治疗性干预为有效。方法可以包括：从生物样品分离白细胞和ctc，任选地分离ctc包括捕获表达上皮细胞黏附分子(epcam)的细胞；以及从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生序列读段。
12.在一些实施方案中，生物样品包括血液样品，并且其中从源自受试者的生物样品分离白细胞和cfna包括：对血液样品进行密度梯度离心；从血液样品的血浆和/或血清级分获得cfna；以及从血液样品的血沉棕黄层(buffy coat)级分获得完整的白细胞。在一些实施方案中，从生物样品分离ctc在进行密度梯度离心之前进行。在一些实施方案中，白细胞包括外周血单个核细胞(pbmc)(例如，包括b细胞和t细胞)。方法可以包括：在从对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段之前，富集白细胞的一种或更多种细胞类型。在一些实施方案中，一种或更多种细胞类型包括b细胞和/或t细胞。
13.方法可以包括：将白细胞和/或ctc中的每一个细胞分区至多于一个分区。在一些实施方案中，多于一个分区包括多于一个液滴或微孔阵列的微孔。在一些实施方案中，白细胞和/或ctc中的每一个细胞包含多于一个核酸靶分子(例如，核糖核酸(rna)、信使rna(mrna)、微rna、小干扰rna(sirna)、rna降解产物、各自包含多(a)尾的rna及其任何组合)。在一些实施方案中，对多于一个分离的白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定包括：使用多于一个随机条形码对核酸靶分子进行随机条形码化以产生多于一个随机条形码化靶核酸分子，其中多于一个随机条形码中的每一个包含细胞标记和分子标记，其中多于一个随机条形码中的至少两个随机条形码的分子标记包含不同的分子标记序列，其中与同一细胞关联的随机条形码包含相同的细胞标记，并且其中与不同细胞关联的细胞标记包含不同的细胞标记。
14.在一些实施方案中，cfna包含循环肿瘤核酸(ctna)。在一些实施方案中，cfna包含无细胞dna(cfdna)和/或无细胞rna(cfrna)。在一些实施方案中，cfdna包括单链cfdna和双链cfdna。在一些实施方案中，cfna包含至少两种形式的选自由双链cfdna、单链cfdna和单链cfrna组成的组的核酸。在一些实施方案中，从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产
生序列读段包括：(a)将至少一种形式的核酸与至少一种标签核酸连接以将这些形式彼此区分；以及(b)扩增与至少一种核酸标签连接的至少一种形式的核酸，其中核酸和连接的核酸标签被扩增，以产生扩增的核酸，其中从至少一种形式扩增的核酸被加标签。
15.方法可以包括：测定扩增的核酸的序列数据，扩增的核酸中的至少一些被加标签，其中测定获得足以解码扩增的核酸的标签核酸分子的序列信息，以揭示为与序列数据已被测定的标签核酸分子连接的扩增的核酸提供原始模板的群体中的核酸形式。方法可以包括：从对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段鉴定免疫组库的一种或更多种克隆型。方法可以包括：确定一个或更多个单个白细胞的b细胞受体(bcr)轻链和bcr重链。方法可以包括：确定一个或更多个单个白细胞的t细胞受体(tcr)α链和tcrβ重链。方法可以包括：确定一个或更多个单个白细胞的tcrγ链和tcrδ重链。
16.在一些实施方案中，受试者在第一时间点和第二时间点之间接受至少一剂治疗性干预。在一些实施方案中，第二时间点在第一时间点之后约1天至约90天之间。方法可以包括：施用一个或更多个另外的剂量治疗性干预，所述治疗性干预被鉴定为对受试者有效。方法可以包括：当治疗性干预被鉴定为具有差的效力时，将受试者鉴定为具有差的预后。在一些实施方案中，差的预后包括较短的无进展存活期(progression-free survival)或较低的总存活期(overall survival)。在一些实施方案中，预测评分用于受试者中癌症的诊断、预后、分层(stratification)、风险评估和/或治疗性干预监测。
17.在一些实施方案中，测序测定包括单细胞(sc)测序测定。在一些实施方案中，一种或更多种基因组特性源自一个或更多个包括亚硫酸氢盐测序测定、单细胞亚硫酸氢盐测序测定、使用测序的转座酶可及染色质测定(atac-seq)、单细胞(sc)atac-seq或其任何组合的测序测定。在一些实施方案中，一种或更多种表达特性源自一个或更多个包括序列介导的蛋白谱分析(protein profiling)、单细胞序列介导的蛋白谱分析、rna测序(rna-seq)、单细胞(sc)rna-seq或其任何组合的测序测定。在一些实施方案中，一种或更多种变体特性源自包括条形码化的测序、随机测序、全基因组测序、靶向测序、下一代测序或其任何组合的测序测定。
18.在一些实施方案中，一种或更多种变体特性包括在多于一个基因座中的一个或更多个基因座处的单核苷酸多态性(snp)、插入或缺失(插入缺失(indel))、拷贝数变体(cnv)、融合、剪接变体、同种型变体、颠换、易位、移码、复制、重复变体或其任何组合。在一些实施方案中，一种或更多种基因组特性包括在多于一个基因座中的一个或更多个基因座处的染色质可及性、低甲基化和/或高甲基化。在一些实施方案中，一种或更多种表达特性包括一种或更多种感兴趣的mrna的低表达、一种或更多种感兴趣的蛋白的低表达、一种或更多种感兴趣的mrna的过表达和/或一种或更多种感兴趣的蛋白的过表达。在一些实施方案中，一种或更多种感兴趣的mrna和/或一种或更多种感兴趣的蛋白源自多于一个基因座中的一个或更多个基因座。在一些实施方案中，多于一个基因座选自包含少于受试者基因组中所有基因座的预定基因座组(predetermined set of loci)。在一些实施方案中，预定基因座组包含至少100个基因座。在一些实施方案中，预定基因座组包含100至100,000个基因座、100至50,000个基因座、100至25,000个基因座、100至10,000个基因座、100至5000个基因座、100至2000个基因座、100至1000个基因座、500至100,000个基因座、500至50,000个基因座、500至25,000个基因座、500至10,000个基因座、500至5000个基因座、500至2000个
基因座、500至1000个基因座、1000至100,000个基因座、1000至50,000个基因座、1000至25,000个基因座、1000至10,000个基因座、1000至5000个基因座或1000至2000个基因座。在一些实施方案中，预定基因座组是已知与癌症相关的。在一些实施方案中，预定基因座组包含肿瘤抑制基因和/或癌基因。在一些实施方案中，预定基因座组包含选自由以下组成的组的癌症相关基因：akt1、alk、apc、ar、araf、arid 1a、arid2、atm、b2m、bcl2、bcor、braf、brca1、brca2、card11、cbfb、ccnd1、cdh1、cdk4、cdkn2a、cic、crebbp、ctcf、ctnnb1、dicer 1、dis3、dnmt3a、egfr、eif1ax、ep300、erbb2、erbb3、ercc2、esr1、ezh2、fbxw7、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、flt3、foxa1、foxl2、foxol、fubp1、gat a3、gna11、gnaq、gnas、h3f3a、hist1h3b、hras、idh1、idh2、ikzf1、inppl1、jak1、kdm6a、keap1、kit、knstrn、kras、map2k1、mapk1、max、med 12、met、mlh1、msh2、msh3、msh6、mtor、myc、mycn、myd88、myod1、nf1、nfe2l2、notch1、nras、ntrk1、ntrk2、ntrk3、nup93、pak7、pdgfra、pik3ca、pik3cb、pik3r1、pik3r2、pms2、pole、ppp2r1a、ppp6c、prkci、ptch1、pten、ptpn11、rac1、raf1、rb1、ret、rhoa、rit1、ros1、rras2、rxra、setd2、sf3b1、smad3、smad4、smarca4、smarcb1、sos1、spop、stat3、stk11、stk19、tcf7l2、tert、tgfbr1、tgfbr2、tp53、tp63、tsc1、tsc2、u2af1、vhl和xpo1。
19.在一些实施方案中，产生源自序列读段的一种或更多种变体特性的值包括将所述序列读段的至少一部分与参考物的基因组进行比对。在一些实施方案中，产生源自序列读段的一种或更多种表达特性的值包括与参考物的感兴趣的mrna表达水平和/或感兴趣的蛋白表达水平进行比较。在一些实施方案中，产生源自序列读段的一种或更多种基因组特性的值包括与参考物的多于一个基因座中的一个或更多个基因座的甲基化状态和/或染色质可及性进行比较。在一些实施方案中，参考物包括一个或更多个患有受试者怀疑患有的相同阶段的癌症、相同类型的癌症或两者的患者。在一些实施方案中，参考物包括一个或更多个未受影响的个体。在一些实施方案中，参考物包括在较早时间点从受试者获得的生物样品。在一些实施方案中，参考物包括患有癌症的受试者、未患有癌症的受试者、患有i期癌症的受试者、患有ii期癌症的受试者、患有iii期癌症的受试者、患有iv期癌症的受试者或其任何组合。
20.方法可以包括：将源自从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、潜能未定克隆性造血(clonal hematopoiesis of indeterminate potential，chip)相关变体和/或未知来源的突变。方法可以包括：基于源自从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性的分类来调整预测评分、mrd评分和/或效力评分。在一些实施方案中，chip相关变体包括在从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段和从对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段之间匹配的变体特征。在一些实施方案中，真正的癌症相关变体包括在从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段和从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生的序列读段之间匹配的变体特征。在一些实施方案中，真正的癌症相关变体包括在从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段和真正的癌症相关变体数据库之间匹配的变体特征。在一些实施方案中，未知来源的突变包括在从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段、从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生的序列读段和从对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段之间不匹配的变体特征。方法可
以包括：如果受试者被鉴定为具有真正的癌症相关变体，则施用靶向真正的癌症相关变体的疗法，以及如果没有鉴定出真正的癌症相关变体，则在不存在任何随访测试的情况下施用非靶向疗法。
21.在一些实施方案中，(i)受试者尚未被确定患有癌症，(ii)受试者尚未被确定含有癌细胞，或和/或(iii)受试者未表现出或尚未表现出与癌症相关的症状。在一些实施方案中，癌症的存在在受试者未被诊断为ii期癌症、未被诊断为i期癌症、未进行活检以确认异常细胞生长、未进行活检以确认肿瘤的存在、未进行诊断扫描以检测癌症或其任何组合的时间段检测。在一些实施方案中，所述受试者是基于以下因素中的一个或更多个具有患癌症的低风险、中风险或高风险的群体的成员：环境因素、年龄、性别、病史、药物、遗传因素、生化因素、生物物理因素、生理因素和/或职业因素。在一些实施方案中，受试者表现出一种或更多种癌症症状。在一些实施方案中，受试者患有i期癌症、ii期癌症、iii期癌症和/或iv期癌症。在一些实施方案中，癌症包括血液学癌症。在一些实施方案中，癌症包括实体瘤。在一些实施方案中，癌症包括至少一种选自由以下组成的组的肿瘤类型：胆道癌、膀胱癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、化生癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉病性结肠直肠癌、结肠直肠腺癌、胃肠道间质瘤(gist)、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食道癌、食管鳞状细胞癌、食道腺癌、眼黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾母细胞瘤(wilms tumor)、白血病、急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、慢性粒单核细胞白血病(cmml)、肝癌(liver cancer)、肝上皮癌(liver carcinoma)、肝细胞瘤(hepatoma)、肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、间皮瘤、b细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前体t淋巴母细胞淋巴瘤/白血病、外周t细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌(npc)、神经母细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状肿瘤、泡细胞癌、前列腺癌、前列腺腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、小肠癌、胃癌(stomach cancer)、胃上皮癌(gastric carcinoma)、胃肠间质瘤(gist)、子宫癌和子宫肉瘤。
22.方法可以包括：向受试者施用治疗性干预。在一些实施方案中，治疗性干预包括不同的治疗性干预、抗体、过继性t细胞疗法、嵌合抗原受体(car)t细胞疗法、抗体-药物缀合物、细胞因子疗法、癌症疫苗、检查点抑制剂、放射疗法、手术、化疗剂或其任何组合。在一些实施方案中，治疗性干预在受试者患有早期癌症的时候施用，并且其中所述治疗性干预比如果治疗性干预在稍晚时间向受试者施用更有效。
23.在一些实施方案中，预定截止值具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的特异性。在一些实施方案中，预定截止值具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的灵敏度。在一些实施方案中，预定截止值具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的阳性预测值。
24.在一些实施方案中，癌症的存在、最小残留病的检测和/或治疗性干预的效力以至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的特异性在受试者中鉴定。在一些实施方案中，癌症的存在、最小残留病的检测和/或治疗性干预的效力以至
少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的灵敏度在受试者中鉴定。在一些实施方案中，癌症的存在、最小残留病的检测和/或治疗性干预的效力以至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的阳性预测值在受试者中鉴定。
25.在一些实施方案中，癌症的存在、最小残留病的检测和/或治疗性干预的效力以比可比方法的灵敏度大至少1.1倍的灵敏度在受试者中鉴定，所述可比方法不包括基于源自从对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性产生预测评分。在一些实施方案中，癌症的存在、最小残留病的检测和/或治疗性干预的效力以比可比方法的特异性大至少1.1倍的特异性在受试者中鉴定，所述可比方法不包括基于源自从对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性产生预测评分。在一些实施方案中，癌症的存在、最小残留病的检测和/或治疗性干预的效力以比可比方法的阳性预测值大至少1.1倍的阳性预测值在受试者中鉴定，所述可比方法不包括基于源自从对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性产生预测评分。
26.在一些实施方案中，癌症的存在、最小残留病的检测和/或治疗性干预的效力以比可比方法的灵敏度大至少1.1倍的灵敏度在受试者中鉴定，所述可比方法不包括将源自从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、chip相关变体和/或未知来源的突变。在一些实施方案中，癌症的存在、最小残留病的检测和/或治疗性干预的效力以比可比方法的特异性大至少1.1倍的特异性在受试者中鉴定，所述可比方法不包括将源自从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、chip相关变体和/或未知来源的突变。在一些实施方案中，癌症的存在、最小残留病的检测和/或治疗性干预的效力以比可比方法的阳性预测值大至少1.1倍的阳性预测值在受试者中鉴定，所述可比方法不包括将源自从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、chip相关变体和/或未知来源的突变。
27.附图简述
28.图1图示了非限制性示例性条形码。
29.图2示出条形码化和数字计数的非限制性示例性工作流程。
30.图3是示出用于从多于一个靶产生在3’末端条形码化的靶的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。
31.图4a-图4b描绘了用于鉴定受试者中癌症的存在、监测患有癌症的受试者中治疗性干预的效力以及检测正在接受癌症治疗的受试者中的微小残留病(mrd)的非限制性示例性工作流程。
32.详述
33.以下详述中参考了形成本文的一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指示，否则相似的符号通常标识相似的组成部分。在详述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案不意味着是限制性的。在不脱离本文呈现的主题的精神或范围的情况下，可以利用其
他实施方案，并且可以做出其他改变。将容易理解的是，如本文一般描述的以及附图中图示的本公开内容的方面能够以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文中明确设想并且构成本公开内容的一部分。
34.本文提及的所有专利、公开的专利申请、其他出版物和来自genbank的序列以及其他数据库关于相关技术通过引用以其整体并入。
35.对少量核酸(例如信使核糖核苷酸(mrna)分子)进行定量对于确定例如在不同发育阶段或在不同环境条件下在细胞中表达的基因是临床上重要的。然而，确定核酸分子(例如，mrna分子)的绝对数目也可以是非常具有挑战性的，尤其是当分子数目非常小时。确定样品中分子的绝对数目的一种方法是数字聚合酶链式反应(pcr)。理想地，pcr在每个循环中产生相同拷贝的分子。然而，pcr可具有缺点，使得每个分子以随机概率复制，且此概率根据pcr循环和基因序列而变化，这导致扩增偏倚和不准确的基因表达测量。具有独特分子标记(molecular labels，也称为分子索引(molecular indexes,mi))的随机条形码可以用于计数分子数目和校正扩增偏倚。诸如precise
tm
测定(cellular research,inc.(palo alto,ca))和rhapsody
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测定(becton,dickinson and company(franklin lakes,nj))的随机条形码化可以通过使用分子标记(ml)在逆转录(rt)期间标记mrna来纠正由pcr和文库制备步骤引起的偏倚。
36.precise
tm
测定可以利用具有在多(t)寡核苷酸上的大量(例如6561种至65536种)独特分子标记序列的随机条形码的非耗尽性池(non-depleting pool)，以在rt步骤期间与样品中的所有多(a)-mrna杂交。随机条形码可以包含通用pcr引发位点。在rt期间，靶基因分子与随机条形码随机反应。每一种靶分子可以与随机条形码杂交，导致产生随机条形码化的互补核糖核苷酸(cdna)分子。在标记后，可以将来自微孔板微孔的随机条形码化cdna分子汇集到单个管中用于pcr扩增和测序。可以分析原始测序数据以产生读段的数目、具有独特分子标记序列的随机条形码的数目以及mrna分子的数目。
