技术特征：
1.一种鉴定受试者中癌症的存在的方法，所述方法包括：从源自所述受试者的生物样品分离白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从源自所述受试者的生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自所述序列读段的一种或更多种特性的值，其中所述一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于所述一种或更多种特性的值产生预测评分；以及当所述预测评分大于预定截止值时，鉴定所述受试者中癌症的存在。2.一种检测正在接受癌症治疗的受试者中的微小残留病(mrd)的方法，所述方法包括：从源自所述受试者的生物样品分离白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从源自所述受试者的生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自所述序列读段的一种或更多种特性的值，其中所述一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于所述一种或更多种特性的值产生mrd评分；以及当所述mrd评分大于预定截止值时，检测到所述受试者中的mrd。3.一种在患有癌症的受试者中监测治疗性干预的效力的方法，所述方法包括：从分别在第一时间点和第二时间点源自所述受试者的第一生物样品和第二生物样品分离白细胞和/或循环肿瘤细胞(ctc)；从分别在所述第一时间点和所述第二时间点源自所述受试者的第一生物样品和第二生物样品分离无细胞核酸(cfna)；从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段；从对多于一个分离的白细胞和/或分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段；产生源自所述序列读段的一种或更多种特性的值，其中所述一种或更多种特性包括一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性；基于在所述第一时间点和所述第二时间点的所述一种或更多种特性的值产生效力评分；以及当所述效力评分低于预定截止值时，鉴定治疗性干预为有效。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法还包括：从所述生物样品分离白细胞和ctc，任选地分离ctc包括捕获表达上皮细胞黏附分子(epcam)的细胞；以及从对分离的ctc的一个或更多个测序测定产生序列读段。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括血液样品，并且其中从源自所述受试者的生物样品分离白细胞和cfna包括：
对所述血液样品进行密度梯度离心；从所述血液样品的血浆和/或血清级分获得所述cfna；以及从所述血液样品的血沉棕黄层级分获得完整的白细胞。6.根据权利要求4-5中任一项所述的方法，其中从所述生物样品分离ctc在进行密度梯度离心之前进行。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述白细胞包括外周血单个核细胞(pbmc)，任选地所述pbmc包括b细胞和t细胞。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，所述方法还包括在从对所述多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生序列读段之前，富集所述白细胞的一种或更多种细胞类型，任选地所述一种或更多种细胞类型包括b细胞和/或t细胞。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，所述方法包括将所述白细胞和/或ctc中的每一个细胞分区至多于一个分区，任选地所述多于一个分区包括多于一个液滴或微孔阵列的微孔。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述白细胞和/或ctc中的每一个细胞包含多于一个核酸靶分子，任选地所述核酸靶分子包括核糖核酸(rna)、信使rna(mrna)、微rna、小干扰rna(sirna)、rna降解产物、各自包含多(a)尾的rna及其任何组合。11.根据权利要求10所述的方法，其中对多于一个分离的白细胞和/或所述分离的ctc中的每一个的一个或更多个测序测定包括：使用多于一个随机条形码对所述核酸靶分子进行随机条形码化以产生多于一个随机条形码化靶核酸分子，其中所述多于一个随机条形码中的每一个包含细胞标记和分子标记，其中所述多于一个随机条形码中的至少两个随机条形码的分子标记包含不同的分子标记序列，其中与同一细胞关联的随机条形码包含相同的细胞标记，并且其中与不同细胞关联的细胞标记包含不同的细胞标记。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述cfna包含循环肿瘤核酸(ctna)。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述cfna包含无细胞dna(cfdna)和/或无细胞rna(cfrna)，任选地所述cfdna包括单链cfdna和双链cfdna。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述cfna包含至少两种形式的选自由双链cfdna、单链cfdna和单链cfrna组成的组的核酸。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中从对所述分离的cfna的一个或更多个测序测定产生序列读段包括：(a)将至少一种形式的核酸与至少一种标签核酸连接以将这些形式彼此区分；以及(b)扩增与至少一种核酸标签连接的所述至少一种形式的核酸，其中所述核酸和连接的核酸标签被扩增，以产生扩增的核酸，其中从所述至少一种形式扩增的核酸被加标签。16.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括测定所述扩增的核酸的序列数据，所述扩增的核酸中的至少一些被加标签，其中所述测定获得足以解码所述扩增的核酸的标签核酸分子的序列信息，以揭示为与序列数据已被测定的标签核酸分子连接的所述扩增的核酸提供原始模板的群体中的核酸形式。17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，所述方法包括从对所述多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段鉴定免疫组库的一种或更多
