谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体及利用其生产谷胱甘肽的方法与流程

本申请涉及新的谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体及利用其生产谷胱甘肽的方法。

背景技术：

1、谷胱甘肽(gsh)是细胞内最普遍存在的有机硫化合物，并且其是甘氨酸、谷氨酸(glutamate)和半胱氨酸(cysteine)三种氨基酸组合的三肽形式。

2、在体内，谷胱甘肽以两种形式存在：还原型谷胱甘肽(gsh)和氧化型谷胱甘肽(gssg)。还原型谷胱甘肽(gsh)——在一般情况下以相对高的比例存在——主要分布在人体的肝脏和皮肤细胞中，并且具有诸如分解和去除氧自由基的抗氧化功能、去除外源性化合物如有毒物质的解毒功能、抑制黑色素生成的美白功能等重要作用。

3、由于谷胱甘肽的产生随着年龄增长而逐渐减少，谷胱甘肽(在抗氧化和解毒功能方面具有重要作用)产生的减少会促进氧自由基的积累——这是衰老的主要原因之一，因此需要谷胱甘肽的外部供应(sipes ig et al.,the role of glutathione in thetoxicity of xenobiotic compounds:metabolic activation of 1,2-dibromoethane byglutathione,adv exp med biol.1986；197:457-67)。

4、具有如此多种功能的谷胱甘肽在诸如制药、健康功能食品、化妆品等各种领域作为一种材料备受关注，并且也被用于制备调味成分、食品和饲料添加剂。已知谷胱甘肽对增加原料的风味和保持浓郁的风味有显著作用，并且谷胱甘肽可以通过单独使用或与其他物质组合使用来作为厚味(kokumi)风味增强剂使用。通常，厚味物质比现有的鲜味(umami)物质(如核酸、msg等)具有更丰富的风味，并且已知是通过蛋白质的分解和老化而产生的。

5、然而，尽管如上所述对可用于各种领域的谷胱甘肽的需求不断增加，但酶合成方法因生产成本高而尚未商业化，并且由于谷胱甘肽的工业生产需要相当高的成本，市场没有被显著激活。

6、本发明人发现，引入了新开发的谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体的微生物能够以高产率生产谷胱甘肽，从而完成本公开。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体，其中在具有谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的蛋白质中，与seq id no:1的氨基酸序列的n端起第653位相应的氨基酸被甲硫氨酸取代。

2、本发明的另一目的是提供编码该变体的多核苷酸和包括其的载体。

3、本发明的再另一目的是提供微生物，该微生物通过包含任意一种或多种所述变体；编码所述变体的多核苷酸；和包括所述多核苷酸的载体而生产谷胱甘肽。

4、本发明的再另一目的是提供生产谷胱甘肽的方法，该方法包括培养所述微生物的步骤。

1.谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体，其中相应于seq id no:1的氨基酸序列的n端第653位的氨基酸被甲硫氨酸取代。

2.根据权利要求1所述的谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体，其中相应于第653位的所述氨基酸是甘氨酸。

3.根据权利要求1所述的谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体，其中所述变体与seq id no:1的氨基酸序列具有80％以上且小于100％的序列同源性。

4.根据权利要求1所述的谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体，其中所述变体由seq id no:3的氨基酸序列组成。

5.根据权利要求1所述的谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体，其中所述变体的相应于第86位的氨基酸被另一氨基酸另外取代。

6.根据权利要求5所述的谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体，其中所述变体由seq id no:13的氨基酸序列组成。

7.多核苷酸，其编码根据权利要求1-6中任一项所述的谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体。

8.载体，其包含根据权利要求7所述的多核苷酸。

9.生产谷胱甘肽的微生物，所述微生物包含下列任意一种或多种：根据权利要求1-6中任一项所述的谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体；编码所述变体的多核苷酸；以及包含所述多核苷酸的载体。

10.根据权利要求9所述的生产谷胱甘肽的微生物，其中所述微生物是酵母属微生物。

11.根据权利要求9所述的生产谷胱甘肽的微生物，其中所述微生物是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。

12.生产谷胱甘肽的方法，所述方法包括在培养基中培养微生物的步骤，所述微生物包括下列任意一种或多种：根据权利要求1-6中任一项所述的谷氨酸-半胱氨酸连接酶变体；编码所述变体的多核苷酸；以及包含所述多核苷酸的载体。

13.根据权利要求12所述的方法，进一步包括从选自下列的一种或多种材料收集谷胱甘肽的步骤：培养的所述微生物、所述微生物的干产物、所述微生物的提取物、所述微生物的培养物和所述微生物的溶菌产物。