信使RNA的大规模合成的制作方法

背景技术：

1、信使rna(mrna)疗法正在变成越来越重要的用于治疗多种疾病的方法。mrna疗法包括将包含体外转录(ivt)且高纯度的信使rna(mrna)的药品施用于需要疗法的患者，以及在患者体内产生由mrna编码的蛋白质。

2、通过体外转录产生mrna还产生双链rna(dsrna)，其是mrna产物中的主要污染物，这对于mrna疗法将是不可接受的。双链rna是不期望的，因为它导致所施用的mrna产物的低效翻译并导致细胞因子的诱导，触发免疫应答。

3、传统上，使用可商购的色谱系统和/或通过提取至有机混合物(苯酚:氯仿:异戊醇)中并随后进行乙醇沉淀来纯化通过体外转录产生的mrna。然而，dsrna杂质不能通过标准纯化方法有效地去除，所述标准纯化方法包括基于氯化锂或醇的沉淀、尺寸排阻和离子交换色谱法、或基于二氧化硅基质的纯化。

4、dsrna杂质仅能通过需要特殊仪器并产生有害废物的程序来去除。目前，离子对反相高效液相色谱法(hplc)是用于从长ivt mrna中消除dsrna污染物的方法。然而，这种方法昂贵、不可放大，并且采用有毒的乙腈。

技术实现思路

1、需要用于产生适合于mrna治疗学的没有污染性双链rna(dsrna)的高纯度mrna产物的有成本效益的大规模合成方法。本发明尤其提供了一种产生没有或基本上不含污染性dsrna的mrna的大规模体外合成方法。本发明尤其提供了一种使用sp6rna聚合酶产生mrna产物而不需要合成后纯化步骤来去除污染性dsrna的方法，所述合成后纯化步骤诸如色谱方法(例如，离子对反相高效液相色谱法或尺寸排阻和离子交换色谱法)。

2、本发明部分地基于以下令人惊奇的发现：与其他rna聚合酶(如t7 rna聚合酶)相比，sp6 rna聚合酶合成具有显著减少的dsrna的全长mrna。如下文(包括实施例章节)更详细地所述，与通过t7 rna聚合酶合成的mrna产物相比，通过sp6 rna聚合酶合成的mrna产物是高产的，并且基本上不含dsrna。通过sp6 rna聚合酶经由ivt产生的mrna产物不仅富含具有显著减少的流产性转录物的全长mrna，而且具有令人惊奇且出乎意料的基本上不含dsrna的特性。sp6 rna聚合酶的这些独特且有利的特性产生了与由t7 rna聚合酶产生的mrna产物相比质量明显更高、适合于mrna治疗学的mrna产物。因此，本发明部分地提供了一种体外合成mrna而不需要合成后纯化方法来去除dsrna的方法，所述合成后纯化方法包括例如色谱方法(例如，上文和背景技术中提及的那些)。

3、如果需要，可以例如通过可以用1克或更多的体外合成的mrna批次操作的基于沉淀和过滤的方法纯化通过本发明方法产生的体外合成的mrna以去除源自体外合成反应的污染物(如在该反应中使用的一种或多种酶)。此类方法可以包括例如切向流过滤、深度过滤或离心(例如，使用过滤离心机)。合适的方法描述于例如wo 2015/164773、wo 2018/157141和wo 2020/041793中。

4、在一方面，本发明提供了一种大规模产生包含全长信使rna(mrna)的组合物的方法，所述方法包括使用sp6 rna聚合酶体外合成mrna，其中以单个批次合成至少1克(1g)mrna，并且其中所述组合物含有按重量计小于1％的双链rna(dsrna)。

5、在一些实施方案中，所述方法不包括色谱步骤。

6、在一些实施方案中，整个方法在非变性条件下进行。在一些实施方案中，在非变性条件下合成所述mrna。

7、在一方面，本发明提供了一种产生包含全长信使rna(mrna)的组合物的方法，所述方法包括体外合成mrna，其中所述组合物含有按重量计小于1％的双链rna(dsrna)，并且其中所述方法不包括色谱步骤。

8、在一方面，本发明提供了一种产生包含全长信使rna(mrna)的组合物的方法，所述方法包括体外合成mrna，其中所述组合物含有按重量计小于1％的双链rna(dsrna)，并且其中在非变性条件下合成所述mrna。