种克隆型。18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法包括确定一个或更多个单个白细胞的b细胞受体(bcr)轻链和bcr重链。19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，所述方法包括确定一个或更多个单个白细胞的t细胞受体(tcr)α链和tcrβ重链。20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，所述方法包括确定一个或更多个单个白细胞的tcrγ链和tcrδ重链。21.根据权利要求3-20中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述第一时间点和所述第二时间点之间已经接受了至少一个剂量的所述治疗性干预。22.根据权利要求3-21中任一项所述的方法，其中所述第二时间点在所述第一时间点之后约1天至约90天之间。23.根据权利要求3-22中任一项所述的方法，所述方法还包括施用一个或更多个另外剂量的所述治疗性干预，所述治疗性干预被鉴定为对所述受试者有效。24.根据权利要求3-23中任一项所述的方法，所述方法还包括当所述治疗性干预被鉴定为具有差的效力时，将所述受试者鉴定为具有差的预后，任选地所述差的预后包括较短的无进展存活期和/或较低的总存活期。25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述预测评分用于受试者中癌症的诊断、预后、分层、风险评估和/或治疗性干预监测。26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述测序测定包括单细胞(sc)测序测定。27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种基因组特性源自一个或更多个包括亚硫酸氢盐测序测定、单细胞亚硫酸氢盐测序测定、使用测序的转座酶可及染色质测定(atac-seq)、单细胞(sc)atac-seq或其任何组合的测序测定。28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种表达特性源自一个或更多个包括序列介导的蛋白谱分析、单细胞序列介导的蛋白谱分析、rna测序(rna-seq)、单细胞(sc)rna-seq或其任何组合的测序测定。29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种变体特性源自包括条形码化的测序、随机测序、全基因组测序、靶向测序、下一代测序或其任何组合的测序测定。30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种变体特性包括在多于一个基因座中的一个或更多个基因座处的单核苷酸多态性(snp)、插入或缺失(插入缺失)、拷贝数变体(cnv)、融合、剪接变体、同种型变体、颠换、易位、移码、复制、重复变体或其任何组合。31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种基因组特性包括在多于一个基因座中的一个或更多个基因座处的染色质可及性、低甲基化和/或高甲基化。32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种表达特性包括一种或更多种感兴趣mrna的低表达、一种或更多种感兴趣蛋白的低表达、一种或更多种感兴趣mrna的过表达和/或一种或更多种感兴趣蛋白的过表达，任选地所述一种或更多种感兴趣mrna和/或一种或更多种感兴趣蛋白源自多于一个基因座中的一个或更多个基因座。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述多于一个基因座选自包含少于所述受试者基因组中所有基因座的预定基因座组。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述预定基因座组包含至少100个基因座。35.根据权利要求33-34中任一项所述的方法，其中所述预定基因座组包含100至100,000个基因座、100至50,000个基因座、100至25,000个基因座、100至10,000个基因座、100至5000个基因座、100至2000个基因座、100至1000个基因座、500至100,000个基因座、500至50,000个基因座、500至25,000个基因座、500至10,000个基因座、500至5000个基因座、500至2000个基因座、500至1000个基因座、1000至100,000个基因座、1000至50,000个基因座、1000至25,000个基因座、1000至10,000个基因座、1000至5000个基因座或1000至2000个基因座。36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述预定基因座组是已知与癌症相关的，任选地所述预定基因座组包含肿瘤抑制基因和/或癌基因。37.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所述预定基因座组包含选自由以下组成的组的癌症相关基因：akt1、alk、apc、ar、araf、arid 1a、arid2、atm、b2m、bcl2、bcor、braf、brca1、brca2、card11、cbfb、ccnd1、cdh1、cdk4、cdkn2a、cic、crebbp、ctcf、ctnnb1、dicer 1、dis3、dnmt3a、egfr、eif1ax、ep300、erbb2、erbb3、ercc2、esr1、ezh2、fbxw7、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、flt3、foxa1、foxl2、foxol、fubp1、gat a3、gna11、gnaq、gnas、h3f3a、hist1h3b、hras、idh1、idh2、ikzf1、inppl1、jak1、kdm6a、keap1、kit、knstrn、kras、map2k1、mapk1、max、med 12、met、mlh1、msh2、msh3、msh6、mtor、myc、mycn、myd88、myod1、nf1、nfe2l2、notch1、nras、ntrk1、ntrk2、ntrk3、nup93、pak7、pdgfra、pik3ca、pik3cb、pik3r1、pik3r2、pms2、pole、ppp2r1a、ppp6c、prkci、ptch1、pten、ptpn11、rac1、raf1、rb1、ret、rhoa、rit1、ros1、rras2、rxra、setd2、sf3b1、smad3、smad4、smarca4、smarcb1、sos1、spop、stat3、stk11、stk19、tcf7l2、tert、tgfbr1、tgfbr2、tp53、tp63、tsc1、tsc2、u2af1、vhl和xpo1。