37.本文的公开内容包括鉴定受试者中癌症的存在的方法。在一些实施方案中，方法包括：从源自受试者的生物样品分离白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从源自受试者的生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自序列读段的一种或更多种特性的值，其中一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于一种或更多种特性的值产生预测评分；当预测评分大于预定截止值时，鉴定受试者中癌症的存在。方法可以包括：从生物样品分离白细胞和ctc，任选地分离ctc包括捕获表达上皮细胞黏附分子(epcam)的细胞；以及从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生序列读段。
38.本文的公开内容包括检测正在接受癌症治疗的受试者中的微小残留病(mrd)的方法。在一些实施方案中，方法包括：从源自受试者的生物样品分离白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从源自受试者的生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自序列读段的一种或更多种特性的值，其中一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于一种或更多种特性的值产生mrd评分；以及当mrd评分大于预定截止值时，检
测到受试者中的mrd。方法可以包括：从生物样品分离白细胞和ctc，任选地分离ctc包括捕获表达上皮细胞黏附分子(epcam)的细胞；以及从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生序列读段。
39.本文的公开内容包括在患有癌症的受试者中监测治疗性干预的效力的方法。在一些实施方案中，方法包括：从分别在第一时间点和第二时间点源自受试者的第一生物样品和第二生物样品分离白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从分别在第一时间点和第二时间点源自受试者的第一生物样品和第二生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自序列读段的一种或更多种特性的值，其中一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于在第一时间点和第二时间点的一种或更多种特性的值产生效力评分；当效力评分低于预定截止值时，鉴定治疗性干预为有效。方法可以包括：从生物样品分离白细胞和ctc，任选地分离ctc包括捕获表达上皮细胞黏附分子(epcam)的细胞；以及从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生序列读段。
40.定义
41.除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。参见，例如，singleton等人，dictionary of microbiology and molecular biology，第2版，j.wiley&sons(new york,ny 1994)；sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual,cold spring harbor press(cold spring harbor,ny 1989)。为了本公开内容的目的，下文定义了以下术语。
42.如本文使用的，术语“衔接子”可以意指促进关联的核酸的扩增或测序的序列。关联的核酸可以包括靶核酸。关联的核酸可以包括空间标记、靶标记、样品标记、索引标记或条形码序列(例如，分子标记)中的一种或更多种。衔接子可以是线性的。衔接子可以是预腺苷酸化的衔接子。衔接子可以是双链或单链的。一种或更多种衔接子可以位于核酸的5’端或3’端。当衔接子在5’端和3’端包含已知序列时，已知序列可以是相同或不同的序列。位于多核苷酸的5’端和/或3’端的衔接子可以能够与固定在表面上的一种或更多种寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，衔接子可以包含通用序列。通用序列可以是两种或更多种核酸分子共有的核苷酸序列的区域。两种或更多种核酸分子也可以具有不同序列的区域。因此，例如，5’衔接子可以包含相同和/或通用核酸序列，并且3’衔接子可以包含相同和/或通用序列。可以存在于多于一个核酸分子的不同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列互补的单种通用引物复制或扩增多于一个不同序列。类似地，可以存在于核酸分子的集合中的不同成员中的至少一种、两种(例如，一对)或更多种通用序列可以允许使用与通用序列互补的至少一种、两种(例如，一对)或更多种单一通用引物复制或扩增多于一个不同序列。因此，通用引物包含可与此类通用序列杂交的序列。可以修饰具有靶核酸序列的分子以将通用衔接子(例如，非靶核酸序列)附接到不同靶核酸序列的一个末端或两个末端。与靶核酸附接的一种或更多种通用引物可以提供通用引物杂交的位点。与靶核酸附接的一种或更多种通用引物可以彼此相同或不同。
43.如本文使用的，术语“关联”或“与...关联”可以意指两个或更多个物质(species)可以被鉴定为在某个时间点共定位。关联可以意指，两个或更多个物质在或曾经在相似的
容器内。关联可以是信息学关联。例如，关于两个或更多个物质的数字信息可以被存储并且可以用于确定一种或更多种物质在某个时间点共定位。关联也可以是物理关联。在一些实施方案中，两个或更多个关联的物质彼此“拴系”、“附接”或“固定”或与共同的固体或半固体表面“拴系”、“附接”或“固定”。关联可以指用于将标记与固体或半固体支持物(诸如珠)附接的共价或非共价方式。关联可以是靶与标记之间的共价键。关联可以包括两个分子(诸如靶分子和标记)之间的杂交。
44.如本文使用的，术语“互补”可以指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果核酸在给定位置处的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则这两个核酸被认为在该位置处是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在全部互补性时它可以是完全的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则第一核苷酸序列可以被称为第二序列的“互补物”。如果第一核苷酸序列和与第二序列相反的序列(即，核苷酸顺序相反)互补，则第一核苷酸序列可以被称为第二序列的“反向互补物”。如本文使用的，“互补”序列可以指序列的“互补物”或“反向互补物”。从本公开内容理解，如果一个分子可以与另一个分子杂交，则其可以与其所杂交的分子互补或部分互补。
45.如本文使用的，术语“数字计数”可以指用于估计样品中靶分子数目的方法。数字计数可以包括确定已经与样品中的靶关联的独特标记的数目的步骤。这种方法(其本质上可以是随机的)将计数分子的问题从相同分子的定位和鉴定之一转化为有关检测一组预定义标记的一系列是/否数字问题。
46.如本文使用的，术语“一种标记(label)”或“多于一种标记(labels)”可以指与样品中的靶关联的核酸代码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是完全或部分可扩增的标记。标记可以是完全或部分可测序的标记。标记可以是可鉴定为有区别的天然核酸的一部分。标记可以是已知的序列。标记可以包括核酸序列的连接处，例如天然和非天然序列的连接处。如本文使用的，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传达信息。例如，在多种实施方案中，可以使用标记来确定样品的身份、样品的来源、细胞的身份和/或靶。
47.如本文使用的，术语“非耗尽性储库(non-depleting reservoir)”可以指由许多不同标记组成的条形码(例如，随机条形码)的池。非耗尽性储库可以包括大量不同的条形码，使得当非耗尽性储库与靶池关联时，每一种靶可能与独特条形码关联。每一种标记的靶分子的独特性可以通过随机选择的统计来确定，并且取决于与标记的多样性相比在集合中相同的靶分子的拷贝数。所得的标记的靶分子的集合的大小可以通过条形码化处理的随机性质来确定，并且然后对检测到的条形码的数目的分析允许计算原始集合或样品中存在的靶分子的数目。当存在的靶分子的拷贝数与独特条形码的数目的比率低时，标记的靶分子是高度独特的(即，多于一个靶分子被给定标记标记的概率非常低)。
48.如本文使用的，术语“核酸”是指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸对于细胞可以是外源的或内源的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是dna。核酸可以是rna。核酸可以包括一种或更多种类似物(例如，改变的主链、糖或核酸碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、非天然核酸(xeno nucleic acid)、吗啉代核酸(morpholinos)、锁核酸、二醇核酸、苏糖核酸、二脱氧核
苷酸、虫草菌素、7-脱氮-gtp、荧光团(例如，罗丹明或与糖连接的荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、cpg岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷(queuosine)以及怀俄苷(wyosine)。“核酸”、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以互换使用。
49.核酸可以包括一种或更多种修饰(例如，碱基修饰、主链修饰)，以为核酸提供新的或增强的特征(例如，改进的稳定性)。核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。此类杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是还包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成核酸时，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。继而，此线性聚合化合物的各端可以进一步连接而形成环状化合物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并且因此可以按产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸中，磷酸基团通常可以称为形成核酸的核苷间主链。连键(linkage)或主链可以是3’到5’磷酸二酯连键。
50.核酸可以包括修饰的主链和/或修饰的核苷间连键。修饰的主链可以包括那些在主链中保留磷原子的主链和那些在主链中没有磷原子的主链。合适的其中含磷原子的修饰的核酸主链可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯(aminoalkyl phosphotriesters)、甲基和其他烷基(alkyl)膦酸酯诸如3
’‑
亚烷基膦酸酯、5
’‑
亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidate)(包括3
’‑
氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、磷酸二酰胺酯(phosphorodiamidates)、硫代磷酰胺酯(thionophosphoramidates))、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼磷酸酯，具有正常3
’‑5’
连接、2
’‑5’
连接的类似物以及具有反向极性的类似物(其中一个或更多个核苷酸间连接是3’至3’、5’至5’或2’至2’连接)。
51.核酸可以包括由短链烷基或环烷基核苷间连键，混合杂原子，和烷基或环烷基核苷间连键，或者一个或更多个短链杂原子的或杂环的核苷间连键形成的多核苷酸主链。这些可以包括具有吗啉代(morpholino)连键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基主链；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的n、o、s和ch2组分部分的其他的那些。
52.核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”可以意图包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间连键二者被非呋喃糖基团替代的多核苷酸，仅呋喃糖环的替代也可以称为糖替代物(surrogate)。可以维持杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，以与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(pna)。在pna中，多核苷酸的糖主链可以被含酰胺的主链替代，特别是被氨基乙基甘氨酸主链替代。核苷酸可以被保留，并且直接或间接与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。pna化合物中的主链可以包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这使得pna具有含酰胺的主链。杂环碱基部分可以直接或间接与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。
53.核酸可以包括吗啉代主链结构。例如，核酸可以包含替代核糖环的6元吗啉代环。
在这些实施方案的一些中，磷酸二酰胺酯或其他非磷酸二酯核苷间连键可以替代磷酸二酯连键。
54.核酸可以包括具有附接至吗啉代环的杂环碱基的连接的吗啉代单元(例如，吗啉代核酸)。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子吗啉代的寡聚化合物与细胞蛋白可以具有较少的不期望的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是核酸的非离子模拟物。吗啉代类别内的各种化合物可以使用不同的连接基团来连接。另外类别的多核苷酸模拟物可以称为环己烯基核酸(cena)。核酸分子中通常存在的呋喃糖环可以被环己烯基环替代。使用亚磷酰胺化学可以制备cena dmt保护的亚磷酰胺单体并用于寡聚化合物合成。将cena单体掺入核酸链可以增加dna/rna杂合体的稳定性。cena寡腺苷酸酯可以与核酸互补物形成复合体，具有与天然复合体相似的稳定性。另外的修饰可以包括锁核酸(lna)，其中2
’‑
羟基基团与糖环的4’碳原子连接，从而形成2
’‑
c,4
’‑
c-氧亚甲基连键，从而形成双环糖部分。连接可以是亚甲基(-ch
2-)，桥接2’氧原子和4’碳原子的基团，其中n是1或2。lna和lna类似物可以显示与互补核酸的非常高的双链体热稳定性(tm＝+3℃至+10℃)、对3
’‑
外切核酸酶降解的稳定性和良好的溶解性。
55.核酸还可以包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基可以包括嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g))，以及嘧啶碱基(例如，胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u))。经修饰的核碱基可以包括其他合成以及天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶(5-halouracil)和胞嘧啶、5-丙炔基(-c≡c-ch3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶，8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-f-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可以包括三环嘧啶，诸如吩噁嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、吩噻嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3h)-酮)，g-钳(g-clamps)诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、吩噻嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3h)-酮)，g-钳诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、咔唑胞苷(2h-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(h-吡啶并(3’,2’:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
[0056]
如本文使用的，术语“样品”可以指包含靶的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的合适样品包括细胞、组织、器官或生物体。
[0057]
如本文使用的，术语“采样装置”或“装置”可以指可以取样品的切片和/或将所述切片放置在基底上的装置。采样装置可以指例如荧光激活细胞分选(facs)机、细胞分选机、活检针、活检装置、组织切片装置、微流体装置、刀片格栅和/或超薄切片机。
[0058]
如本文使用的，术语“固体支持物”可以指可以附接多于一个条形码(例如，随机条形码)的离散固体或半固体表面。固体支持物可以包括任何类型的实心的、多孔的或空心的
球体、球、承座(bearing)、圆柱体或由塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)构成的其他类似配置，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。固体支持物可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。珠的形状可以是非球形的。以阵列间隔开的多于一个固体支持物可以不包括基底。固体支持物可以与术语“珠”互换使用。
[0059]
如本文使用的，术语“随机条形码”可以指本公开内容的包含标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶关联的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。
[0060]
如本文使用的，术语“基因特异性随机条形码”可以指包含标记和基因特异性的靶结合区的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶关联的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。
[0061]
如本文使用的，术语“随机条形码化”可以指核酸的随机标记(例如，条形码化)。随机条形码化可以利用递归泊松策略来关联并对与靶关联的标记进行定量。如本文使用的，术语“随机条形码化”可以与“随机进行标记”互换使用。
[0062]
如本文使用的，术语“靶”可以指可与条形码(例如，随机条形码)关联的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的示例性合适的靶包括寡核苷酸、dna、rna、mrna、微rna、trna等。靶可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，靶可以是蛋白、肽或多肽。在一些实施方案中，靶是脂质。如本文使用的，“靶”可以与“物质(species)”互换使用。
[0063]
