微流控细胞培养装置

本发明总体上处于用于微流控细胞培养装置的制造过程和组件的领域。

背景技术：

1、微流控是指几何上限制到小尺度(通常亚毫米)的流体的行为、精确控制和操控。其属于涉及工程学、物理学、化学、生物化学、纳米技术和生物技术的多学科领域。微流控实际应用于处理低体积的流体以实现多路复用、自动化和高通量筛选的系统的设计中。

2、微流控细胞培养集成了来自生物学、生物化学、工程学和物理学的知识，以开发用于在微尺度上用细胞培养物进行培养、维护、分析和实验的装置和技术。其合并了微流控、用于操控人工制造的微系统中的小流体体积(μl、nl、pl)的技术集和细胞培养，所述细胞培养涉及细胞在控制的实验室环境中的生长和增殖。微流控已用于细胞生物学研究，因为微流控通道的尺寸非常适于细胞的物理尺度(微米数量级)。例如，真核细胞的线性尺寸介于10-100μm之间，这落入微流控尺寸的范围内。微流控细胞培养的关键组成部分是能够模拟细胞微环境，所述关键组成部分包含调节细胞结构、功能、行为和生长的可溶性因子。装置的另一个重要的组成部分是能够产生存在于体内的稳定生物分子梯度，因为这些梯度在了解对细胞的趋化、趋硬和趋触效应方面发挥着重要作用。传统的二维(2d)细胞培养是在平坦表面，例如孔板的底部上进行的细胞培养并且被称为常规方法。虽然这些平台可用于要用于随后的实验的生长细胞和增殖细胞，但其不是用于监测对刺激的细胞应答的理想环境，因为细胞不能自由地移动或执行在体内观察到的依赖于细胞-细胞外基质材料相互作用的功能。为了解决这个问题，已经开发了许多方法来创建三维(3d)天然细胞环境。由于通过软光刻的聚(二甲基硅氧烷)(pdms)微流控装置制造的到来，微流控装置已经取得进展，并且已被证明对模拟细胞培养的自然3d环境非常有益。

3、细胞生物学、微制造和微流控的最新进展已经实现了对人器官的功能单元的微工程化模型，即被称为片上器官(organ-on-a-chip，ooc)的开发，所述微工程化模型可以以较强的预测能力提供临床前测定的基础。早期的实施例已被描述和商业化。例如，griffith等人的美国专利第6,197,575号描述了适用于复杂分层组织或器官结构的接种、附接和培养的微基质和灌注组合件。inman等人的美国专利第8,318,479号描述了一种促进以适合于以多孔板格式培养和测定的毛细管床的长度尺度进行的灌注的系统。美国申请公开第us2016/0377599号和第us 2017/0227525 a1号描述了具有集成泵送、调平和感测的器官微生理系统。

4、被称为微生理系统(mps)的这些平台被设计成通过将组织工程化原理与微制造或微机加工技术整合来模拟生理功能以便概括3d多细胞相互作用和对营养物转运和/或机械刺激的动态调节(huh d等人,《芯片实验室(lab chip)》,12(12):2156-2164(2012)；sungjh等人《芯片实验室》13(7):1201-1212(2013)；wikswo jp等人,《实验生物学和医学(梅伍德)(exp biol med(maywood))》239(9):1061-1072(2014)；livingston ca等人,《计算和结构生物技术杂志(computational and structural biotechnology journal)》14:207-210(2016)；yu j等人,《今日药物发现(drug discovery today)》，19(10):1587-1594(2014)；zhu l等人《芯片实验室》16(20):3898-3908(2016))。虽然在单独mps(例如，心脏、肺部、肝脏、脑)的开发方面已取得显著进展(roth a等人,《先进药物输送评论(adv drug deliverrev)》,69-70:179-189(2014)；huebsch n等人《科学报告(scientific reports)》,6:24726(2016)；domansky k等人《芯片实验室》10(l):51-58(2010))，但是针对mps的互连所做出的努力仍处于初级阶段，其中大部分研究主要集中于基本活力和毒性展示(oleaga c等人《科学报告》6:20030(2016)；esch mb等人,《芯片实验室》14(16):3081-3092(2014)；maschmeyer i等人,《芯片实验室》15(12):2688-2699(2015)；mateme em等人《生物技术杂志(j biotechnol)》205:36-46(2015)；loskill p等人,《公共科学图书馆综合(plos one)》10(10):e0139587(2015))。然而，缺少临床疗效而不是毒性被鉴定为是ii期和iii期临床试验(成本最高的阶段)中药物损耗的主要原因(kubinyi h《自然综述：药物发现(nat revdrug discov)》，2(8):665-668(2003)；cook d等人《自然综述：药物发现》13(6):419-431(2014)；denayer t等人,《转化医学新视野(new horizons in translationalmedicine)》,2(1):5-11(2014))。主要促成因素包含不完全理解疾病机制、缺少预测性生物标志物以及种间差异。由于需要用于靶识别/验证和生物标志物发现的人源化模型系统，所以对在药物的迫切的需要未得到满足。