38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中产生源自所述序列读段的一种或更多种变体特性的值包括将所述序列读段的至少一部分与参考物的基因组进行比对。39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中产生源自所述序列读段的一种或更多种表达特性的值包括与参考物的感兴趣的mrna表达水平和/或感兴趣的蛋白表达水平进行比较。40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中产生源自所述序列读段的一种或更多种基因组特性的值包括与参考物的多于一个基因座中的一个或更多个基因座处的甲基化状态和/或染色质可及性进行比较。41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述参考物包括一个或更多个患有所述受试者被怀疑患有的相同阶段的癌症、相同类型的癌症或两者的患者。42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述参考物包括一个或更多个未受影响的个体。43.根据权利要求38-42中任一项所述的方法，其中所述参考物包括在较早时间点从所述受试者获得的生物样品。44.根据权利要求38-43中任一项所述的方法，其中所述参考物包括患有癌症的受试
者、未患有癌症的受试者、患有i期癌症的受试者、患有ii期癌症的受试者、患有iii期癌症的受试者、患有iv期癌症的受试者或其任何组合。45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，所述方法包括将源自从对所述分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、潜能未定克隆性造血(chip)相关变体和/或来源未知的突变，任选地基于源自从对分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性的分类来调整预测评分、mrd评分和/或效力评分。46.根据权利要求45所述的方法，其中chip相关变体包括在从对所述分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段和从对所述多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段之间匹配的变体特征。47.根据权利要求45-46中任一项所述的方法，其中真正的癌症相关变体包括在从对所述分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段和从对所述分离的ctc的一个或更多个测序测定产生的序列读段之间匹配的变体特征。48.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中真正的癌症相关变体包括在从对所述分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段和真正的癌症相关变体数据库之间匹配的变体特征。49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中未知来源的突变包括在从对所述分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段、从对所述分离的ctc的一个或更多个测序测定产生的序列读段和从对所述多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段之间不匹配的变体特征。50.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，所述方法还包括：如果所述受试者被鉴定为具有所述真正的癌症相关变体，则施用靶向所述真正的癌症相关变体的疗法，以及如果没有鉴定出真正的癌症相关变体，则在不存在任何随访测试的情况下施用非靶向疗法。51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中：(i)受试者尚未被确定患有癌症，(ii)受试者尚未被确定含有癌细胞，和/或(iii)受试者未表现出或尚未表现出与癌症相关的症状。52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中癌症的存在在所述受试者未被诊断为ii期癌症、未被诊断为i期癌症、未进行活检以确认异常细胞生长、未进行活检以确认肿瘤的存在、未进行诊断扫描以检测癌症或其任何组合的时间段检测。53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述受试者是基于以下因素中的一个或更多个具有患癌症的低风险、中风险或高风险的群体的成员：环境因素、年龄、性别、病史、药物、遗传因素、生化因素、生物物理因素、生理因素和/或职业因素。54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述受试者表现出一种或更多种癌症症状。55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述受试者患有i期癌症、ii期癌症、iii期癌症和/或iv期癌症。56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中所述癌症包括血液学癌症。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述癌症包括至少一种选自由以下组成的组的肿瘤类型：胆道癌、膀胱癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、化生癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉病性结肠直肠癌、结肠直肠腺癌、胃肠道间质瘤(gist)、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食道癌、食管鳞状细胞癌、食道腺癌、眼黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾母细胞瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、慢性粒单核细胞白血病(cmml)、肝癌、肝上皮癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、间皮瘤、b细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前体t淋巴母细胞淋巴瘤/白血病、外周t细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌(npc)、神经母细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状肿瘤、泡细胞癌、前列腺癌、前列腺腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、小肠癌、胃癌、胃上皮癌、胃肠间质瘤(gist)、子宫癌和子宫肉瘤。