如本文使用的，术语“逆转录酶”可以指具有逆转录酶活性(即，催化从rna模板合成dna)的一组酶。通常，这样的酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒(retroplasmid)逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、ii组内含子衍生的逆转录酶，及它们的突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非ltr逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶和ii组内含子逆转录酶。ii组内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌(lactococcus lactis)li.ltrb内含子逆转录酶、细长嗜热聚球藻(thermosynechococcus elongatus)tei4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪地芽孢杆菌(geobacillus stearothermophilus)gsi-iic内含子逆转录酶。其他类别的逆转录酶可以包括许多类型的非逆转录病毒逆转录酶(即，尤其是逆转录子、ii组内含子、以及多样性产生型逆转录元件)。
[0064]
术语“通用衔接子引物”、“通用引物衔接子”或“通用衔接子序列”可互换地使用，以指可以用于与条形码(例如，随机条形码)杂交以产生基因特异性条形码的核苷酸序列。通用衔接子序列可以例如是在本公开内容的方法中使用的遍及所有条形码通用的已知序列。例如，当使用本文公开的方法标记多于一个靶时，每一种靶特异性序列可以连接到相同的通用衔接子序列。在一些实施方案中，多于一个通用衔接子序列可以用于本文公开的方法中。例如，当使用本文公开的方法标记多于一个靶时，至少两种靶特异性序列连接到不同的通用衔接子序列。通用衔接子引物及其互补物可以被包括在两种寡核苷酸中，其中的一
种寡核苷酸包含靶特异性序列且另一种寡核苷酸包含条形码。例如，通用衔接子序列可以是包含靶特异性序列的寡核苷酸的一部分以产生与靶核酸互补的核苷酸序列。包含条形码和通用衔接子序列的互补序列的第二寡核苷酸可与核苷酸序列杂交并产生靶特异性条形码(例如，靶特异性随机条形码)。在一些实施方案中，通用衔接子引物具有与本公开内容的方法中使用的通用pcr引物不同的序列。
[0065]
条形码
[0066]
条形码化，诸如随机条形码化，已描述于以下中：例如，fu等人,proc natl acad sci u.s.a.,2011may 31；108(22):9026-31；美国专利申请公布第us2011/0160078号；fan等人,science,2015february 6,347(6222):1258367；美国专利申请公布第us2015/0299784号和pct申请公布第wo2015/031691号；这些中的每一个的内容，包括任何支持或补充信息或材料，通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本文公开的条形码可以是随机条形码，所述随机条形码可以是可以用于对靶进行随机标记(例如，条形码化、加标签)的多核苷酸序列。如果随机条形码的不同条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现数目的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或这些值中的任何两个值之间的数字或范围，则条形码可以称为随机条形码。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mrna分子的mrna物质。如果随机条形码的不同条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现数目的比例是至少以下或是至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，则条形码可以称为随机条形码。随机条形码的条形码序列可以称为分子标记。
[0067]
条形码(例如，随机条形码)可以包括一种或更多种标记。示例性标记可以包括通用标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、样品标记、板标记、空间标记和/或前空间标记(pre-spatial label)。图1图示了具有空间标记的示例性条形码104。条形码104可以包含可以将条形码与固体支持物108连接的5’胺。条形码可以包含通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和/或分子标记。条形码中不同标记(包括但不限于通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和分子标记)的顺序可以变化。例如，如图1中所示，通用标记可以是最5’侧的标记(5
’‑
most label)，且分子标记可以是最3’侧的标记(3
’‑
most label)。空间标记、维度标记和细胞标记可以处于任何顺序。在一些实施方案中，通用标记、空间标记、维度标记、细胞标记和分子标记处于任何顺序。条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶(例如，靶核酸、rna、mrna、dna)相互作用。例如，靶结合区可以包含可以与mrna的多(a)尾相互作用的寡(dt)序列。在一些情况下，条形码的标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列)可以由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个核苷酸隔开。
[0068]
标记(例如，细胞标记)可以包含一组独特的定义长度的核酸子序列，例如每一种七个核苷酸(相当于一些汉明错误校正代码中使用的比特数目)，其可被设计成提供错误校正能力。可以设计包含七个核苷酸序列的错误校正子序列组，使得所述组中的序列的任何成对组合展现出定义的“遗传距离”(或错配碱基数)，例如一组错误校正子序列可被设计成展现三个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，对于标记的靶核酸分子的序列数据组中的错
误校正序列的审查(在下文更详细地描述)可允许人们检测或校正扩增错误或测序错误。在一些实施方案中，用于产生错误校正代码的核酸子序列的长度可以变化，例如，它们的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、31个、40个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，其他长度的核酸子序列可以用来产生错误校正代码。
[0069]
条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶相互作用。靶可以是以下或包括以下：核糖核酸(rna)、信使rna(mrna)、微rna、小干扰rna(sirna)、rna降解产物、各自含有多(a)尾的rna或其任何组合。在一些实施方案中，多于一个靶可以包括脱氧核糖核酸(dna)。
[0070]
在一些实施方案中，靶结合区可以包括可以与mrna的多(a)尾相互作用的寡(dt)序列。条形码的一种或更多种标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列(例如，分子标记))可以通过间隔区(spacer)与条形码的另一种或两种剩余标记隔开。间隔区可以是例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，条形码的标记中没有一个标记被间隔区隔开。
[0071]
通用标记
[0072]
条形码可以包含一种或更多种通用标记。在一些实施方案中，一种或更多种通用标记对于附接至给定固体支持物的条形码组中的所有条形码可以是相同的。在一些实施方案中，一种或更多种通用标记对于附接至多于一个珠的所有条形码可以是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物杂交的核酸序列。测序引物可以用于对包括通用标记的条形码进行测序。测序引物(例如，通用测序引物)可以包括与高通量测序平台相关的测序引物。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与pcr引物杂交的核酸序列。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物和pcr引物杂交的核酸序列。能够与测序引物或pcr引物杂交的通用标记的核酸序列可以被称为引物结合位点。通用标记可以包括可以用于引发条形码转录的序列。通用标记可以包括可以用于延伸条形码或条形码内的区域的序列。通用标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。例如，通用标记可以包括至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。在一些实施方案中，可裂解接头或修饰的核苷酸可以是通用标记序列的一部分，以使条形码能够从支持物上被裂解下来。
[0073]
维度标记
[0074]
条形码可以包含一种或更多种维度标记。在一些实施方案中，维度标记可以包括提供关于标记(例如，随机标记)发生的维度的信息的核酸序列。例如，维度标记可以提供关于靶被条形码化的时间的信息。维度标记可以与样品中条形码化(例如，随机条形码化)的时间关联。维度标记可以在标记的时间被激活。不同的维度标记可以在不同的时间被激活。维度标记提供关于靶、靶的组和/或样品被条形码化的顺序的信息。例如，在细胞周期的g0期可以将细胞的群体条形码化。在细胞周期的g1期，可以用条形码(例如，随机条形码)对细胞再次进行脉冲处理。在细胞周期的s期，可以用条形码对细胞再次进行脉冲处理，等等。每
次脉冲(例如，细胞周期的每个时期)时的条形码可以包含不同的维度标记。以这种方式，维度标记提供关于哪些靶在细胞周期的哪个时期被标记的信息。维度标记可以探询许多不同的生物学时间。示例性的生物学时间可以包括但不限于细胞周期、转录(例如，转录起始)和转录物降解。在另一种实例中，样品(例如，细胞、细胞的群体)可以在用药物和/或疗法治疗之前和/或之后标记。不同靶的拷贝数的变化可以指示样品对药物和/或疗法的响应。
[0075]
维度标记可以是可激活的。可激活的维度标记可以在特定时间点被激活。可激活的标记可以被例如组成性地激活(例如，不关闭)。可激活的维度标记可以被例如可逆地激活(例如，可激活的维度标记可以被打开和关闭)。维度标记可以被例如可逆地激活至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。维度标记可以被可逆地激活例如至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在一些实施方案中，可以用荧光、光、化学事件(例如，裂解，连接另一种分子，添加修饰(例如，聚乙二醇化、类泛素化(sumoylate)、乙酰化、甲基化、去乙酰化、去甲基化)、光化学事件(例如，光罩(photocaging))以及引入非天然的核苷酸将维度标记激活。
[0076]
在一些实施方案中，维度标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码(例如，随机条形码)可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的维度标记。
[0077]
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特维度标记序列。维度标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。维度标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。维度标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。维度标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。维度标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
[0078]
空间标记
[0079]
条形码可以包含一种或更多种空间标记。在一些实施方案中，空间标记可以包含提供关于与条形码关联的靶分子的空间取向的信息的核酸序列。空间标记可以与样品中的坐标关联。坐标可以是固定的坐标。例如，坐标可以相对于基底固定。空间标记可以参考二维或三维网格。坐标可以相对于界标(landmark)固定。界标可在空间中被鉴定。界标可以是可被成像的结构。界标可以是生物结构，例如解剖学界标。界标可以是细胞界标，例如细胞器。界标可以是非天然界标，诸如具有可鉴定标识(identifiable identifier)(诸如色码、条形码、磁特性(magnetic property)、荧光、放射性或独特尺寸或形状)的结构。空间标记可以与物理分区(例如，孔、容器或液滴)关联。在一些实施方案中，将多于一个空间标记一起用于编码空间中的一个或更多个位置。
[0080]
空间标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、
95％、97％、99％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以是至少或至多60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的空间标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的空间标记。
[0081]
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特空间标记序列。空间标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。空间标记的长度可以是至少以下或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。空间标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。空间标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。空间标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
[0082]
细胞标记
[0083]
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种细胞标记。在一些实施方案中，细胞标记可以包含提供用于确定哪种靶核酸来源于哪种细胞的信息的核酸序列。在一些实施方案中，细胞标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。例如，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的细胞标记。作为另一种实例，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的细胞标记。
[0084]
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特细胞标记序列。细胞标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。例如，细胞标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。作为另一种实例，细胞标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。作为又另一种实例，细胞标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
[0085]
条形码序列
[0086]
条形码可以包含一种或更多种条形码序列。在一些实施方案中，条形码序列可以包含为与条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。条形码序列可以包含为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器(例如，提供粗略估计)的核酸序列。
[0087]
在一些实施方案中，将一组相异的(diverse)条形码序列附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以有以下或可以有约以下的独特分子标记序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种或这些值中的任何两个值之间的数字或范
围。例如，多于一个条形码可以包括约6561种具有不同序列的条形码序列。作为另一种实例，多于一个条形码可以包括约65536种具有不同序列的条形码序列。在一些实施方案中，可以有至少以下或可以有至多以下的独特条形码序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种或109种。独特分子标记序列可以附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，独特分子标记序列被颗粒(例如水凝胶珠)部分或全部包含。
[0088]
在不同实施方式中，条形码的长度可以是不同的。例如，条形码的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。作为另一种实例，条形码的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。
[0089]
分子标记
[0090]
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种分子标记。分子标记可以包含条形码序列。在一些实施方案中，分子标记可以包含为与条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。分子标记可以包含为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器的核酸序列。
[0091]
在一些实施方案中，将一组相异的分子标记附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以有以下或可以有约以下的独特分子标记序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。例如，多于一个条形码可以包括约6561种具有不同序列的分子标记。作为另一种实例，多于一个条形码可以包括约65536种具有不同序列的分子标记。在一些实施方案中，可以有至少以下或可以有至多以下的独特分子标记序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种或109种。具有独特分子标记序列的条形码可以附接至给定固体支持物(例如，珠)。
[0092]
对于使用多于一个随机条形码进行的条形码化(例如随机条形码化)，不同分子标记序列的数量与任何靶的出现次数的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mrna分子的mrna物质。在一些实施方案中，不同分子标记序列的数量与任何靶的出现次数的比例是至少以下或是至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。
[0093]
分子标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。分子标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。
[0094]
靶结合区
[0095]
条形码可以包含一个或更多个靶结合区，诸如捕获探针。在一些实施方案中，靶结合区可以与感兴趣的靶杂交。在一些实施方案中，靶结合区可以包含与靶(例如，靶核酸、靶分子，例如待分析的细胞核酸)特异性杂交(例如，与特定基因序列特异性杂交)的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包含可以附接(例如，杂交)至特定靶核酸的特定位置
的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包含能够与限制性酶位点突出端(例如，ecori粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。
[0096]
在一些实施方案中，靶结合区可以包含非特异性靶核酸序列。非特异性靶核酸序列可以指可以独立于靶核酸的特定序列结合多于一个靶核酸的序列。例如，靶结合区可以包含随机多聚体序列、多(da)序列、多(dt)序列、多(dg)序列、多(dc)序列或其组合。例如，靶结合区可以是与mrna分子上的多(a)尾杂交的寡(dt)序列。随机多聚体序列可以是，例如，随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或任何长度的更高多聚体序列。在一些实施方案中，对于附接至给定珠的所有条形码，靶结合区是相同的。在一些实施方案中，对于附接至给定珠的多于一个条形码，靶结合区可以包括两种或更多种不同的靶结合序列。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。例如，可以使用逆转录酶诸如moloney鼠白血病病毒(mmlv)逆转录酶逆转录mrna分子，以产生具有多(dc)尾的cdna分子。条形码可以包括具有多(dg)尾的靶结合区。在条形码的多(dg)尾和cdna分子的多(dc)尾之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞rna分子转换到条形码，并继续向条形码的5’末端复制。通过这样做，得到的cdna分子在该cdna分子3’末端上含有条形码序列(诸如分子标记)。
