对细菌噬菌体敏感性降低的细菌的制作方法

本发明涉及对细菌噬菌体敏感性降低的细菌菌株。本发明还涉及包含至少一种本发明菌株的组合物以及此菌株或组合物用于制造食品诸如乳产品或用于制造饲料的用途。

背景技术：

1、细菌起子培养物在食品工业中广泛用于制造发酵产品，包括奶产品(诸如酸奶、黄油和奶酪)、肉类产品、烘焙产品、酒和蔬菜产品。

2、烈性细菌病毒(细菌噬菌体或噬菌体)对细菌培养物的攻击和增殖被认为是细菌培养物的工业使用的主要问题之一，导致细菌培养物的生产失败。由于商业发酵的性质，在工业环境中经常发现烈性噬菌体。如果不加控制，细菌噬菌体将干扰发酵，导致过程中断和产品品质损失。已经发现针对在工业中使用的许多细菌菌株的细菌噬菌体，并且存在许多不同类型的具有不同感染机制的噬菌体。新的细菌噬菌体菌株不断出现。

3、典型地，细菌噬菌体的裂解感染循环涉及噬菌体吸附到细菌宿主细胞表面、噬菌体dna注入细胞中、噬菌体dna复制、噬菌体蛋白质表达、噬菌体组装和宿主细菌细胞裂解以释放组装的噬菌体。细菌噬菌体抗性机制取决于噬菌体复制的裂解循环的一个或多个步骤中涉及的宿主因子，并且通常基于它们抑制的感染循环的步骤来分类。

4、在工业中用来使细菌噬菌体感染以及因此细菌培养失败最小化的策略不是完全有效的。此类策略包括使用混合起子培养物以确保存在一定水平的对噬菌体攻击的抗性。另外，使用对不同噬菌体敏感的选定细菌菌株的轮换。然而，在新噬菌体出现后用抗性菌株快速替代细菌菌株通常是不可能的。因此，目前还无法消除食品工业中的噬菌体污染。

5、本领域一直需要提供用于食品/饲料工业的改善细菌菌株-诸如具有噬菌体抗性的细菌菌株。因此，需要鉴定在乳酸细菌(例如，链球菌属(streptococcus))中噬菌体复制中涉及的宿主因子。

技术实现思路

1、本发明诸位发明人令人惊讶地发现，编码自溶素的宿主基因参与噬菌体复制并且是细菌噬菌体诸如p335样噬菌体d6867完成其裂解循环所必需的。自溶素基因中的突变为宿主细胞(诸如乳酸细菌)提供了对细菌噬菌体(诸如p335样噬菌体，例如d6867)的抗性。用敏感菌株的自溶素基因互补突变菌株导致噬菌体敏感表型的恢复。本发明诸位发明人还证明了包含自溶素突变的细菌维持商业上可接受的奶酸化动力学，使它们适用于在生产食品或饲料(诸如发酵产品，例如，发酵乳产品)的方法中使用。

2、在一个方面，本发明提供了一种细菌菌株，该细菌菌株已经过修饰以降低自溶素的活性和/或表达，其中所述修饰的菌株对细菌噬菌体(诸如至少一种p335样噬菌体，例如d6867)的敏感性降低。

3、适当地，修饰可以使自溶素对于噬菌体感染而言部分或完全无功能。

4、适当地，修饰可以是终止密码子、插入、缺失或突变。

5、适当地，修饰可以被引入编码所述自溶素的核酸序列中或被引入有助于控制所述自溶素表达的调节区(诸如启动子或增强子)中。

6、适当地，细菌菌株经过修饰以包含编码自溶素r蛋白的自溶素r等位基因，其中所述自溶素r等位基因降低乳酸乳球菌(lactococcus lactis)sl12699衍生菌株对噬菌体d6867的敏感性，所述sl12699衍生菌株是乳酸乳球菌sl12699菌株，其中其自溶素等位基因已被所述自溶素r等位基因替代，并且其中对噬菌体d6867的敏感性通过成斑率(eop)测定i来确定。

7、适当地，细菌菌株对于修饰而言可以是纯合的。

8、在一个方面，本发明提供了一种用于增加(例如，赋予或增加)细菌菌株对细菌噬菌体(诸如至少一种p335样噬菌体，例如d6867)的抗性的方法，该方法包括通过降低自溶素的活性和或表达来修饰所述细菌菌株。

9、在一个方面，本发明提供了一种用于制备至少一种细菌噬菌体抗性变体菌株(诸如对至少一种p335样噬菌体(例如，d6867)的抗性)的方法，该方法包括修饰亲本细菌菌株以降低自溶素的活性和/或表达。

10、适当地，根据本发明的方法可以包括

11、a)提供对至少一种细菌噬菌体(诸如p335样噬菌体，例如d6867)敏感的细菌菌株(诸如乳球菌属(lactococcus)乳酸细菌菌株)；

12、b)修饰所述细菌菌株以降低自溶素的活性和/或表达；以及

13、c)回收对至少一种细菌噬菌体(诸如p335样噬菌体，例如d6867)的敏感性降低的一种或多种菌株，任选地其中对至少一种细菌噬菌体(诸如p335样噬菌体，例如d6867)的敏感性通过eop测定i来确定。

14、在一个方面，本发明提供了一种通过根据本发明的方法可获得或获得的细菌菌株。

15、在一个方面，本发明提供了一种编码如本文定义的突变自溶素蛋白(自溶素r蛋白)的多核苷酸。

16、适当地，根据本发明的多核苷酸可以降低乳酸乳球菌sl12699衍生菌株对噬菌体d6867的敏感性的自溶素等位基因，所述sl12699衍生菌株是乳酸乳球菌sl12699菌株，其中其自溶素等位基因已被所述自溶素r等位基因替代，并且其中对噬菌体d6867的敏感性通过成斑率(eop)测定i来确定。