5、虽然毒理学和药效学研究是常见应用，但是药代动力学研究在多mps平台方面一直受到限制。此外，当前多mps系统可以采用与用于在非常小的流体体积的情况下进行操作的传统微流控芯片相关联的闭合格式(anna sl,《流体力学综述年刊(annu.rev.fluidmech.)》48,285-309(2016))。这些系统的当前制造过程需要使用可浇注弹性体聚合物(halldorsson s等人,《生物传感与生物电子(biosens.bioelectron.)》63,218—231(2015))。

6、国际专利申请第pct/us2019/030216号“用于片上器官平台的泵和硬件(pumpsand hardware for organ-on-chip platforms)”麻省理工学院(massachusettsinstitute of technology)描述了对流体处理的许多不同改进，包含泵、阀和用于控制和致动这些系统的装置。

7、用于制造这些装置的材料和新制造方法

8、与细胞培养相关的微流控装置的一些考虑事项包含：制造材料(例如，聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚苯乙烯)、散装材料特性(例如，光学澄清度、表面特性)、制造方法(例如，注射模制、热压印)、培养区域几何形状、递送和去除培养基的方法以及使用被动方法(例如，重力驱动的流、毛细管泵、基于拉普拉斯压力(laplace pressure)的“被动泵送”)或流量控制的装置(即，灌注系统)的流配置。微流控装置的灵活性通过对空间模式的经改进的控制极大地促进多元培养研究的发展。由pdms制成的闭合式通道系统是最常用的，因为pdms已在传统上实现了生物相容性微装置的快速原型化。例如，可以在基于液滴的微流控中通过共包封系统容易地达到经混合的共培养物，以研究旁分泌和近分泌信号传导。通过合并载有细胞的琼脂糖溶液的两个流将两种类型的细胞包封在液滴中。胶凝后，琼脂糖微凝胶用作用于细胞共培养物的3d微环境。使用微流控通道中的分离的共培养物以研究旁分泌信号传导。人肺泡上皮细胞和微血管内皮细胞可以在隔室化的pdms通道中共培养，所述通道被薄的多孔的且可拉伸的pdms膜分开以模拟肺泡-毛细血管屏障。

9、制造材料在细胞培养装置的设计中至关重要，因为并非所有聚合物都是生物相容性的，其中一些材料，如pdms，引起小分子的不期望的吸附或吸收。

10、此外，未固化的pdms寡聚物可能浸出到细胞培养基中，这可能会损害微环境。作为pdms的替代物，热塑性塑料(例如，聚苯乙烯、聚砜、pmma、coc)作为替代材料的用途已经取得进展。这些材料提供了良好的光学澄清度和小特征再现，不会折衷与小生物分子的相互作用。使用这些材料制造装置的能力构成了一些独特的挑战，这些挑战抑制了其在微流控界的普遍性。

11、制造方法在成功地制造微流控装置方面也是至关重要的。pdms装置通常是模制的并且与玻璃显微镜载玻片等离子体键合，这对于热塑性聚合物来说是不可行的过程。光学上澄清的热塑性微流控装置的层压通常需要昂贵的设备(例如，超声焊接、激光焊接)，并且所述层压倾向于具有低强度并且在装置与光学窗口之间具有不期望的键合。

12、对芯片上的流体压力和流速的控制对于模拟体内流控条件至关重要。这可以使用基于重力的流、片上泵或如注射器泵等外部泵进行。所有现有的泵送平台都允许对流体压力或流体流速进行控制。期望的是对微尺度装置中的流体压力和细胞的空间组织进行控制在很大程度上取决于细胞在体内执行功能的培养区域几何形状。例如，可能期望长的窄通道来培养神经元。灌注系统也可能影响所选择那种几何形状。例如，在并入注射器泵的系统中，将需要添加用于灌注入口、灌注出口、废物和细胞上样的通道以供细胞培养物维持。微流控细胞培养中的灌注对实现芯片上的长培养时间段和实现细胞分化非常重要。

13、因此，本发明的目的是提供用于制造具有经改进的光学澄清度、生物相容性和作为聚二甲基硅氧烷(pdms)的易于制造的替代物的集成柔性膜的热塑性微流控装置的新材料和方法。