[0097]
在一些实施方案中，靶结合区可以包含寡(dt)，所述寡(dt)可以与包含聚腺苷酸化末端的mrna杂交。靶结合区可以是基因特异性的。例如，可以将靶结合区配置为与靶的特定区域杂交。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。靶结合区的长度可以是约5-30个核苷酸。当条形码包含基因特异性靶结合区时，条形码在本文中可以称为基因特异性条形码。
[0098]
定向特性(orientation property)
[0099]
随机条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种可以用于定向(例如，比对)条形码的定向特性。条形码可以包含用于等电聚焦的部分。不同的条形码可以包含不同的等电聚焦点。当将这些条形码引入样品中时，样品可以经历等电聚焦，以便于将条形码定向成已知的方式。以这种方式，定向特性可以用于开发样品中条形码的已知的映射。示例性定向特性可以包括电泳迁移率(例如，基于条形码的尺寸)、等电点、自旋、电导率和/或自组装。例如，具有自组装的定向特性的条形码激活时可以自组装成特定的定向(例如，核酸纳米结构)。
[0100]
亲和特性(affinity property)
[0101]
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种亲和特性。例如，空间标记可以包含亲和特性。亲和特性可以包括可以促进条形码与另一种实体(例如，细胞受体)结合的
化学部分和/或生物部分。例如，亲和特性可以包括抗体，例如，对样品上的特定部分(例如，受体)特异性的抗体。在一些实施方案中，抗体可以将条形码引导至特定细胞类型或分子。在特定细胞类型或分子处和/或特定细胞类型或分子附近的靶可以被标记(例如，被随机标记)。在一些实施方案中，亲和特性可以提供空间标记的核苷酸序列之外的空间信息，因为抗体可以将条形码引导至特定位置。抗体可以是治疗性抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是人源化的或嵌合的。抗体可以是裸抗体或融合抗体。
[0102]
抗体可以是全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，igg抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合性)部分(如抗体片段)。
[0103]
抗体片段可以是例如抗体的一部分，诸如f(ab’)2、fab’、fab、fv、sfv等。在一些实施方案中，抗体片段可以与由全长抗体识别的相同抗原结合。抗体片段可以包括由抗体的可变区组成的分离的片段，诸如由重链和轻链的可变区组成的“fv”片段和其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scfv蛋白”)。示例性抗体可以包括但不限于癌细胞抗体、病毒抗体、与细胞表面受体(cd8、cd34、cd45)结合的抗体和治疗性抗体。
[0104]
通用衔接子引物
[0105]
条形码可以包含一种或更多种通用衔接子引物。例如，基因特异性条形码(诸如基因特异性随机条形码)可以包含通用衔接子引物。通用衔接子引物可以指遍及所有条形码的通用的核苷酸序列。通用衔接子引物可以用于构建基因特异性条形码。通用衔接子引物的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是5-30个核苷酸。
[0106]
接头
[0107]
当条形码包含多于一个类型的标记(例如，多于一个细胞标记或多于一个条形码序列，诸如一种分子标记)时，标记之间可以散布有接头标记序列。接头标记序列的长度可以是至少约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。接头标记序列的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。在一些情况下，接头标记序列的长度是12个核苷酸。接头标记序列可以用于促进条形码的合成。接头标记可以包括错误校正(例如，汉明)码。
[0108]
固体支持物
[0109]
在一些实施方案中，本文公开的条形码(诸如随机条形码)可以与固体支持物关联。固体支持物可以是例如合成颗粒。在一些实施方案中，固体支持物上的多于一个条形码(例如，第一多于一个条形码)的一些或所有条形码序列(诸如，随机条形码(例如，第一条形码序列)的分子标记)相差至少一个核苷酸。同一固体支持物上的条形码的细胞标记可以是相同的。不同的固体支持物上的条形码的细胞标记可以相差至少一个核苷酸。例如，第一固体支持物上的第一多于一个条形码的第一细胞标记可以具有相同的序列，且第二固体支持物上的第二多于一个条形码的第二细胞标记可以具有相同的序列。第一固体支持物上的第
一多于一个条形码的第一细胞标记和第二固体支持物上的第二多于一个条形码的第二细胞标记可以相差至少一个核苷酸。细胞标记可以是例如约5-20个核苷酸长。条形码序列可以是例如约5-20个核苷酸长。合成颗粒可以是例如珠。
[0110]
珠可以是例如硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、dynabead、sephadex/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。珠可以包括材料诸如聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮或其任何组合。
[0111]
在一些实施方案中，珠可以是用条形码或随机条形码官能化的聚合物珠(例如可变形珠或凝胶珠)(诸如来自10x genomics(san francisco,ca)的凝胶珠)。在一些实施方式中，凝胶珠可以包括基于聚合物的凝胶。凝胶珠可以例如通过将一种或更多种聚合物前体包封到液滴中来产生。在将聚合物前体暴露于促进剂(例如，四甲基乙二胺(temed))后，可以产生凝胶珠。
[0112]
在一些实施方案中，颗粒可以是可破坏的(例如，可溶解的、可降解的)。例如，聚合物珠可以例如在期望的条件下溶解、熔化或降解。所期望的条件可以包括环境条件。所期望的条件可以导致聚合物珠以受控方式溶解、熔化或降解。凝胶珠可以由于化学刺激、物理刺激、生物刺激、热刺激、磁刺激、电刺激、光刺激或其任何组合而溶解、熔化或降解。
[0113]
例如，分析物和/或试剂(诸如寡核苷酸条形码)可以偶联/固定至凝胶珠的内表面(例如，经由寡核苷酸条形码和/或用于产生寡核苷酸条形码的材料的扩散而可及的内部)和/或凝胶珠的外表面或本文描述的任何其他微胶囊。偶联/固定可以经由任何形式的化学键合(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)。在一些实施方案中，本文描述的试剂与凝胶珠或任何其他微胶囊的偶联/固定可以是可逆的，诸如，例如经由不稳定型部分(例如，经由化学交联物，包括本文描述的化学交联物)。在施加刺激后，不稳定型部分可以被裂解并释放所固定的试剂。在一些实施方案中，不稳定型部分是二硫键。例如，在经由二硫键将寡核苷酸条形码固定至凝胶珠的情况下，使二硫键暴露于还原剂可以裂解二硫键并从珠释放寡核苷酸条形码。不稳定型部分可以作为凝胶珠或微胶囊的一部分、作为将试剂或分析物与凝胶珠或微胶囊连接的化学接头的一部分和/或作为试剂或分析物的一部分被包括。在一些实施方案中，多于一个条形码的至少一种条形码可以被固定在颗粒上、被部分固定在颗粒上、被包封在颗粒中、被部分包封在颗粒中或其任何组合。
[0114]
在一些实施方案中，凝胶珠可以包括宽范围的不同的聚合物，包括但不限于：聚合物、热敏聚合物、光敏聚合物、磁性聚合物、ph敏感聚合物、盐敏感聚合物、化学敏感聚合物、聚电解质、多糖、肽、蛋白和/或塑料。聚合物可以包括但不限于以下材料：诸如聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(苯乙烯磺酸酯)(pss)、聚(烯丙基胺)(paam)、聚(丙烯酸)(paa)、聚(乙烯亚胺)(pei)、聚(双烯丙基二甲基-氯化铵)(pdadmac)、聚(吡咯)(poly(pyrolle)，ppy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvpon)、聚(乙烯基吡啶)(pvp)、聚(甲基丙烯酸)(pmaa)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚苯乙烯(ps)、聚(四氢呋喃)(pthf)、聚(邻苯二甲醛)(ppa)、聚(己基紫精)(phv)、聚(l-赖氨酸)(pll)、聚(l-精氨酸)(parg)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(plga)。
[0115]
许多化学刺激可以用于触发珠的破坏、溶解或降解。这些化学改变的实例可以包括但不限于ph介导的珠壁改变、经由交联键的化学裂解使珠壁崩解、珠壁的触发解聚和珠
壁转换反应。批量(bulk)改变也可以用于触发珠的破坏。
[0116]
通过各种刺激对微胶囊的批量或物理改变在设计胶囊以释放试剂方面也提供了许多优点。在宏观尺度上发生批量或物理改变，其中珠破裂是由刺激引起的机械-物理力的结果。这些过程可以包括但不限于压力引起的破裂、珠壁熔化或珠壁的孔隙率的改变。
[0117]
生物刺激也可以用于触发珠的破坏、溶解或降解。通常，生物触发物类似于化学触发物，但是许多实例使用生物分子或生命系统中常见的分子，诸如酶、肽、糖、脂肪酸、核酸等。例如，珠可以包含具有对特定蛋白酶的裂解敏感的肽交联的聚合物。更特别地，一种实例可以包括包含gflgk肽交联的微胶囊。在添加生物触发物(诸如蛋白酶组织蛋白酶b)后，壳壁的肽交联被裂解并且珠的内容物被释放。在其他情况下，蛋白酶可以是热激活的。在另一种实例中，珠包括包含纤维素的壳壁。壳聚糖水解酶的添加用作纤维素键裂解、壳壁解聚及其内部内容物释放的生物触发物。
[0118]
还可以在施加热刺激后诱导珠释放其内容物。温度的改变可以引起珠的各种改变。热量的变化可以引起珠熔化，使得珠壁崩解。在其他情况下，热量可以增加珠的内部组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。在又其他的情况下，热量可以使珠转化成收缩的脱水状态。热量还可以作用于珠壁内的热敏聚合物，从而引起珠的破坏。
[0119]
将磁性纳米颗粒包括在微胶囊的珠壁中可以允许珠的触发破裂以及将珠引导成阵列。本公开内容的装置可以包括用于任一目的的磁珠。在一个实例中，将fe3o4纳米颗粒掺入含聚电解质的珠中在存在振荡磁场刺激的情况下触发破裂。
[0120]
珠也可以由于电刺激的结果被破坏、溶解或降解。与先前部分中描述的磁性颗粒类似，电敏珠可以允许珠的触发破裂以及其他功能，诸如电场中的对齐、电导率或氧化还原反应。在一种实例中，含电敏材料的珠在电场中对齐，从而可以控制内部试剂的释放。在其他实例中，电场可以在珠壁本身内引起氧化还原反应，这可以增加孔隙率。
[0121]
也可以使用光刺激来破坏珠。许多光触发物是可能的，并且可以包括使用各种分子(诸如能够吸收特定波长范围的光子的纳米颗粒和发色团)的系统。例如，金属氧化物涂层可以用作胶囊触发物。涂覆有sio2的聚电解质胶囊的uv照射可以导致珠壁的崩解。在又另一种实例中，可以将可光切换材料(诸如偶氮苯基团)掺入珠壁中。在施加uv或可见光后，诸如这些的化学物质在吸收光子后经历可逆的顺式至反式异构化。在此方面，掺入光子开关(photon switch)产生在施加光触发物后可以崩解或变得更多孔的珠壁。
[0122]
例如，在图2中图示的条形码化(例如，随机条形码化)的非限制性实例中，在框208处将细胞(诸如单细胞)引入微孔阵列的多于一个微孔上之后，在框212处可以将珠引入微孔阵列的多于一个微孔上。每个微孔可以包含一个珠。珠可以包含多于一个条形码。条形码可以包含附接至珠的5’胺区域。条形码可以包含通用标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶结合区或其任何组合。
[0123]
本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。与固体支持物关联的条形码可各自包含选自以下组的条形码序列，该组包括至少100种或1000种具有独特序列的条形码序列。在一些实施方案中，与固体支持物关联的不同条形码可以包含具有不同序列的条形码。在一些实施方案中，与固体支持物关联的条形码的一定百分比包含相同的细胞标记。例如，所述百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。作为另一个实
例，所述百分比可以是至少以下或可以是至多以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，与固体支持物关联的条形码可以具有相同的细胞标记。与不同固体支持物关联的条形码可以具有选自以下组的不同的细胞标记，该组包括至少100种或1000种具有独特序列的细胞标记。
[0124]
本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。在一些实施方案中，可以用包括与多于一个条形码关联的多于一个合成颗粒的固体支持物将样品中的多于一个靶条形码化。在一些实施方案中，固体支持物可以包括与多于一个条形码关联的多于一个合成颗粒。不同固体支持物上的多于一个条形码的空间标记可以相差至少一个核苷酸。固体支持物可以例如在二维或三维包括多于一个条形码。合成颗粒可以是珠。珠可以是硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、dynabead、sephadex/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。固体支持物可以包括聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物可以自由浮动。在一些实施方案中，固体支持物可以包埋到半固体或固体阵列中。条形码可以不与固体支持物关联。条形码可以是单独的核苷酸。条形码可以与基底关联。
[0125]
如本文使用的，术语“拴系的”、“附接的”和“固定的”可以互换使用，并且可以指用于将条形码附接至固体支持物的共价或非共价方式。可以将各种不同的固体支持物中的任何一种用作固体支持物，以用于附接预先合成的条形码或用于条形码的原位固相合成。
[0126]
在一些实施方案中，固体支持物是珠。珠可以包括一种或更多种类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座、圆柱体或可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)的其他类似配置。珠可以由例如塑料、陶瓷、金属、聚合物材料或其任何组合构成。珠可以是或包括球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。在一些实施方案中，珠的形状可以是非球形的。
[0127]
珠可以包括各种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如，镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如，铁氧体(fe3o4；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁材料(例如，铁、镍、钴，它们的一些合金，以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙，或其任何组合。
[0128]
在一些实施方案中，珠(例如，标记所附接的珠)是水凝胶珠。在一些实施方案中，珠包括水凝胶。
[0129]
本文公开的一些实施方案包括一个或更多个颗粒(例如，珠)。每个颗粒可以包含多于一个寡核苷酸(例如，条形码)。多于一个寡核苷酸中的每一个可以包含条形码序列(例如，分子标记序列)、细胞标记和靶结合区(例如，寡(dt)序列、基因特异性序列、随机多聚体或其组合)。多于一个寡核苷酸的每一个的细胞标记序列可以是相同的。不同颗粒上的寡核苷酸的细胞标记序列可以是不同的，使得可以鉴定不同颗粒上的寡核苷酸。在不同实施方式中，不同细胞标记序列的数目可以是不同的。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是以下或可以是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109、这些值中的任何两个值之间的数字或范围或更多。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是至少以下或可以是至多以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、
10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108或109。在一些实施方案中，多于一个颗粒中的不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个颗粒包括具有相同细胞序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，包括具有相同细胞序列的寡核苷酸的多于一个颗粒可以是至多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在一些实施方案中，多于一个颗粒全都不具有相同的细胞标记序列。
[0130]
在每个颗粒上的多于一个寡核苷酸可以包含不同的条形码序列(例如，分子标记)。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是以下或可以是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是至少以下或可以是至多以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108或109。例如，多于一个寡核苷酸中的至少100种包含不同的条形码序列。作为另一种实例，在单个颗粒中，多于一个寡核苷酸中的至少100种、500种、1000种、5000种、10000种、15000种、20000种、50000种、这些值中的任何两个值之间的数字或范围或更多种包含不同的条形码序列。一些实施方案提供了多于一个包含条形码的颗粒。在一些实施方案中，待标记的靶和不同条形码序列的出现(或拷贝或数目)的比例可以是至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或更高。在一些实施方案中，多于一个寡核苷酸的每一个还包含样品标记、通用标记或二者。颗粒可以是例如纳米颗粒或微米颗粒。
[0131]
珠的尺寸可以不同。例如，珠的直径范围可以为从0.1微米至50微米。在一些实施方案中，珠的直径可以是以下或可以是约以下：0.1微米、0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。
[0132]
珠的直径可以与基底的孔的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短以下或者约以下：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。珠的直径可以与细胞(例如，被基底的孔捕获的单细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。珠的直径可以与细胞(例如，被基底的孔捕获的单细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短以下或约以下：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％。
[0133]
珠可以附接至基底和/或包埋到基底中。珠可以附接至凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质和/或包埋到凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质中。珠在基底(例如凝胶、基质、支架或聚
合物)中的空间位置可以使用珠上的条形码上存在的空间标记来鉴定，该空间标记可以用作位置地址。
[0134]