17、在一个方面，本发明提供了一种包含根据本发明的多核苷酸的构建体或载体。

18、在一个方面，本发明提供了根据本发明的多核苷酸或根据本发明的构建体或载体降低细菌菌株对至少一种细菌噬菌体(诸如p335样噬菌体，例如d6867)的敏感性的用途。

19、在本发明的任何方面，对噬菌体(诸如p335样噬菌体，例如d6867，例如d6867)的敏感性的降低的特征可以在于eop降低至少4log、至少5log或至少6log。

20、在本发明的任何方面，修饰可以编码自溶素r蛋白，相对于选自由以下组成的组的自溶素蛋白，该自溶素r蛋白包含氨基酸消减、氨基酸添加、氨基酸取代或氨基酸消减和添加：

21、a)具有如seq id no：2中定义的氨基酸序列的自溶素蛋白；

22、b)自溶素变体蛋白，该自溶素变体蛋白包含与由自溶素等位基因编码的seq idno：2具有至少80％同一性的氨基酸序列，该自溶素变体蛋白不降低乳酸乳球菌sl12699衍生菌株上噬菌体d6867的eop，所述sl12699衍生菌株是乳酸乳球菌sl12699菌株，其中其自溶素等位基因已被编码所述自溶素变体蛋白的自溶素等位基因替代，并且其中对噬菌体d6867的敏感性通过成斑率(eop)测定i来确定；以及

23、c)自溶素变体蛋白，该自溶素变体蛋白包含与由自溶素等位基因编码的seq idno：2具有至少80％同一性的氨基酸序列，该自溶素变体蛋白使乳酸乳球菌sl12699衍生菌株上噬菌体d6867的eop降低小于3log，所述d6867衍生菌株是乳酸乳球菌sl12699菌株，其中其自溶素等位基因已被编码所述自溶素变体蛋白的自溶素等位基因替代，并且其中对噬菌体dt1的敏感性通过成斑率(eop)测定i来确定。

24、d)由自溶素等位基因编码的seq id no：2的同源物，该同源物不降低乳酸乳球菌sl12699衍生菌株上噬菌体d6867的eop，所述sl12699衍生菌株是乳酸乳球菌sl12699菌株，其中其自溶素等位基因已被编码所述自溶素变体蛋白的自溶素等位基因替代，并且其中对噬菌体d6867的敏感性通过成斑率(eop)测定i来确定；以及

25、e)由自溶素等位基因编码的seq id no：2的同源物，该同源物使乳酸乳球菌sl12699衍生菌株上噬菌体d6867的eop降低小于3log，所述d6867衍生菌株是乳酸乳球菌sl12699菌株，其中其自溶素等位基因已被编码所述自溶素变体蛋白的自溶素等位基因替代，并且其中对噬菌体dt1的敏感性通过成斑率(eop)测定i来确定。

26、在本发明的任何方面，修饰可以导致自溶素的yjdb结构域的截短。

27、在本发明的任何方面，截短的自溶素蛋白可以是自溶素等位基因中缺失和/或插入的结果。

28、在本发明的任何方面，截短的自溶素蛋白可以是导致终止密码子的核苷酸突变的结果。

29、在本发明的任何方面，细菌菌株可以在其pip基因中另外发生突变并且对c2型c2噬菌体具有抗性。

30、在本发明的任何方面，细菌菌株可以在其yjae基因中另外发生突变并且对bi67型c2噬菌体具有抗性。

31、在本发明的任何方面，细菌菌株可以是乳酸菌株，适当地该乳酸细菌菌株可以选自乳球菌属(lactococcus)、链球菌属(streptococcus)、乳杆菌属(lactobacillus)、明串珠菌属(leuconostoc)、片球菌属(pediococcus)和双歧杆菌属(bifidobacterium)，适当地该菌株可以是乳球菌属的，适当地所述菌株可以是乳球菌属物种，诸如乳酸乳球菌物种、乳酸乳球菌乳脂亚种(lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)或乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰乳酸生物变种(lactococcus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)。

32、在一个方面，本发明提供了一种包含根据本发明的细菌菌株的细菌组合物。细菌组合物可以任选地进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种其他乳酸细菌：链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、肠球菌属(enterococcus)、酒球菌属(oenococcus)和双歧杆菌属。

33、在一个方面，本发明提供了一种食品或饲料产品，其包含根据本发明的细菌菌株或根据本发明的细菌组合物。产品可以是乳类、肉类或谷类食品或饲料产品，更特别是发酵乳产品。

34、适当地，乳类食品或饲料产品可以是发酵乳产品，诸如发酵奶、酸奶、奶油、成熟奶油、奶酪、新鲜软干酪(fromage frais)、奶饮料、加工奶酪、奶油甜点、农家干酪(cottagecheese)或婴儿奶。

35、在一个方面，本发明提供了一种用于制造发酵产品的方法，该方法包括：

36、a)用根据本发明的细菌菌株或根据本发明的细菌组合物接种基质，优选奶基质；以及

37、b)将从步骤a)获得的接种基质进行发酵以获得发酵产品，优选发酵乳产品。

38、在一个方面，本发明提供了根据本发明的细菌菌株或根据本发明的细菌组合物用于制造食品或饲料产品的用途。产品可以是发酵食品产品。产品可以是发酵乳产品。