59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用治疗性干预。60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中所述治疗性干预包括不同的治疗性干预、抗体、过继性t细胞疗法、嵌合抗原受体(car)t细胞疗法、抗体-药物缀合物、细胞因子疗法、癌症疫苗、检查点抑制剂、放射疗法、手术、化疗剂或其任何组合。61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述治疗性干预在所述受试者患有早期癌症的时候施用，并且其中所述治疗性干预比如果所述治疗性干预在稍晚时间向所述受试者施用更有效。62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述预定截止值具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的特异性。63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述预定截止值具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％的灵敏度。64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述预定截止值具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％的阳性预测值。65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中癌症的存在、最小残留病的检测和/或所述治疗性干预的效力以至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的特异性在所述受试者中鉴定。66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中癌症的存在、最小残留病的检测和/或所述治疗性干预的效力以至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的灵敏度在所述受试者中鉴定。67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中癌症的存在、最小残留病的检测和/或所述治疗性干预的效力以至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的阳性预测值在所述受试者中鉴定。68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中癌症的存在、最小残留病的检测和/
或所述治疗性干预的效力以比可比方法的灵敏度大至少1.1倍的灵敏度在所述受试者中鉴定，所述可比方法不包括基于源自从对所述多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性产生预测评分。69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中癌症的存在、最小残留病的检测和/或所述治疗性干预的效力以比可比方法的特异性大至少1.1倍的特异性在所述受试者中鉴定，所述可比方法不包括基于源自从对所述多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性产生预测评分。70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中癌症的存在、最小残留病的检测和/或所述治疗性干预的效力以比可比方法的阳性预测值大至少1.1倍的阳性预测值在所述受试者中鉴定，所述可比方法不包括基于源自从对所述多于一个分离的白细胞中的每一个的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性产生预测评分。71.根据权利要求45-70中任一项所述的方法，其中癌症的存在、最小残留病的检测和/或所述治疗性干预的效力以比可比方法的灵敏度大至少1.1倍的灵敏度在所述受试者中鉴定，所述可比方法不包括将源自从对所述分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、chip相关变体和/或未知来源的突变。72.根据权利要求45-71中任一项所述的方法，其中癌症的存在、最小残留病的检测和/或所述治疗性干预的效力以比可比方法的特异性大至少1.1倍的特异性在所述受试者中鉴定，所述可比方法不包括将源自从对所述分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、chip相关变体和/或未知来源的突变。73.根据权利要求45-72中任一项所述的方法，其中癌症的存在、最小残留病的检测和/或所述治疗性干预的效力以比可比方法的阳性预测值大至少1.1倍的阳性预测值在所述受试者中鉴定，所述可比方法不包括将源自从对所述分离的cfna的一个或更多个测序测定产生的序列读段的一种或更多种变体特性分类为真正的癌症相关变体、chip相关变体和/或未知来源的突变。
技术总结
本文的公开内容包括用于外周血中的循环无细胞核酸和单细胞的组合分析的系统、方法、组合物和试剂盒。该方法可以包括从源自受试者的生物样品(例如血液样品)分离无细胞核酸(cfNA)、免疫细胞、白细胞和/或循环肿瘤细胞(CTC)。该方法可以包括进行高通量单细胞测序测定。该方法可以包括基于从所述测序测定产生的序列读段产生一种或更多种基因组特性、一种或更多种表达特性和/或一种或更多种变体特性的值。可以基于所述特性的值来产生癌症预测评分、MRD评分和/或治疗效力评分。本文提供的方法可以产生非侵入性基于血液的肿瘤学诊断中的改进的灵敏度和特异性。的改进的灵敏度和特异性。
技术研发人员：斯蒂芬妮
受保护的技术使用者：贝克顿迪金森公司
技术研发日：2021.11.16
技术公布日：2023/7/19