珠的实例可以包括但不限于链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、微珠、抗体缀合的珠(例如，抗免疫球蛋白微珠)、蛋白a缀合的珠、蛋白g缀合的珠、蛋白a/g缀合的珠、蛋白l缀合的珠、寡(dt)缀合的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠和bcmag
tm
羧基封端磁珠。
[0135]
珠可以与量子点或荧光染料关联(例如，用量子点或荧光染料浸渍)，以使其在一个荧光光学通道或多于一个光学通道中发荧光。珠可以与氧化铁或氧化铬关联，使其成为顺磁性或铁磁性。珠可以是可鉴定的。例如，可以使用照相机对珠成像。珠可以具有与珠关联的可检测代码。例如，珠可以包含条形码。珠可以改变尺寸，例如由于在有机溶液或无机溶液中溶胀。珠可以是疏水的。珠可以是亲水的。珠可以是生物相容的。
[0136]
固体支持物(例如，珠)可以被可视化。固体支持物可以包含可视化标签(例如，荧光染料)。固体支持物(例如，珠)可以蚀刻有标识符(例如，数字)。标识符可以通过对珠成像来可视化。
[0137]
固体支持物可以包括可溶性、半溶性或不溶性材料。当固体支持物包括接头、支架、构建模块(building block)或其他与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“官能化的”，而当固体支持物缺少这种与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“非官能化的”。固体支持物可以以溶液中游离，诸如在微量滴定孔中的形式；以流通形式，诸如在柱中；或以浸量尺(dipstick)使用。
[0138]
固体支持物可以包括膜、纸(paper)、塑料、涂覆表面、平坦表面、玻璃、载玻片、芯片或其任何组合。固体支持物可以采取树脂、凝胶、微球或其他几何配置的形式。固体支持物可以包括二氧化硅芯片、微米颗粒、纳米颗粒、板、阵列、毛细管、平坦支持物诸如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、硅和铜)、玻璃支持物、塑料支持物、硅支持物、芯片、过滤器、膜、微孔板、载玻片、塑料材料包括多孔板或膜(例如，由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯形成)，和/或晶片、梳、针或针头(例如，适于组合合成或分析的针阵列)或珠，平坦表面诸如晶片(例如，硅晶片)的凹陷或纳升孔阵列，具有凹陷的晶片(具有或不具有过滤器底部)。
[0139]
固体支持物可以包括聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)。聚合物基质可以能够渗透细胞内空间(例如，细胞器周围)。聚合物基质可以能够被泵送到整个循环系统。
[0140]
基底和微孔阵列
[0141]
如本文使用的，基底可以指固体支持物类型。基底可以指可以包含本公开内容的条形码或随机条形码的固体支持物。基底可以例如包括多于一个微孔。基底可以例如是包括两个或更多个微孔的孔阵列。在一些实施方案中，微孔可以包括定义体积的小的反应室。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个细胞。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个细胞。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个固体支持物。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个固体支持物。在一些实施方案中，微孔捕获单细胞和单个固体支持物(例如，珠)。微孔可以包含本公开内容的条形码试剂。
[0142]
条形码化的方法
[0143]
本公开内容提供了用于估计身体样品(例如，组织、器官、肿瘤、细胞)中不同位置
处的不同靶的数目的方法。该方法可以包括将条形码(例如，随机条形码)紧密接近样品放置，裂解样品，将不同的靶与条形码关联，对靶进行扩增和/或对靶进行数字计数。该方法还可以包括对从条形码上的空间标记获得的信息进行分析和/或将所述信息可视化。在一些实施方案中，该方法包括使样品中的多于一个靶可视化。将多于一个靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在将样品中的多于一个靶条形码化(例如，随机条形码化)之前或之后产生二维映射图和三维映射图。将样品中的多于一个靶可视化可以包括将多于一个靶映射到样品的映射图上。将多于一个靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在对样品中的多于一个靶进行条形码化之前或之后产生二维映射图和三维映射图。在一些实施方案中，可以在裂解样品之前或之后产生二维映射图和三维映射图。在产生二维映射图或三维映射图之前或之后裂解样品可以包括加热样品、使样品与去污剂接触、改变样品的ph或其任何组合。
[0144]
在一些实施方案中，将多于一个靶条形码化包括将多于一个条形码与多于一个靶杂交以产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)。将多于一个靶条形码化可以包括产生条形码化靶的索引文库。产生条形码化靶的索引文库可以用包含多于一个条形码(例如，随机条形码)的固体支持物来进行。
[0145]
使样品和条形码接触
[0146]
本公开内容提供了用于使样品(例如，细胞)与本公开内容的基底接触的方法。可以使包括例如细胞、器官或组织薄切片的样品与条形码(例如，随机条形码)接触。细胞可以例如通过重力流来接触，其中可以使细胞沉淀并且产生单层。样品可以是组织薄切片。可以将薄切片放置于基底上。样品可以是一维的(例如，形成平坦表面)。可以使样品(例如，细胞)分散遍及基底，例如，通过在基底上生长/培养细胞。
[0147]
当条形码紧密接近靶时，靶可以与条形码杂交。条形码可以按不可耗尽的比例接触，使得每一种不同的靶可以与本公开内容的不同条形码关联。为了确保靶与条形码之间的有效关联，可以将靶与条形码交联。
[0148]
细胞裂解
[0149]
在细胞和条形码的分配之后，可以将细胞裂解以释放靶分子。细胞裂解可以通过各种手段中的任何一种来完成，例如通过化学或生化手段，通过渗透冲击，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解的手段。可以通过添加包含去污剂(例如，sds、十二烷基硫酸锂、triton x-100、tween-20或np-40)、有机溶剂(例如，甲醇或丙酮)或消化酶(例如，蛋白酶k、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合的细胞裂解缓冲液来裂解细胞。为了增加靶与条形码的关联，可以通过例如降低裂解物的温度和/或增加裂解物的粘度来改变靶分子的扩散速率。
[0150]
在一些实施方案中，可以使用滤纸来裂解样品。可以在滤纸上部用裂解缓冲液浸泡滤纸。可以将滤纸用压力施加至样品，这可以促进样品的裂解以及样品的靶与基底的杂交。
[0151]
在一些实施方案中，裂解可以通过机械裂解、热裂解、光学裂解和/或化学裂解来进行。化学裂解可以包括使用消化酶，诸如蛋白酶k、胃蛋白酶和胰蛋白酶。裂解可以通过将裂解缓冲液添加至基底来进行。裂解缓冲液可以包含tris hcl。裂解缓冲液可以包含至少约0.01m、0.05m、0.1m、0.5m或1m或更多的tris hcl。裂解缓冲液可以包含至多约0.01m、
0.05m、0.1m、0.5m或1m或更多的tris hcl。裂解缓冲液可以包含约0.1m tris hcl。裂解缓冲液的ph可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。裂解缓冲液的ph可以是至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液的ph是约7.5。裂解缓冲液可以包含盐(例如，licl)。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至少约0.1m、0.5m或1m或更高。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至多约0.1m、0.5m或1m或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的盐浓度是约0.5m。裂解缓冲液可以包含去污剂(例如，sds、十二烷基硫酸锂、triton x、tween、np-40)。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至少约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至多约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的去污剂浓度是约1％的十二烷基硫酸锂。裂解方法中使用的时间可以取决于所使用的去污剂的量。在一些实施方案中，使用的去污剂越多，裂解所需的时间越少。裂解缓冲液可以包含螯合剂(例如，edta、egta)。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至少约1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm或30mm或更高。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至多约1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm或30mm或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的螯合剂浓度是约10mm。裂解缓冲液可以包含还原剂(例如，β-巯基乙醇、dtt)。裂解缓冲液中的还原剂浓度可以是至少约1mm、5mm、10mm、15mm或20mm或更高。裂解缓冲液中的还原剂浓度可以是至多约1mm、5mm、10mm、15mm或20mm或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的还原剂浓度是约5mm。在一些实施方案中，裂解缓冲液可以包含约0.1m tris hcl，约ph 7.5，约0.5m licl，约1％十二烷基硫酸锂，约10mm edta和约5mm dtt。
[0152]
裂解可以在约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃的温度进行。裂解可以进行约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟或20分钟或更长时间。裂解的细胞可以包括至少约100000个、200000个、300000个、400000个、500000个、600000个或700000个或更多个靶核酸分子。裂解的细胞可以包括至多约100000个、200000个、300000个、400000个、500000个、600000个或700000个或更多个靶核酸分子。
[0153]
将条形码附接至靶核酸分子
[0154]
在细胞裂解和核酸分子从细胞释放之后，核酸分子可以与共定位的固体支持物的条形码随机关联。关联可以包括使条形码的靶识别区与靶核酸分子的互补部分杂交(例如，条形码的寡(dt)可以与靶的多(a)尾相互作用)。可以选择用于杂交的测定条件(例如，缓冲液ph、离子强度、温度等)以促进形成特定的稳定的杂交体。在一些实施方案中，可以将从裂解的细胞释放的核酸分子与基底上的多于一个探针关联(例如，与基底上的探针杂交)。当探针包含寡(dt)时，可以将mrna分子与探针杂交并且逆转录。寡核苷酸的寡(dt)部分可以充当用于cdna分子的第一链合成的引物。例如，在图2中图示的条形码化的非限制性实例中，在框216处，mrna分子可以与珠上的条形码杂交。例如，单链的核苷酸片段可以与条形码的靶结合区杂交。
[0155]
附接还可以包括将条形码的靶识别区与靶核酸分子的一部分连接。例如，靶结合区可以包含可以能够与限制性位点突出端(例如，ecori粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。测定程序还可以包括用限制性酶(例如，ecori)处理靶核酸以产生限制性位点突出端。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。连接酶
(例如，t4 dna连接酶)可以用于连接两个片段。
[0156]
例如，在图2中图示的条形码化的非限制性实例中，在框220处，随后可以将来自多于一个细胞(或多于一个样品)的标记的靶(例如，靶-条形码分子)汇集至例如管中。标记的靶可以通过例如回收(retrieving)条形码和/或附接靶-条形码分子的珠来汇集。
[0157]
可以通过使用磁珠和外部施加的磁场来实现附接的靶-条形码分子的基于固体支持物的集合的回收。汇集靶-条形码分子后，所有进一步的处理可以在单个反应容器中进行。进一步的处理可以包括，例如，逆转录反应、扩增反应、裂解反应、解离反应和/或核酸延伸反应。进一步的处理反应可以在微孔内进行，即，不先汇集来自多于一个细胞的标记的靶核酸分子。
[0158]
逆转录或核酸延伸
[0159]
本公开内容提供了使用逆转录(例如，在图2的框224处)或核酸延伸来产生靶-条形码缀合物的方法。靶-条形码缀合物可以包含条形码以及靶核酸的全部或一部分的互补序列(即，条形码化的cdna分子，诸如随机条形码化的cdna分子)。关联的rna分子的逆转录可以通过添加逆转录引物连同逆转录酶而发生。逆转录引物可以是寡(dt)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。寡(dt)引物的长度可以是12-18个核苷酸或可以是约12-18个核苷酸，并且与哺乳动物mrna的3’端的内源多(a)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mrna结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mrna。
[0160]
在一些实施方案中，mrna分子向标记的rna分子的逆转录可以通过添加逆转录引物而发生。在一些实施方案中，逆转录引物是寡(dt)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。通常，寡(dt)引物的长度是12-18个核苷酸，并且与哺乳动物mrna的3’端的内源多(a)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mrna结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mrna。
[0161]
在一些实施方案中，靶是cdna分子。例如，可以使用逆转录酶诸如moloney鼠白血病病毒(mmlv)逆转录酶逆转录mrna分子，以产生具有多(dc)尾的cdna分子。条形码可以包括具有多(dg)尾的靶结合区。在条形码的多(dg)尾和cdna分子的多(dc)尾之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞rna分子转换到条形码，并继续向条形码的5’末端复制。通过这样做，得到的cdna分子在该cdna分子3’末端上含有条形码序列(诸如分子标记)。
[0162]
逆转录可以重复地发生以产生多于一个标记的cdna分子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次逆转录反应。该方法可以包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次逆转录反应。
[0163]
扩增
[0164]
可以进行一个或更多个核酸扩增反应(例如，在图2的框228处)以产生标记的靶核酸分子的多于一个拷贝。扩增可以以多重化方式进行，其中多于一个靶核酸序列同时进行扩增。扩增反应可以用于向核酸分子添加测序衔接子。扩增反应可以包括扩增样品标记(如果存在)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶核酸或其组合的至少一部分。扩增反应可以包括扩增多于一个核酸的
0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％或这些值中的任何两个值之间的范围或数字。该方法还可以包括进行一个或更多个cdna合成反应以产生包含样品标记、细胞标记、空间标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的靶-条形码分子的一个或更多个cdna拷贝。
[0165]
在一些实施方案中，扩增可以使用聚合酶链式反应(pcr)来进行。如本文使用的，pcr可以指用于通过dna的互补链的引物同时延伸使特定dna序列体外扩增的反应。如本文使用的，pcr可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于，rt-pcr、实时pcr、巢式pcr、定量pcr、多重化pcr、数字pcr以及组装pcr。
[0166]
标记的核酸的扩增可以包括非基于pcr的方法。非基于pcr的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(mda)、转录介导的扩增(tma)、基于核酸序列的扩增(nasba)、链置换扩增(sda)、实时sda、滚环扩增或环到环扩增。其他非基于pcr的扩增方法包括dna依赖性rna聚合酶驱动的rna转录扩增或rna指导的dna合成和转录的多于一个循环以扩增dna或rna靶、连接酶链式反应(lcr)、和qβ复制酶(qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(ram)。在一些实施方案中，扩增不产生环化转录物。
[0167]
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对标记的核酸(例如，标记的rna、标记的dna、标记的cdna)进行聚合酶链式反应以产生标记的扩增子(例如，随机标记的扩增子)。标记的扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链rna分子、双链dna分子或者与dna分子杂交的rna分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标记、空间标记、细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)。标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括dna、rna或其组合。本公开内容的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
[0168]
扩增可以包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(pna)、吗啉代和锁核酸(lna)以及乙二醇核酸(gna)与苏糖核酸(tna)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。
[0169]
进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包括例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可以包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可以包含少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的靶(例如，随机标记的靶)的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的靶的3’端或5’端。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的靶的内部区域。内部区域可以与多于一个标记的靶的3’末端距离至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、
900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种基因特异性引物。
[0170]
一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶或其任何组合。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一种或更多种靶。靶可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。靶可以包括一个或更多个样品中总标记靶的子集。一种或更多种引物可以包括至少96种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少960种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少9600种或更多种定制引物。一种或更多种定制引物可以退火至两种或更多种不同的标记的核酸。两种或更多种不同的标记的核酸可以对应于一种或更多种基因。