14、本发明的另一个目的是提供对使用薄弹性体膜的微流控装置中的流体处理的改进。

15、本发明的另外的目的是提供用于微流控装置的气动致动泵使用的经改进的泵室和膈膜，所述泵室和膈膜诱导较低应变并且更准确。

16、本发明的另一个目的是提供增强流体密封压力的经优化的低体积阀几何形状。

17、本发明的仍另一个目的是提供用于在压力下储存流体体积的液压蓄积器，以及用于控制微流控通道中的系统压力的背压调节器。

18、本发明的仍另外的目的是提供在微流控装置中制造和使用含水凝胶的基质的经改进的方法，所述方法包含形成水凝胶并且用可移除结构以及利用各种类型的水凝胶支架来遏制水凝胶材料的方式。

19、本发明的另一个目的是提供可以同时控制多个微流控装置的细胞培养平台，所述细胞培养平台用于高通量研究。

20、本发明的另外的目的是提供具有高级控制特征和互连的一次性微流控芯片。

技术实现思路

1、制造微流控装置的材料和方法

2、已经开发了一种用于将由环烯烃共聚物制成的微流控装置与集成弹性体膜键合的方法，所述方法在不使用如聚二甲基硅氧烷(“pdms”)等材料的情况下实现了各种范围的微流控组件，包含泵、阀、蓄积器、压力调节器、氧合器和压力传感器。这些装置可以与电气动控制单元集成，以供高级过程控制下的高通量使用。所述过程将用于细胞培养应用的光学上澄清的耐溶剂的且生物相容的聚合物键合。这些装置的键合强度和光学特性远远超过其它材料，如pdma的粘合强度和光学特性。这些材料和方法可用于在整个系统中在受控的流速和过程的情况下通过泵、阀、压力调节器、蓄积器和片上感测元件制造微流控系统。

3、已经开发了制造供微流控装置使用的薄的薄膜的方法。在一个实施例中，已经开发了一种用于蚀刻弹性体聚合物薄膜的水辅助的激光机加工技术，所述技术使用水薄膜的毛细管作用以将切割的片固定在位。此方法还提供了用于控制激光机加工过程中的过量热的热沉层和ir吸收层。在另一种方法中，具有负向特征的多孔真空卡盘充当用于经热成形的弹性体膜的模具。

4、已经开发了一种用于容易地制造具有光学窗口的热塑性微流控芯片的自定义光学薄膜。所述薄膜由与弹性体coc的薄层键合在一起的高温度等级的coc上的可移除聚乙烯载体薄膜组成。弹性体coc受到由聚合物，如双轴定向的聚对苯二甲酸乙二醇酯)制成的载体薄膜保护。这种薄膜可以容易地在辊层压过程中层压，或者可以使用热压机或热板键合。这种薄膜可以在辊挤出过程中大量产生，并且可以使用常规激光制造技术切割成合适大小。

5、已经开发了一种用于将薄弹性体薄膜层压到微流控芯片上的自定义键合工艺。将薄膜放置在非相互作用载体薄膜，如用于薄膜粘合剂并且由平坦基板支撑的那些薄膜上。刚性组件与膜对齐并且穿过热层压机。载体薄膜和支撑结构的使用实现了与芯片的高强度键合，不会引起膜的热翘曲。

6、新的片上组件，其特征在于，弹性体膜工艺，或者可以使用热压机或热板键合。这种薄膜可以在辊挤出过程中大量产生，并且可以使用常规激光制造技术切割成合适大小。

7、已经开发了一种用于将薄弹性体薄膜层压到微流控芯片上的自定义键合工艺。将薄膜放置在非相互作用载体薄膜，如用于薄膜粘合剂并且由平坦基板支撑的那些薄膜上。刚性组件与膜对齐并且穿过热层压机。载体薄膜和支撑结构的使用实现了与芯片的高强度键合，不会引起膜的热翘曲。

8、具有弹性体膜的片上组件

9、已经开发了一种具有应力消除特征的弹性体膈膜，所述弹性膈膜用于微流控阀和泵膈膜。这种滚动膈膜滚动以经历高移位和有限的弹性变形。这些膈膜包含外部滚动膈膜、内部滚动膈膜、形状变化膈膜和侧向滚动膈膜。已经开发了具有经优化的泵室的膈膜微型泵，所述经优化的泵室确保可靠的移位和提高的可靠性。一个泵室的特征在于，滚动膈膜，并且一个泵室的特征在于，具有可预测的移位冲程的泵室。滚动膈膜泵室使用滚动膈膜来使室中的流体体积移位。膈膜可以使用压缩气体和真空来致动。另一种泵室设计是保证从泵室中的完全流体移位的经优化的形状。室几何形状被设计成围绕柔性膜在加压负载下的弹性响应，使得膜在泵冲程期间保持与泵室的接触环。这一特征消除了小袋流体被捕集在膈膜中的机会，并且确保可靠的移位体积。