9、在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中以单个批次合成至少1gmrna。

10、在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中以所述单个批次合成至少10g、100g、250g、500g、1kg或10kg mrna。因此，在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中合成至少10g mrna。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中合成至少100g mrna。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中合成至少500g mrna。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中合成至少1kg mrna。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中合成至少10kg mrna。在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中以单个批次合成超过10kg mrna。例如，在一些实施方案中，以单个批次合成25kg、50kg、75kg、100kg或更多的体外合成的mrna。

11、在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中所述组合物含有按重量计小于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％的所述dsrna。

12、在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中所述组合物基本上不含所述dsrna。

13、在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中mrna的体外合成在约6至8.5之间、约6.5至8.0之间或约7.0至7.5之间的ph下进行。在特定的实施方案中，mrna的体外合成在7.5与7.7之间的ph下进行。在一些实施方案中，所述ph是6、6.2、6.4、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2或8.4。在一些实施方案中，所述ph是7.5。在一些实施方案中，所述ph是7.7。

14、在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中mrna的体外合成在包含25mm tris hcl、2mm亚精胺、25mm mgcl、0.5mm nacl和ph 7.5的缓冲液中进行。

15、在一些实施方案中，所述方法包括体外合成mrna，其中所述方法不包括离液剂。离液剂是通过干扰非共价力(如氢键和范德华力)破坏大分子(如蛋白质和核酸)的结构的物质。在一些实施方案中，离液剂包括例如脲、硫脲、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、乙酸锂、氯化镁、十二烷基硫酸钠、高氯酸锂及其组合。

16、在一方面，本发明提供了一种大规模产生包含全长信使rna(mrna)的组合物的方法，所述方法包括使用sp6 rna聚合酶体外合成mrna，其中所述组合物包含按重量计小于1％的双链rna(dsrna)，并且其中以单个批次合成至少100mg mrna。

17、在一些实施方案中，所述组合物含有按重量计小于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％的所述dsrna。

18、在一些实施方案中，所述组合物基本上不含所述dsrna。

19、在一些实施方案中，通过斑点印迹测定或elisa检测所述dsrna。

20、在一些实施方案中，在为所述合成的mrna加帽或加尾之前对所述dsrna进行检测。

21、在一些实施方案中，所述方法进一步包括为所述合成的mrna加帽和/或加尾的步骤。

22、在一些实施方案中，在为所述合成的mrna加帽和加尾之后对所述dsrna进行检测。

23、在一些实施方案中，以单个批次合成至少200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、25g、50g、75g、100g、150g、200g、250g、500g、750g、1kg、5kg、10kg或更多的mrna。在一个典型的实施方案中，以单个批次合成1g至100kg(例如，100g至10kg或250g至5kg)mrna。在一些实施方案中，以单个批次合成10kg或更多的mrna。在特定的实施方案中，以单个批次合成在10kg与100kg之间的mrna。在一些实施方案中，以单个批次合成15kg、20kg、25kg、30kg、35kg、40kg、45kg、50kg、75kg或100kg或更多的mrna。

24、在一些实施方案中，所述方法不包括特意去除所述dsrna的步骤。

25、在一些实施方案中，所述方法不包括色谱步骤。

26、在一些实施方案中，所述sp6 rna聚合酶是天然存在的sp6 rna聚合酶。

27、在一些实施方案中，所述sp6 rna聚合酶是重组sp6 rna聚合酶。

28、在一些实施方案中，所述sp6 rna聚合酶包含标签。在一些实施方案中，所述标签是his标签。

29、在一些实施方案中，通过所述sp6 rna聚合酶基于dna模板合成所述mrna，所述dna模板例如包含可操作地连接至编码待合成的mrna序列的dna序列的sp6启动子的dna模板。在一些实施方案中，所述dna序列是经优化的。在一些实施方案中，所述dna序列经优化以降低在所述合成的mrna中形成发夹结构的可能性。

30、在一些实施方案中，反应混合物中sp6 rna聚合酶的按重量计的量等于或大于dna模板的按重量计的量。在一个特定的实施方案中，dna模板与sp6 rna聚合酶的重量比在1:1与1:3之间。在一些实施方案中，为了达到所需的产量，在反应条件下相对于dna模板的量调整sp6 rna聚合酶的量。例如，在一些实施方案中，相对于dna模板的量增加sp6 rna聚合酶的量。

31、在一些实施方案中，在反应混合物中合成所述mrna，所述反应混合物包含每种ntp在范围为1-10mm(例如，1-8mm、1-6mm、1-5mm、2-10mm、2-8mm、2-6mm和4-5mm)的浓度下的ntp，在范围为0.01-0.5mg/ml(例如，0.05-0.4mg/ml、0.05-0.3mg/ml、0.05-0.2mg/ml和0.05-0.15mg/ml)的浓度下的所述dna模板，以及在范围为0.01-0.1mg/ml(例如，0.02-0.08mg/ml和0.04-0.06mg/ml)的浓度下的所述sp6 rna聚合酶。