[0171]
可以在本公开内容的方法中使用任何扩增方案。例如，在一种方案中，第一轮pcr可以使用基因特异性引物和针对通用illumina测序引物1序列的引物来扩增附接至珠的分子。第二轮pcr可以使用侧翼为illumina测序引物2序列的巢式基因特异性引物和针对通用illumina测序引物1序列的引物扩增第一pcr产物。第三轮pcr添加p5和p7以及样品索引，以使pcr产物变成illumina测序文库。使用150bp
×
2测序的测序可以揭示读段1上的细胞标记和条形码序列(例如，分子标记)、读段2上的基因以及索引1读段上的样品索引。
[0172]
在一些实施方案中，可以使用化学裂解将核酸从基底去除。例如，存在于核酸中的化学基团或经修饰的碱基可以用于促进将核酸从固体支持物去除。例如，酶可以用于将核酸从基底去除。例如，通过限制性内切核酸酶消化可以将核酸从基底去除。例如，用尿嘧啶-d-糖苷酶(udg)处理含dutp或ddutp的核酸可以用于将核酸从基底去除。例如，可以使用进行核苷酸切除的酶(诸如，碱基切除修复酶，诸如无嘌呤/无嘧啶(apurinic/apyrimidinic，ap)内切核酸酶)将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可光裂解基团以及光将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可裂解接头将核酸从基底去除。例如，可裂解接头可以包括以下中的至少一种：生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、ig蛋白a、光不稳定型接头、酸或碱不稳定型接头基团或适配体。
[0173]
当探针是基因特异性时，可以将分子与探针杂交，并且逆转录和/或扩增。在一些实施方案中，在核酸已经合成(例如，逆转录)之后，核酸可以被扩增。扩增可以以多重方式进行，其中多种靶核酸序列同时扩增。扩增可以将测序衔接子添加至核酸。
[0174]
在一些实施方案中，可以例如用桥接扩增在基底上进行扩增。cdna可以加同聚物尾，以便产生相容末端，用于使用基底上的寡(dt)探针进行桥接扩增。在桥接扩增中，与模板核酸的3’末端互补的引物可以是共价地附接至固体颗粒的每对引物中的第一引物。当包含模板核酸的样品与颗粒接触并进行单个热循环时，可以将模板分子退火至第一引物，并且第一引物通过添加核苷酸而向前延长以形成双链体分子，所述双链体分子由模板分子和与模板互补的新形成的dna链构成。在下一循环的加热步骤中，双链体分子可以变性，从颗粒释放模板分子并且留下通过第一引物附接至颗粒的互补dna链。在随后的退火和延长步骤的退火阶段中，互补链可以与第二引物杂交，第二引物在从第一引物去除的位置处与互补链的区段互补。这种杂交可导致互补链在第一引物和第二引物之间形成桥，通过共价键
连接第一引物并通过杂交连接第二引物。在延长阶段，通过在同一反应混合物中添加核苷酸，第二引物可以在反向方向上延长，从而将桥转化为双链桥。然后开始下一个循环，并且双链桥可以变性以产生两个单链核酸分子，每个单链核酸分子具有的一个末端分别经由第一引物和第二引物附接至颗粒表面，其中每个单链核酸分子的另一个末端是未附接的。在这第二个循环的退火和延长步骤中，每条链可以与同一颗粒上先前未使用的另外的互补引物杂交，以形成新的单链桥。现在杂交的两个先前未使用的引物延长从而将两个新的桥转换成双链桥。
[0175]
扩增反应可以包括扩增多于一个核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。
[0176]
标记的核酸的扩增可以包括基于pcr的方法或非基于pcr的方法。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的指数式扩增。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的线性扩增。扩增可以通过聚合酶链式反应(pcr)来进行。pcr可以指用于通过dna的互补链的引物同时延伸使特定dna序列体外扩增的反应。pcr可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于，rt-pcr、实时pcr、巢式pcr、定量pcr、多重化pcr、数字pcr、抑制pcr、半抑制pcr以及组装pcr。
[0177]
在一些实施方案中，标记的核酸的扩增包括非基于pcr的方法。非基于pcr的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(mda)、转录介导的扩增(tma)、基于核酸序列的扩增(nasba)、链置换扩增(sda)、实时sda、滚环扩增或环到环扩增。其他非基于pcr的扩增方法包括dna依赖性rna聚合酶驱动的rna转录扩增或rna指导的dna合成和转录的多于一个循环以扩增dna或rna靶、连接酶链式反应(lcr)、qβ复制酶(qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和/或分支延伸扩增(ram)。
[0178]
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对扩增的扩增子(例如，靶)进行巢式聚合酶链式反应。扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链rna分子、双链dna分子或者与dna分子杂交的rna分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标签或分子标识符标记。可选地，扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括dna、rna或其组合。本发明的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
[0179]
在一些实施方案中，该方法包括反复扩增标记的核酸以产生多于一个扩增子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次扩增反应。可选地，方法包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次扩增反应。
[0180]
扩增还可以包括将一种或更多种对照核酸添加至一个或更多个包含多于一个核酸的样品中。扩增还可以包括将一种或更多种对照核酸添加至多于一个核酸。对照核酸可以包含对照标记。
[0181]
扩增可以包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定型和/或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于肽核酸(pna)、吗啉代和锁核
酸(lna)以及乙二醇核酸(gna)与苏糖核酸(tna)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。
[0182]
进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包括一种或更多种寡核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包含至少约7-9个核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包含少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的核酸的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的核酸的3’端和/或5’端。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的核酸的内部区域。内部区域可以与多于一个标记的核酸的3’末端距离至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种管家基因引物。一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标签、第二样品标签、分子标识符标记、核酸或其产物。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一种或更多种靶核酸。靶核酸可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。在一些实施方案中，引物是与本公开内容的阵列附接的探针。
[0183]
在一些实施方案中，将样品中的多于一个靶条形码化(例如，随机条形码化)还包括产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)或靶的条形码化片段的索引文库。不同的条形码的条形码序列(例如，不同的随机条形码的分子标记)可以彼此不同。产生条形码化靶的索引文库包括从样品中的多于一个靶产生多于一个索引多核苷酸。例如，对于包括第一索引靶和第二索引靶的条形码化靶的索引文库，第一索引多核苷酸的标记区与第二索引多核苷酸的标记区可以相差以下、相差约以下、相差至少以下或相差至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，产生条形码化靶的索引文库包括使多于一个靶(例如mrna分子)与包含多(t)区和标记区的多于一个寡核苷酸接触；以及使用逆转录酶进行第一链合成以产生单链标记的cdna分子(每一种包含cdna区和标记区)，其中多于一个靶包括至少两种不同序列的mrna分子，且多于一个寡核苷酸包括至少两种不同序列的寡核苷酸。产生条形码化靶的索引文库还可以包括扩增单链标记的cdna分子以产生双链标记的cdna分子；以及对双链标记的cdna分子进行巢式pcr以产生标记的扩增子。在一些实施方案中，该方法可以包括产生衔接子标记的扩增子。
[0184]
条形码化(例如，随机条形码化)可以包括使用核酸条形码或标签以标记个体核酸(例如，dna或rna)分子。在一些实施方案中，其涉及在从mrna产生cdna分子时将dna条形码或标签添加至cdna分子。可以进行巢式pcr以使pcr扩增偏倚最小化。可以添加用于测序(例如下一代测序(ngs))使用的衔接子。例如在图2的框232处，可以使用测序结果来确定靶的一个或更多个拷贝的细胞标记、分子标记和核苷酸片段的序列。
[0185]
图3是示出了产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)的索引文库，诸如条形码化的mrna或其片段的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。如步骤1中示出的，逆转录过程可以用独特分子标记序列、细胞标记序列和通用pcr位点对每个mrna分子进行编码。具体地，通过将一组条形码(例如，随机条形码)310与rna分子302的多(a)尾区308杂交(例如，随机杂交)，可以将rna分子302逆转录以产生标记的cdna分子304(包括cdna区306)。条形码310中的每一个可以包括靶结合区，例如多(dt)区312、标记区314(例如，条形码序列或分子)和通用pcr区316。
[0186]
在一些实施方案中，细胞标记序列可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，分子标记序列可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，多于一个随机条形码中的每一个还包括通用标记和细胞标记中的一种或更多种，其中通用标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码是相同的，并且细胞标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，细胞标记包含3个至20个核苷酸。
[0187]
在一些实施方案中，标记区314可以包含条形码序列或分子标记318和细胞标记320。在一些实施方案中，标记区314可以包括通用标记、维度标记和细胞标记中的一种或更多种。条形码序列或分子标记318的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记320的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。通用标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。通用标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码可以是相同的，并且细胞标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码是相同的。维度标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。
[0188]
在一些实施方案中，标记区314可以包括以下、可以包括约以下、可以包括至少以下或可以包括至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同标记，诸如条形码序列或分子标记318和细胞标记320。每一种标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。一组条形码或随机条形码310可以含有以下、可以含有约以下、可以含有至少以下或可以含有至多以下：10种、20种、40种、50种、70种、80种、90种、102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种、10
10
种、10
11
种、10
12
种、10
13
种、10
14
种、10
15
种、10
20
种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的条形码或随机条形码310。并且条形码或随机条形码310的组
可以例如，各自包含独特标记区314。标记的cdna分子304可以进行纯化以去除过量的条形码或随机条形码310。纯化可以包括ampure珠纯化。
[0189]
如步骤2中示出的，来自步骤1中的逆转录过程的产物可以汇集至1支管中，并且用第1pcr引物池和第1通用pcr引物进行pcr扩增。因为独特标记区314，汇集是可能的。特别地，可以将标记的cdna分子304扩增以产生巢式pcr标记的扩增子322。扩增可以包括多重pcr扩增。扩增可以包括以单一反应体积用96种多重引物进行的多重pcr扩增。在一些实施方案中，在单一反应体积中，多重pcr扩增可以利用、利用约、利用至少或利用至多10、20、40、50、70、80、90、102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
、10
20
个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的多重引物。扩增可以包括使用包括靶向特定基因的定制引物326a-c的第1pcr引物池324和通用引物328。定制引物326可以与标记的cdna分子304的cdna部分306’内的区域杂交。通用引物328可以与标记的cdna分子304的通用pcr区域316杂交。
[0190]
如图3的步骤3中示出的，来自步骤2中的pcr扩增的产物可以用巢式pcr引物池和第2通用pcr引物扩增。巢式pcr可以使pcr扩增偏倚最小化。特别地，巢式pcr标记的扩增子322可通过巢式pcr进行进一步扩增。巢式pcr可以包括在单个反应体积中用巢式pcr引物332a-c的巢式pcr引物池330和第2通用pcr引物328’进行的多重pcr。巢式pcr引物池330可以包含以下、可以包含约以下、可以包含至少以下或可以包含至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同的巢式pcr引物332。巢式pcr引物332可以包含衔接子334，并与标记的扩增子322的cdna部分306”内的区域杂交。通用引物328’可以包含衔接子336，并与标记的扩增子322的通用pcr区域316杂交。由此，步骤3产生衔接子标记的扩增子338。在一些实施方案中，巢式pcr引物332和第2通用pcr引物328’可以不包含衔接子334和衔接子336。而是，衔接子334和衔接子336可以连接至巢式pcr的产物以产生衔接子标记的扩增子338。
[0191]
如步骤4中示出的，可以使用文库扩增引物将来自步骤3的pcr产物进行pcr扩增用于测序。特别地，可以使用衔接子334和衔接子336对衔接子标记的扩增子338进行一个或更多个另外的测定。衔接子334和衔接子336可以与引物340和引物342杂交。一种或更多种引物340和引物342可以是pcr扩增引物。一种或更多种引物340和引物342可以是测序引物。一种或更多种衔接子334和衔接子336可以用于衔接子标记的扩增子338的进一步扩增。一种或更多种衔接子334和衔接子336可以用于对衔接子标记的扩增子338测序。引物342可以包含板索引344，使得使用同一组条形码或随机条形码310产生的扩增子可以使用下一代测序(ngs)在一个测序反应中测序。
[0192]
循环无细胞核酸与单细胞的组合分析
[0193]
在一些实施方案中，提供了用于外周血中循环无细胞核酸和单细胞(例如，免疫细胞、白细胞和ctc)的组合分析的方法和组合物，以用于改进非侵入性基于血液的肿瘤学诊断中的灵敏度和特异性。该方法可以包括单细胞和无细胞核酸的组合分析。本文提供的方法的一些实施方案可以将循环无细胞核酸与从外周血分离的单细胞的检测和分析进行组合。本文提供的公开内容包括利用从全血分离的血浆中提取的核酸以及来自同一样品的pbmc的完整细胞的方法，该方法可以改进中度风险群体(例如，老年群体)和高风险群体(环
境或遗传倾向)的早期检测/筛查、治疗监测和最小/分子残留病确定中的肿瘤学诊断应用的灵敏度和特异性。在一些实施方案中，通过表型和rna表达分析以及相关基因型的组合来从pbmc的细胞类型分类中获得特异性改进，以理解基线群体与患病群体。例如，在一些实施方案中，当与cfdna的批量测序(bulk sequencing)相比时，使用pbmc的单细胞测序使克隆性造血突变与真正的突变分层，以理解突变的细胞类型来源。在一些实施方案中，通过组合来自肿瘤的循环无细胞dna(circulating cell free dna)的能力和用高通量超高参数单细胞测定鉴定的循环肿瘤细胞中的dna的能力，获得灵敏度改进。
[0194]
虽然来自血浆的ccfdna是非侵入性综合基因组谱分析最常用的分析物，但是pbmc或肿瘤组织/til的单细胞分析仍处于探索模式。富集的ctc的单细胞分析在基于血液的肿瘤学诊断领域取得了一些进展，但由于(i)外周血循环中的丰度的差异和/或(ii)单细胞分析中的技术进步出现较慢，其与ccfdna相差甚远。本文提供了采用单细胞分析组合ccfdna分析来改进性能的方法。在一些实施方案中，该方法包括ctc分析与ccfdna和gdna分析的组合。在本文提供的一些实施方案中，其中在血液收集管中保存全细胞及其分析的方法也保存了无细胞核酸。本文提供的方法的一些实施方案可用于实体瘤液体活检的晚期和mrd应用。在一些这样的实施方案中，在标准液体活检测定中，存在相比于潜能未定克隆性造血突变或未知来源的突变纳入/排除真正的癌症相关突变的特异性改进。本文提供的方法的一些实施方案可用于从血液中早期检测和筛查癌症。在一些这样的实施方案中，方法为有平均风险的人提供了筛选应用所需的灵敏度改进。
[0195]
本文提供的组合分析方法可采用各种测序测定。在一些实施方案中，cfna包括ccfdna和/或ccfrna。方法可以包括单细胞rna测序、单细胞序列介导的蛋白谱分析和使用测序的转座酶可及染色质的单细胞测定(scatac-seq)中的一种或更多种。方法可以包括单细胞dna测序、蛋白谱分析(例如，序列介导的蛋白谱分析)和使用测序的转座酶可及染色质的单细胞测定(scatac-seq)中的一种或更多种。在一些实施方案中，富集选择的细胞类型(例如，t细胞、b细胞和/或循环肿瘤细胞)。本文提供的方法可以包括采用分子条形码化和测序作为读出，分离和分析来自分离自健康或患病个体的血浆的ccfdna和/或cfrna。在一些实施方案中，方法可以包括从健康或患病个体的pbmc分离单细胞，并通过dna基因分型、rna表达或采用单细胞鉴定、分子条形码化和测序作为读出的开放染色质评估来分析蛋白和基因表达。图4a-图4b描绘了用于鉴定受试者中癌症的存在、监测患有癌症的受试者中治疗性干预的效力以及检测正在接受癌症治疗的受试者中的微小残留病(mrd)的非限制性示例性工作流程。
[0196]
该方法可以包括单细胞和无细胞核酸的组合分析。该方法可以包括对健康个体或具有已知或未知疾病状态的个体进行血液收集。该方法可以包括单细胞(例如，ctc、免疫细胞)的富集。该方法可以包括单细胞工作流程和无细胞工作流程。单细胞工作流程可以包括分离外周有核完整细胞。单细胞工作流程可以包括分离分区(例如，孔或液滴)中的外周有核完整细胞，随后进行逆转录和条形码化。无细胞工作流程可以包括从耗尽完整细胞的血液分离血浆和ccfdna。该方法可以包括离心产生血浆和从血浆中提取核酸，随后通过条形码化进行文库制备，测序，并且然后进行分析。这两种工作流程都可以包括测定许多参数，包括但不限于基因表达、蛋白表达、剪接变体、基因融合、新同种型以及snp/插入缺失。本文提供的方法可以通过组合来自外周血的基于细胞的或基于无细胞的核酸的信号，产生用于