10、在一优选实施例中，已经开发了一种具有应力消除特征的弹性体膈膜，所述弹性膈膜用于微流控阀和泵膈膜。这种滚动膈膜滚动以经历高移位和有限的弹性变形。这些膈膜包含外部滚动膈膜、内部滚动膈膜、形状变化膈膜和侧向滚动膈膜。已经开发了具有经优化的泵室的膈膜微型泵，所述经优化的泵室确保可靠的移位和提高的可靠性。一个泵室的特征在于，滚动膈膜，并且一个泵室的特征在于，具有可预测的移位冲程的泵室。滚动膈膜泵室使用滚动膈膜来使室中的流体体积移位。膈膜可以使用压缩气体和真空来致动。另一种泵室设计是保证从泵室中的完全流体移位的经优化的形状。室几何形状被设计成围绕柔性膜在加压负载下的弹性响应，使得膜在泵冲程期间保持与泵室的接触环。这一特征消除了小袋流体被捕集在膈膜中的机会，并且由此确保可靠的移位体积。

11、已经开发了使用气动致动的弹性膜作为密封特征并且使用压缩气体作为偏置元件的微流控压力调节器。在一优选实施例中，流体使压力抵靠弹性膜堆积，直至所述压力战胜了由另一侧的压缩气体施加的压力并且充当背压调节器。在替代性实施例中，调节器控制调节元件下游的流体压力。膈膜被设计成具有低刚度，使得其对膜中的应变能不敏感。一旦流体压力超过密封压力，流体就开始流动。可以通过调节压缩气体源来调节流体压力，并且可以通过增加流控回路中的顺应性来使流稳定。

12、可以使用几种不同类型的微流控蓄积器以将加压的流体储存在微流控芯片中。在一个实施例中，蓄积器使用柔性膜以使用膜中的所储存的弹性能来储存压力。在另一实施例中，微流控蓄积器使用小死端微流控通道以在压力下捕集气泡并储存体积。在第三实施例中，微流控蓄积器使用在一侧用空气加压的滚动膈膜和储存在储器中的流体。

13、已经开发了几种片上压力传感器。在一个实施例中，传感器使用光学电平或电容变化和可变形膜，其中弹性膜的变形随着压力的增加而发生。在另一实施例中，使用相机以测量微流控通道中所捕集的气泡的长度，所述长度与通道压力成比例。

14、用于水凝胶安装和组织支架的方法

15、描述了各种水凝胶的形成技术。在一个实施例中，使用可移除或可溶解支撑结构以在水凝胶形成时将水凝胶定位和/或以在水凝胶中产生通道以供流体流动。在替代性实施例中，使用可折叠襟翼来对水凝胶整形，然后折叠起来。在仍另一实施例中，通道是通过在容器中产生与其所插入到的歧管上的特征相匹配的楔或通道产生的。在又另一实施例中，使用通过表面张力被保持在位的槽形状的悬滴水凝胶以分离培养基通道并随着膨胀改变流构型。使用包含聚四氟乙烯(“ptfe”)的非粘附聚合物允许在聚合后在不破坏水凝胶的情况下移除这些结构。

16、各种细胞外基质(“ecm”)材料的支架可以被激光切割以供微流控芯片和跨孔插入物使用。激光切割的孔的大小和形状可以从几微米至毫米不等。使用光学上澄清的薄膜使这些支架为可成像的，并且疏水性质允许将ecm掺入到液相中。

17、用于高通量细胞培养研究的平台

18、可移除帽已被设计成用于细胞培养应用的微流控装置。这些帽可以包含光学上澄清的窗口、用于更好顺应性的弹性体特征或薄膜上的用于经改进的密封性的粘合剂图案。微流控芯片的储器也可以被设计成适应双位置细胞培养帽和其它现有帽设计。在另一实施例中，已经开发了一种用于微流控芯片的快速释放顶部，所述快速释放顶部使用垫圈，所述垫圈是使用弹簧加载的杠杆、肘节夹具或过中心闩锁压缩的。

19、已经开发了用于堆叠微流控装置的电气动歧管，所述电气动歧管竖直地或在旋转机构上并入装置。这些歧管将气动信号分配到多个芯片以用于高通量实验。单独歧管的特征还在于，一种用于实现微流控装置与气动管线的快速连接的闩锁系统。