32、在一些实施方案中，所述反应混合物包含每种ntp在5mm的浓度下的ntp、在0.1mg/ml的浓度下的所述dna模板和在0.05mg/ml的浓度下的所述sp6 rna聚合酶。

33、在一些实施方案中，在范围为37℃-42℃的温度下合成所述mrna。在一些实施方案中，在约37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃或45℃的温度下合成所述mrna。

34、在一些实施方案中，所述ntp是天然存在的ntp。在一些实施方案中，所述ntp包括修饰的ntp。在一些实施方案中，所述修饰的ntp包含假尿苷。在更具体的实施方案中，假尿苷是n-1-甲基-假尿苷。

35、在一些实施方案中，所述mrna编码人囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cftr)。

36、在一些实施方案中，所述mrna编码人鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)。

37、在一些实施方案中，所述全长mrna分子的长度是至少100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、600个碱基、700个碱基、800个碱基、900个碱基、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、8kb、10kb或15kb。

38、在一些实施方案中，所述mrna是经密码子优化的。

39、在一些实施方案中，提供了一种包含通过本发明的方法产生的mrna的组合物。

40、在一方面，本发明提供了一种包含使用sp6 rna聚合酶以单个批次产生而没有通过色谱步骤纯化的体外合成的信使rna(mrna)的组合物，其中所述组合物含有小于1％的双链rna(dsrna)。

41、在一些实施方案中，所述组合物包含至少100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、25g、50g、75g、100g、150g、200g、250g、500g、750g、1kg、5kg、10kg或更多的mrna。在一个典型的实施方案中，所述组合物包含1g至100kg(例如，100g至10kg或250g至5kg)mrna。在一些实施方案中，所述组合物包含10kg或更多的mrna。在特定的实施方案中，所述组合物包含在10kg与100kg之间的mrna。例如，在一些实施方案中，所述组合物包含15kg、20kg、25kg、30kg、35kg、40kg、45kg、50kg、75kg或100kg或更多的mrna。

42、在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其中使用sp6 rna聚合酶合成mrna。

43、在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％的dsrna。因此，在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.9％的所述dsrna。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.8％的所述dsrna。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.7％的所述dsrna。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.6％的所述dsrna。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.5％的所述dsrna。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.4％的所述dsrna。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.3％的所述dsrna。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.2％的所述dsrna。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.1％的所述dsrna。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.05％的所述dsrna。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计小于0.01％的所述dsrna。

44、在一些实施方案中，所述组合物基本上不含所述dsrna。在一些实施方案中，所述组合物基本上不含短聚体污染。在另外的实施方案中，所述组合物基本上不含dsrna和短聚体污染两者。

45、在一些实施方案中，通过斑点印迹测定检测所述dsrna。

46、在一些实施方案中，所述mrna编码人囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cftr)。

47、在一些实施方案中，所述mrna编码人鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)。

48、在一些实施方案中，所述mrna是经密码子优化的。在一些实施方案中，所述mrna是未修饰的。在一些实施方案中，所述mrna是修饰的。在某些实施方案中，所述修饰的mrna包含假尿苷。在更具体的实施方案中，假尿苷是n-1-甲基-假尿苷。

49、在一些实施方案中，所述mrna的长度是至少100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、600个碱基、700个碱基、800个碱基、900个碱基、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、8kb、10kb或15kb。

50、在一些实施方案中，将所述mrna包封在脂质体内。

51、在一些实施方案中，所述脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种peg修饰的脂质。

52、在一些实施方案中，所述脂质体进一步包含基于胆固醇的脂质。

53、在一方面，提供了一种治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括使用如本文所述的组合物。

54、本文所述的任何方面或实施方案都可以与如本文公开的任何其他方面或实施方案组合。虽然已经结合本公开文本的具体实施方式描述了本公开文本，但前面的描述旨在说明而非限制本公开文本的范围，本公开文本的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

55、本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。将本文引用的所有美国专利和公开或未公开的美国专利申请都通过引用并入。将本文引用的所有公开的外国专利和专利申请都通过引用特此并入。将本文引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献都通过引用特此并入。

56、根据下文的具体实施方式、附图和权利要求，本发明的其他特征和优点将变得清楚。然而，应当理解，虽然具体实施方式、附图和权利要求指示了本发明的实施方案，但它们仅是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得清楚。