检测来自有症状或无症状个体的疾病的增加的灵敏度和/或特异性。
[0197]
本文提供的方法和组合物可以产生晚期特异性和/或灵敏度改进。方法可用于准确的mrd评估。方法可用于对中风险群体(大于预定年龄)与高风险群体进行的筛选应用。在一些实施方案中，方法产生特异性的改进，并且可以包括鉴定细胞类型和相关突变，以理解基线和患病者(例如，当与cfdna的批量测序相比时，使用pbmc/白细胞的单细胞测序使克隆性造血可以从真正的突变分层)。在一些实施方案中，方法产生灵敏度的改进，并且可以组合来自肿瘤的循环无细胞dna的能力和用高通量超高参数单细胞测定鉴定的循环肿瘤细胞中的dna的能力。在本文公开的方法的一些实施方案中，提供了在实体瘤中的晚期和mrd应用，并且可以在标准和液体活检测定中产生相比于chip或未知来源的突变纳入/排除真正的癌症相关突变的特异性改进。在一些实施方案中，利用所公开的方法实现为平均风险人群筛选应用所需的灵敏度改进。
[0198]
本文的公开内容包括鉴定受试者中癌症的存在的方法。在一些实施方案中，方法包括：从源自受试者的生物样品分离免疫细胞、白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从源自受试者的生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的免疫细胞、白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自序列读段的一种或更多种特性的值，其中一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于一种或更多种特性的值产生预测评分；当预测评分大于预定截止值时，鉴定受试者中癌症的存在。方法可以包括：从生物样品分离白细胞和ctc，任选地分离ctc包括捕获表达上皮细胞黏附分子(epcam)的细胞；以及从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生序列读段。
[0199]
本文的公开内容包括检测正在接受癌症治疗的受试者中的微小残留病(mrd)的方法。在一些实施方案中，方法包括：从源自受试者的生物样品分离免疫细胞、白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从源自受试者的生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的免疫细胞、白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自序列读段的一种或更多种特性的值，其中一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于一种或更多种特性的值产生mrd评分；以及当mrd评分大于预定截止值时，检测到受试者中的mrd。方法可以包括：从生物样品分离白细胞和ctc，任选地分离ctc包括捕获表达上皮细胞黏附分子(epcam)的细胞；以及从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生序列读段。
[0200]
本文的公开内容包括在患有癌症的受试者中监测治疗性干预的效力的方法。在一些实施方案中，方法包括：从分别在第一时间点和第二时间点源自受试者的第一生物样品和第二生物样品分离免疫细胞、白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从分别在第一时间点和第二时间点源自受试者的第一生物样品和第二生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的免疫细胞、白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自序列读段的一种或更多种特性的值，其中一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于在第一时间点和第二时间点的一种或更多
种特性的值产生效力评分；当效力评分低于预定截止值时，鉴定治疗性干预为有效。方法可以包括：从生物样品分离白细胞和ctc，任选地分离ctc包括捕获表达上皮细胞黏附分子(epcam)的细胞；以及从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生序列读段。
[0201]
生物样品可以包括血液样品。从源自受试者的生物样品分离白细胞和cfna可以包括：对血液样品进行密度梯度离心；从血液样品的血浆和/或血清级分获得cfna；以及从血液样品的血沉棕黄层级分获得完整白细胞。从生物样品分离ctc可以在进行密度梯度离心之前进行。白细胞可以包括外周血单个核细胞(pbmc)(例如，b细胞和t细胞)。方法可以包括：在从对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段之前，富集白细胞的一种或更多种细胞类型(例如，b细胞和/或t细胞)。方法可以包括：将白细胞和/或ctc中的每一个细胞分区至多于一个分区(例如，多于一个液滴或微孔阵列的微孔)。
[0202]
样品可以是从受试者分离的任何生物样品。样品可以是身体样品。样品可以包括身体组织，诸如已知或怀疑的实体瘤、全血、血小板、血清、血浆、粪便、红细胞、白血细胞或白细胞、内皮细胞、组织活检物、脑脊液、滑液、淋巴液、腹水、间质液或细胞外液、细胞之间的间隙中的流体(包括龈沟液)、骨髓、胸腔积液、脑脊液、唾液、粘液、痰、精液、汗液、尿液。样品优选为体液，特别是血液及其级分，以及尿液。样品可以是最初从受试者分离出来的形式，或者可以进行进一步处理以去除或添加组分，诸如细胞，或者相对于其他组分对一种组分进行富集。因此，用于分析的优选的体液是含有无细胞核酸的血浆或血清。可以从受试者分离或获得样品，并将其运送到样品分析地点。样品可以在合意的温度保存和运输，例如室温、4℃、-20℃和/或-80℃。样品可以在样品分析地点从受试者分离或获得。受试者可以是人类、哺乳动物、动物、伴侣动物、服务动物或宠物。受试者可以患有癌症。受试者可以没有癌症或可检测到的癌症症状。受试者可以已经用一种或更多种癌症疗法治疗过，例如，化学疗法、抗体、疫苗或生物制剂中的任一种或更多种。受试者可以处于缓解中。受试者可以被诊断或可以未被诊断为对癌症或任何癌症相关的遗传突变/紊乱易感。
[0203]
血浆的体积可以取决于对测序的区域期望的读段深度。示例性体积为0.4-40ml、5-20ml、10-20ml。例如，体积可以是0.5ml、1ml、5ml、10ml、20ml、30ml或40ml。取样的血浆的体积可以是5ml至20ml。
[0204]
样品可以包含来自不同来源的核酸，例如，来自同一受试者的细胞和无细胞的核酸，来自不同受试者的细胞和无细胞的核酸。样品可以包含携带突变的核酸。例如，样品可以包含携带种系突变和/或体细胞突变的dna。种系突变是指存在于受试者的种系dna中的突变。体细胞突变是指来源于受试者的体细胞例如癌细胞的突变。样品可以包含携带癌症相关突变(例如，癌症相关体细胞突变)的dna。样品可以包含表观遗传变体(即化学或蛋白修饰)，其中表观遗传变体与遗传变体(诸如癌症相关突变)的存在相关。在一些实施方案中，样品包含与遗传变体的存在相关的表观遗传变体，其中样品不包含所述遗传变体。
[0205]
扩增前样品中无细胞核酸的示例性量的范围为约1fg至约1μg，例如1pg至200ng、1ng至100ng、10ng至1000ng。例如，量可以是上至约600ng、上至约500ng、上至约400ng、上至约300ng、上至约200ng、上至约100ng、上至约50ng或上至约20ng的无细胞核酸分子。量可以是至少1fg、至少10fg、至少100fg、至少1pg、至少10pg、至少100pg、至少1ng、至少10ng、至少100ng、至少150ng或至少200ng的无细胞核酸分子。量可以是上至1飞克(fg)、10fg、100fg、1
皮克(pg)、10pg、100pg、1ng、10ng、100ng、150ng或200ng的无细胞核酸分子。该方法可以包括获得1飞克(fg)至200ng无细胞核酸分子。
[0206]
无细胞核酸是不包含在细胞内或以其他方式与细胞结合的核酸，或者换言之，在去除完整细胞后保留在样品中的核酸。无细胞核酸包括dna、rna及其杂合体(hybrid)，包括基因组dna、线粒体dna、sirna、mirna、循环rna(crna)、trna、rrna、小核仁rna(snorna)、piwi-相互作用rna(pirna)、长非编码rna(长ncrna)或这些中的任一种的片段。无细胞核酸可以是双链的、单链的，或它们的混杂物。无细胞核酸可以通过分泌或细胞死亡过程例如细胞坏死和凋亡释放到体液中。一些无细胞核酸是从癌细胞释放到体液中的，例如循环肿瘤dna(ctdna)。其他的从健康细胞释放。在一些实施方案中，cfdna是无细胞胎儿dna(cffdna)。在一些实施方案中，无细胞核酸由肿瘤细胞产生。在一些实施方案中，无细胞核酸由肿瘤细胞和非肿瘤细胞的混合物产生。
[0207]
无细胞核酸可以具有约100-500个核苷酸的示例性尺寸分布，其中110个至约230个核苷酸的分子占分子的约90％，具有约168个核苷酸的众数，并且第二个小峰在240个至440个核苷酸之间的范围内。
[0208]
无细胞核酸可以通过分级或分区步骤从体液分离，在所述分级或分区步骤中，存在于溶液中的无细胞核酸与体液中的完整细胞和其他不可溶组分分离。分区可以包括诸如离心或过滤的技术。可选地，体液中的细胞可以被裂解，并且无细胞核酸和细胞核酸被一起处理。通常，在添加缓冲液和洗涤步骤之后，核酸可以用醇沉淀。可以使用进一步的清洁步骤诸如基于二氧化硅的柱以去除污染物或盐。可以在整个反应中添加非特异性批量载体核酸(bulk carrier nucleic acid)，诸如c1dna、dna或蛋白，用于亚硫酸氢盐测序、杂交和/或连接，以优化程序的某些方面，诸如产量。
[0209]
在这样的处理后，样品可以包括各种形式的核酸，包括双链dna、单链dna和单链rna。在一些实施方案中，单链dna和rna可以被转化成双链形式，因此它们被包括在后续处理和分析步骤中。
[0210]
术语“循环肿瘤细胞”或“ctc”可以指在患有肿瘤的患者的循环中发现的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞(“ctc”)可以例如使用以商标vita-assays
tm
、vita-cap
tm
和出售(从vitatex，llc(johnson and johnson公司)商业可得的)的试剂盒和试剂进行纯化。描述了用于分离ctc的其他方法(参见例如pct公布第wo/2002/020825号，cristofanilli等人,new engl.j.of med.351(8):781-791(2004)，和adams等人,j.amer.chem.soc.130(27):8633-8641(2008年7月))；这些中每一个的内容通过引用以其整体并入本文。在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，使ctc与凝集素分子接触以用于分离。凝集素(例如mbl)与糖类(例如，甘露糖、n-乙酰葡糖胺和/或岩藻糖)相互作用。因此，在一些实施方案中，一些实施方案的ctc可以在其表面表达甘露聚糖(mannan)糖类、甘露糖、岩藻糖和/或n-乙酰葡糖胺。
[0211]
本文中使用的术语“无细胞dna”和“无细胞dna群体”应被赋予其普通含义，并且还应指最初可见于大型复杂生物有机体(例如，哺乳动物)的一个或更多个细胞中的dna，并从所述细胞释放到生物体中可见的液体流体(例如血浆、淋巴、脑脊液、尿液)中，其中所述dna可以通过获得流体样品而获得，无需进行体外细胞裂解步骤。
[0212]
白细胞和/或ctc中的每一个细胞可以包含多于一个核酸靶分子(例如，核糖核酸
(rna)、信使rna(mrna)、微rna、小干扰rna(sirna)、rna降解产物、各自包含多(a)尾的rna及其任何组合)。对多于一个分离的白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定可以包括：使用多于一个随机条形码对核酸靶分子进行随机条形码化以产生多于一个随机条形码化靶核酸分子。多于一个随机条形码中的每一个可以包含细胞标记和分子标记。多于一个随机条形码中的至少两个随机条形码的分子标记可以包含不同的分子标记序列。与同一细胞关联的随机条形码可以包含相同的细胞标记，并且与不同细胞关联的细胞标记可以包含不同的细胞标记。
[0213]
cfna可以包含循环肿瘤核酸(ctna)。cfna可以包含无细胞dna(cfdna)和/或无细胞rna(cfrna)。cfdna可以包括单链cfdna和双链cfdna。cfna可以包含至少两种形式的选自由双链cfdna、单链cfdna和单链cfrna组成的组的核酸。从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段可以包括：(a)将至少一种形式的核酸与至少一种标签核酸连接以将这些形式彼此区分；以及(b)扩增与至少一种核酸标签连接的至少一种形式的核酸，其中核酸和连接的核酸标签被扩增，以产生扩增的核酸，其中从至少一种形式扩增的核酸被加标签。方法可以包括：测定扩增的核酸的序列数据，扩增的核酸中的至少一些被加标签，其中测定获得足以解码扩增的核酸的标签核酸分子的序列信息，以揭示为与序列数据已被测定的标签核酸分子连接的扩增的核酸提供原始模板的群体中的核酸形式。
[0214]
在一些实施方案中，提供了用于分析复杂基因组材料，同时减少或消除最初存在于复杂基因组材料中的分子特征(例如，表观遗传或其他类型的结构)信息的损失的方法、试剂、组合物和系统。在一些实施方案中，分子标签可以用于追踪不同形式的核酸，并枚举这样的不同形式，以用于确定遗传修饰(例如，snv、插入缺失、基因融合和拷贝数变异)的目的。用于处理含有不同形式(例如，rna和dna，单链或双链)和/或修饰程度(例如，胞嘧啶甲基化、与蛋白关联)的核酸群体的系统、方法、组合物和试剂盒描述在美国专利公布第2019/0390253号中，其内容通过引用以其整体并入本文。本公开内容提供了处理含有不同形式的核酸群体的方法。如本文使用的，不同形式的核酸具有不同的特性。例如，并不限于，rna和dna是基于糖身份而不同的形式。单链(ss)和双链(ds)核酸的链数目不同。核酸分子可以基于表观遗传特征，诸如5-甲基胞嘧啶或与蛋白(诸如组蛋白)的关联而不同。核酸可以具有不同的核苷酸序列，例如，特定的基因或遗传基因座。特征可以在程度上有所不同。
[0215]
例如，dna分子可以在其表观遗传修饰程度方面不同。修饰程度可以指分子所经历的修饰事件的数目，诸如甲基化基团的数目(甲基化程度)或其他表观遗传变化。例如，甲基化的dna可以是低甲基化或高甲基化的。形式可以通过特征的组合，例如，单链-未甲基化或双链-甲基化来表征。基于一个特征或多于一个特征的组合的分子分级对于单个分子的多维分析可以是有用的。这些方法适用于样品中核酸的多于一种形式和/或修饰，从而可以获得多于一种形式的序列信息。方法还通过处理和分析保存了初始多于一种形式或修饰状态的身份，使得对核酸碱基序列的分析可以与表观遗传分析相组合。一些方法涉及对不同形式或修饰状态进行分离、加标签和随后的汇集，减少了分析样品中存在的多于一种形式所需的处理步骤的数目。
[0216]
甲基化谱分析可以包括确定遍及基因组的不同区域的甲基化模式。例如，在基于甲基化程度(例如，每个分子中甲基化位点的相对数目)对分子进行分区和测序之后，可以将不同分区中的分子的序列映射到参考基因组。这可以示出基因组中与其他区域相比甲基
化更高或甲基化更低的区域。这样，与单个分子相反，基因组区域的甲基化程度可以不同。
[0217]
方法可以包括：从对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段鉴定免疫组库的一种或更多种克隆型。方法可以包括：确定一个或更多个单个白细胞的b细胞受体(bcr)轻链和bcr重链。方法可以包括：确定一个或更多个单个白细胞的t细胞受体(tcr)α链和tcrβ重链。方法可以包括：确定一个或更多个单个白细胞的tcrγ链和tcrδ重链。在一些实施方案中，受试者在第一时间点和第二时间点之间接受至少一剂治疗性干预。第二时间点可以是第一时间点之后的约0.01天、0.1天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、110天、120天、128天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、200天、210天、220天、230天、240天、250天、260天、270天、280天、290天、300天、310天、320天、330天、340天、350天、360天、370天、380天、390天、400天、410天、420天、430天、440天、450天、460天、470天、480天、490天、500天、510天、520天、530天、540天、550天、560天、570天、580天、590天、600天、610天、620天、630天、640天、650天、660天、670天、680天、690天、700天、710天、720天、730天、740天、750天、760天、770天、780天、790天、800天、810天、820天、830天、840天、850天、860天、870天、880天、890天、900天、910天、920天、930天、940天、950天、960天、970天、980天、990天、1000天或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的天数。方法可以包括：施用一个或更多个另外剂量的治疗性干预，所述治疗性干预被鉴定为对受试者有效。方法可以包括：当治疗性干预被鉴定为具有差的效力时，将受试者鉴定为具有差的预后。差的预后可以包括较短的无进展存活期和/或较低的总存活期。预测评分可用于受试者癌症的诊断、预后、分层、风险评估和/或治疗性干预监测。
[0218]
测序测定可以包括单细胞(sc)测序测定。一种或更多种基因组特性可以源自一个或更多个包括亚硫酸氢盐测序测定、单细胞亚硫酸氢盐测序测定、使用测序的转座酶可及染色质测定(atac-seq)、单细胞(sc)atac-seq或其任何组合的测序测定。一种或更多种表达特性可以源自一个或更多个包括序列介导的蛋白谱分析、单细胞序列介导的蛋白谱分析、rna测序(rna-seq)、单细胞(sc)rna-seq或其任何组合的测序测定。一种或更多种变体特性可以源自包括条形码化的测序、随机测序、全基因组测序、靶向测序、下一代测序或其任何组合的测序测定。一种或更多种变体特性可以包括在多于一个基因座中的一个或更多个基因座处的单核苷酸多态性(snp)、插入或缺失(插入缺失)、拷贝数变体(cnv)、融合、剪接变体、同种型变体、颠换、易位、移码、复制、重复变体或其任何组合。一种或更多种基因组特性可以包括在多于一个基因座中的一个或更多个基因座处的染色质可及性、低甲基化和/或高甲基化。一种或更多种表达特性可以包括一种或更多种感兴趣的mrna的低表达、一种或更多种感兴趣的蛋白的低表达、一种或更多种感兴趣的mrna的过表达和/或一种或更多种感兴趣的蛋白的过表达。一种或更多种感兴趣的mrna和/或一种或更多种感兴趣的蛋白可以源自多于一个基因座中的一个或更多个基因座。多于一个基因座可以选自包含少于受试者基因组中所有基因座的预定基因座组。预定基因座组可以包含至少100个基因座。预定基因座组可以包含100至100,000个基因座、100至50,000个基因座、100至25,000个基因座、100至10,000个基因座、100至5000个基因座、100至2000个基因座、100至1000个基因座、500至100,000个基因座、500至50,000个基因座、500至25,000个基因座、500至10,000个基
因座、500至5000个基因座、500至2000个基因座、500至1000个基因座、1000至100,000个基因座、1000至50,000个基因座、1000至25,000个基因座、1000至10,000个基因座、1000至5000个基因座或1000至2000个基因座，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。预定基因座组可以是已知与癌症相关的。预定基因座组可以包含肿瘤抑制基因和/或癌基因。预定基因座组可以包含选自由以下组成的组的癌症相关基因：akt1、alk、apc、ar、araf、arid 1a、arid2、atm、b2m、bcl2、bcor、braf、brca1、brca2、card11、cbfb、ccnd1、cdh1、cdk4、cdkn2a、cic、crebbp、ctcf、ctnnb1、dicer 1、dis3、dnmt3a、egfr、eif1ax、ep300、erbb2、erbb3、ercc2、esr1、ezh2、fbxw7、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、flt3、foxa1、foxl2、foxol、fubp1、gat a3、gna11、gnaq、gnas、h3f3a、hist1h3b、hras、idh1、idh2、ikzf1、inppl1、jak1、kdm6a、keap1、kit、knstrn、kras、map2k1、mapk1、max、med 12、met、mlh1、msh2、msh3、msh6、mtor、myc、mycn、myd88、myod1、nf1、nfe2l2、notch1、nras、ntrk1、ntrk2、ntrk3、nup93、pak7、pdgfra、pik3ca、pik3cb、pik3r1、pik3r2、pms2、pole、ppp2r1a、ppp6c、prkci、ptch1、pten、ptpn11、rac1、raf1、rb1、ret、rhoa、rit1、ros1、rras2、rxra、setd2、sf3b1、smad3、smad4、smarca4、smarcb1、sos1、spop、stat3、stk11、stk19、tcf7l2、tert、tgfbr1、tgfbr2、tp53、tp63、tsc1、tsc2、u2af1、vhl和xpo1。产生源自序列读段的一种或更多种变体特性的值可以包括将序列读段的至少一部分与参考物的基因组进行比对。产生源自序列读段的一种或更多种表达特性的值可以包括与参考物的感兴趣的mrna表达水平和/或感兴趣的蛋白表达水平进行比较。产生源自序列读段的一种或更多种基因组特性的值可以包括与参考物的多于一个基因座中的一个或更多个基因座的甲基化状态和/或染色质可及性进行比较。参考物可以包括一个或更多个患有受试者被怀疑患有的相同癌症阶段、相同类型的癌症或两者的患者。参考物可以包括一个或更多个未受影响的个体。参考物可以包括在较早时间点从受试者获得的生物样品。参考物可以包括患有癌症的受试者、未患有癌症的受试者、患有i期癌症的受试者、患有ii期癌症的受试者、患有iii期癌症的受试者、患有iv期癌症的受试者或其任何组合。
[0219]
方法可以包括：将源自从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、潜能未定克隆性造血(chip)相关变体和/或未知来源的突变。方法可以包括：基于源自从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性的分类来调整预测评分、mrd评分和/或效力评分。chip相关变体可以包括在从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段和从对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段之间匹配的变体特征。真正的癌症相关变体可以包括在从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段和从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生的序列读段之间匹配的变体特征。真正的癌症相关变体可以包括在从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段和真正的癌症相关变体数据库之间匹配的变体特征。未知来源的突变可以包括在从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段、从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生的序列读段和从对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段之间不匹配的变体特征。方法可以包括：如果受试者被鉴定为具有真正的癌症相关变体，则施用靶向真正的癌症相关变体的疗法，以及如果没有鉴定出真正的癌症相关变体，则在不存在任何随访测试的情况下施用非靶向疗法。
[0220]
在本文提供的方法的一些实施方案中，(i)受试者尚未被确定患有癌症，(ii)受试者尚未被确定含有癌细胞，或和/或(iii)受试者没有表现出或尚未表现出与癌症相关的症状。癌症的存在可以在受试者未被诊断为ii期癌症、未被诊断为i期癌症、未进行活检以确认异常细胞生长、未进行活检以确认肿瘤的存在、未进行诊断扫描以检测癌症或其任何组合的时间段检测。受试者可以是基于以下因素中的一个或更多个具有患癌症的低风险、中风险或高风险的群体的成员：环境因素、年龄、性别、病史、药物、遗传因素、生化因素、生物物理因素、生理因素和/或职业因素。在一些实施方案中，受试者表现出一种或更多种癌症症状。受试者可以患有i期癌症、ii期癌症、iii期癌症和/或iv期癌症。癌症可以包括血液学癌症。癌症可以包括实体瘤。癌症可以包括至少一种选自由以下组成的组的肿瘤类型：胆道癌、膀胱癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、化生癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉病性结肠直肠癌、结肠直肠腺癌、胃肠道间质瘤(gist)、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食道癌、食管鳞状细胞癌、食道腺癌、眼黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾母细胞瘤(wilms tumor)、白血病、急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、慢性粒单核细胞白血病(cmml)、肝癌(liver cancer)、肝上皮癌(liver carcinoma)、肝细胞瘤(hepatoma)、肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、间皮瘤、b细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前体t淋巴母细胞淋巴瘤/白血病、外周t细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌(npc)、神经母细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状肿瘤、泡细胞癌、前列腺癌、前列腺腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、小肠癌、胃癌(stomach cancer)、胃上皮癌(gastric carcinoma)、胃肠间质瘤(gist)、子宫癌和子宫肉瘤。
[0221]
方法可以包括：向受试者施用治疗性干预。治疗性干预可以包括不同的治疗性干预、抗体、过继性t细胞疗法、嵌合抗原受体(car)t细胞疗法、抗体-药物缀合物、细胞因子疗法、癌症疫苗、检查点抑制剂、放射疗法、手术、化疗剂或其任何组合。治疗性干预可以在受试者患有早期癌症的时候施用，并且其中所述治疗性干预比如果治疗性干预在稍后时间向受试者施用更有效。
[0222]
如本文使用的“灵敏度”应被赋予其普通含义，并且还应指被测试总数中实际患有靶紊乱的真阳性的比例(即，具有阳性测试结果的靶紊乱患者的比例)。如本文使用的“特异性”应被赋予其普通含义，并且还应指被测试总数中实际未患有靶紊乱的真阴性的比例(即，具有阴性测试结果的没有靶紊乱的患者的比例)。如本文使用的术语“值”是指数据集中的条目，可以是表征该值所指的特征的任何内容。这包括但不限于数字、词语或短语、符号(例如，+或-)或程度。
[0223]
特异性、灵敏度和/或阳性预测值的预定截止值可以是以下或可以是约以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、
45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。特异性、灵敏度和/或阳性预测值的预定截止值可以是至少以下或可以是至多以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0224]
在一些实施方案中，特异性、灵敏度和/或癌症的存在、微小残留病的检测和/或治疗性干预值的效力的阳性预测值可以是以下或是约以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，特异性、灵敏度和/或癌症的存在、微小残留病的检测和/或治疗性干预值的效力的阳性预测值可以是至少以下或可以是至多以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0225]
癌症的存在、微小残留病的检测和/或治疗性干预的效力可以以比可比方法的灵敏度大至少1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围)的灵敏度在受试者中鉴定，所述可比方法不包括基于从源自对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性产生预测评分。癌症的
存在、微小残留病的检测和/或治疗性干预的效力可以以比可比方法的特异性大至少1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围)的特异性在受试者中鉴定，所述可比方法不包括基于从源自对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性产生预测评分。癌症的存在、微小残留病的检测和/或治疗性干预的效力可以以比可比方法的阳性预测值大至少1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围)的阳性预测值在受试者中鉴定，所述可比方法不包括基于从源自对多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性产生预测评分。
[0226]
癌症的存在、微小残留病的检测和/或治疗性干预的效力可以以比可比方法的灵敏度大至少1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围)的灵敏度在受试者中鉴定，所述可比方法不包括将源自从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、chip相关变体和/或未知来源的突变。癌症的存在、微小残留病的检测和/或治疗性干预的效力可以以比可比方法的特异性大至少1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围)的特异性在受试者中鉴定，所述可比方法不包括将源自从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、chip相关变体和/或未知来源的突变。癌症的存在、微小残留病的检测和/或治疗性干预的效力可以以比可比方法的阳性预测值大至少1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围)的阳性预测值在受试者中鉴定，所述可比方法不包括将源自从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、chip相关变体和/或未知来源的突变。
[0227]
蛋白谱分析和样品索引
[0228]
核酸靶可以包括核酸分子，诸如例如，核糖核酸(rna)、信使rna(mrna)、微rna、小干扰rna(sirna)、rna降解产物、包含多(a)尾的rna或其任何组合。核酸靶可以包括样品索引寡核苷酸。样品索引寡核苷酸可以包含样品索引序列。本文提供的多于一种样品索引组合物中的至少两种样品索引组合物的样品索引序列可以包括不同的序列。核酸靶可以包括细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸。细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸可以包含用于细胞组分结合试剂的独特标识符序列。在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，核酸靶是结合试剂寡核苷酸(例如，抗体寡核苷酸(“aboligo”或“abo”)、结合试剂寡核苷酸、细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸、样品索引寡核苷酸)。本文公开的一些实施方案提供了多于一种组合物，所述多于一种组合物各自包含与寡核苷酸(例如，结合试剂寡核苷酸)缀合的
细胞组分结合试剂(诸如蛋白结合试剂)，其中寡核苷酸包含用于与其缀合的细胞组分结合试剂的独特标识符。已在美国专利申请公布第us2018/0088112号和美国专利申请公布第us2018/0346970号中描述了细胞组分结合试剂(诸如条形码化抗体)及其用途(诸如细胞的样品索引)；这些中的每一项的内容通过引用以其整体并入本文。
[0229]
用于同时确定蛋白表达和基因表达以及用于样品索引的系统、方法、组合物和试剂盒也描述于2020年1月21日提交的题为“oligonucleotides associated with antibodies”的美国申请第16/747,737号中，其内容通过引用以其整体并入本文。在一些这样的实施方案中，与细胞组分结合试剂(例如，抗体)关联的寡核苷酸包含以下中的一种或更多种：独特分子标记序列、引物衔接子、抗体特异性条形码序列、对齐序列和/或多(a)序列。在一些实施方案中，寡核苷酸通过接头(例如，5ammc12)与细胞组分结合试剂关联。
[0230]
免疫组库谱分析
[0231]
本文的公开内容包括用于将具有分子标记(或分子索引)的条形码(例如，随机条形码)附接到被条形码化或被标记的核酸靶(例如，脱氧核糖核酸分子和核糖核酸分子)的5’末端的系统、方法、组合物和试剂盒。本文公开的基于5’的转录物计数方法可以互补或补充例如基于3’的转录物计数方法(例如，rhapsody
tm
测定(becton,dickinson and company,franklin lakes,nj)、chromium
tm
单细胞3’解决方案(10x genomics,san francisco,ca))。条形码化的核酸靶可用于序列鉴定、转录物计数、选择性剪接分析、突变筛选和/或以高通量方式进行全长测序。对5’末端(相对于被标记的靶核酸靶的5’)转录物计数可以揭示在核酸分子的5’末端或较靠近核酸分子的5’末端的选择性剪接同种型和变体(包括但不限于剪接变体、单核苷酸多态性(snp)、插入、缺失、取代)。在一些实施方案中，方法可以涉及分子内杂交。使用5’条形码化和/或3’条形码化确定核酸靶(例如，免疫受体的v(d)j区)的序列的方法在us2020/0109437中描述；该文献的内容通过引用以其整体并入本文。用于在核酸靶的5’末端上进行分子条形码化的系统、方法、组合物和试剂盒已在us2019/0338278中描述，其内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本文提供的用于基于5’的基因表达谱分析的系统、方法、组合物和试剂盒可以与基于随机引发和延伸(rpe)的全转录组分析方法和组合物一起使用，这些方法和组合物已经在us2020/0149037中描述，其内容通过引用以其整体并入本文。
[0232]
术语
[0233]
在至少一些先前描述的实施方案中，一种实施方案中使用的一个或更多个要素可以互换地用于另一种实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有此类修改和改变都旨在落在由所附权利要求书限定的主题的范围内。
[0234]
本领域的技术人员将理解，对于本文公开的这个和其他过程和方法，在该过程和方法中执行的功能可以以不同的顺序实现。此外，所概述的步骤和操作仅作为示例提供，并且该步骤和操作中的一些可以是任选的，组合成较少的步骤和操作，或者扩展成另外的步骤和操作，而不偏离所公开的实施方案的本质。
[0235]
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，在对于上下文和/或应用适当的情况下，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求书中使用的，单
数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。除非另外说明，否则在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
[0236]
本领域技术人员将理解，一般来说，本文使用的术语，并且尤其是所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中的术语，通常意在作为“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”，等等)。本领域技术人员将进一步理解，如果意图所介绍的权利要求陈述的特定数字，则这样的意图将明确地陈述于权利要求中，并且在这种陈述不存在的情况下，不存在这种意图。例如，作为对理解的帮助，以下所附权利要求书可以包含介绍性措辞“至少一种”和“一种或更多种”的使用，以介绍权利要求陈述。然而，此类措辞的使用不应解读为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍权利要求陈述会将任何包含此类介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制为包含仅一种此类陈述的实施方案，甚至当同一权利要求包括介绍性措辞“一种或更多种”或“至少一种”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如，“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一种”或“一种或更多种”)；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外，即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字，本领域技术人员将认识到，此类陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如，仅陈述“两种陈述”而没有其他修饰词意指至少两种陈述或两种或更多种陈述)。此外，在使用类似于“a、b和c等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意在为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有a、b和c中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的a，具有单独的b，具有单独的c，a和b一起，a和c一起，b和c一起，和/或a、b和c一起等的系统)。在使用类似于“a、b或c等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意在为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有a、b或c中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的a，具有单独的b，具有单独的c，a和b一起，a和c一起，b和c一起，和/或a、b和c一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“a或b”应被理解为包括“a”或“b”或“a和b”的可能性。
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此外，当本公开内容的特征或方面以马库什组(markush group)描述时，本领域技术人员将意识到，本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。
[0238]
如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，诸如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括该范围的任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使相同的范围能被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所陈述的数字，并且指可以随后分解为如上文讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个体的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。
[0239]
从前述内容，应当理解，本文出于说明的目的已经描述了本公开内容的各种实施
方案，并且可以在不脱离本公开内容的范围和精神的情况下进行各种修改。因此，本文公开的各种实施方案并不旨在进行限制，真正的范围和精神由以下权利要求来指示。