一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺的制作方法

本发明属于微生物，具体涉及一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺。

背景技术：

1、冬虫夏草仅仅是我国190多种虫草中的一种，主产于青藏高原上，又简称"虫草"。虫草是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，主要活性成分为虫草素、虫草酸、虫草多糖等有益于人体吸收的物质，冬虫夏草是我国传统的名贵药膳滋补品，它性平味甘，具有补肺肾、止咳嗽、益虚损、养精气之功能。冬虫夏草具有养肺阴，补肾阳、止咳化痰、抗癌防老的功效，为平补阴阳之品，诸无所忌。冬虫夏草可用于肺痨咳血，阳痿遗精等症；其药理药效的不可替代作用、生态环境恶劣等使其珍贵而稀少，随着人类生活水平的不断提高，人们对冬虫夏草的需求量越来越大，而资源量却越来越少，供求矛盾越来越突出。为了解决这一问题，近几年，我国生物医学界的研究人员先后分离出多株虫草真菌菌株，试图利用人工发酵方式生产虫草菌丝体，用以代替天然冬虫夏草。经过不懈的努力，有几家已生产出在药理、毒理及功效成分等方面与天然虫草相似的产品，并能实现现代化条件下的大规模生产。

2、例如，蝙蝠蛾拟青霉（paecilomyces hepiali）是从新鲜冬虫夏草中分离所得的隶属丛梗孢科（moniliaceae）瓶梗青霉属（paecilomyces bain）虫生真菌。1982年，中国医学科学院药物研究所的研究人员从青海化隆采集的新鲜冬虫夏草中分离得到了cs-4菌株，经鉴定可知，该cs-4菌株是蝙蝠蛾拟青霉（戴如琴，李晓明，邵爱娟，等.蝙蝠蛾拟青霉名称的合格化[j].菌物学报，2008（5）：641-644），蝙蝠蛾拟青霉菌丝体是利用蝙蝠蛾拟青霉通过人工深层发酵培养所得，已作为冬虫夏草的代用品在中成药和保健食品中广泛使用。

3、发酵培养虫草菌株是制备虫草产品的前提，传统的虫草菌株发酵工艺存在发酵得率低、发酵时间长的问题。因此，出现了静置发酵、间歇发酵和补料分批发酵等工艺，但这些发酵工艺仍存在各种问题，比如染菌率高、发酵周期长、操作工艺复杂和发酵产物中的活性成分含量低等。特别的，传统发酵工艺所得产品，其典型活性成分核苷含量仍然处于较低的水平，因此，如何优化发酵工艺，得到一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体，是目前亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明针对现有发酵技术中，蝙蝠蛾拟青霉发酵产品核苷的含量相对较低，发酵周期长，发酵工艺复杂特点，开发一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺，所得产品核苷含量大幅提升。

2、为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种高核苷含量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉发酵生产工艺，工艺步骤包括：菌株斜面接种培养、一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐发酵和菌丝后处理。

4、进一步的，本发明的工艺步骤具体为：

5、(1)菌株斜面接种培养：将购买的菌株接种到斜面培养基mm中，经23-25℃培养7-8天至菌丝长满斜面，长好的斜面注明菌种名称、制备日期，用牛皮纸包扎好，置于4℃保存；

6、(2)一级摇瓶种子培养：将250ml一级摇瓶种子培养基装入500ml三角烧瓶，纱布封口，121℃，灭菌20分钟，放凉备用，用灼烧灭菌的接种钩挑取步骤（1）所得带菌琼脂块3块接入，纱布封口，23-25℃，130-180r/min培养4-7d，得到一级摇瓶种子液；

7、(3)二级摇瓶种子培养：将250ml二级摇瓶种子培养基装入500ml三角烧瓶，纱布封口，121℃，灭菌20分钟，放凉备用，用灭菌枪头吸取10ml一级摇瓶种子液接入二级摇瓶培养基，23-25℃，130-180r/min培养4-7d，得到二级摇瓶种子液；

8、(4)种子罐培养：将二级摇瓶种子液按照质量比1:80-160接入种子罐培养基中，通气量1.0-1.3vvm，罐压0.02-0.05mpa，温度20-25℃，ph自然，溶氧自然，发酵时间2-3天，得到种子罐发酵液；

9、(5)发酵罐发酵：将种子罐发酵液转入发酵罐培养基中进行发酵，转种体积比例1：（7-15），通气量1.0-1.3vvm，罐压0.02-0.05mpa，温度20-25℃，ph自然，溶氧自然，发酵周期3-4天，ph值稳定或略有上升，发酵时间65-72h、残糖0.9-1.2%左右，下发酵罐；

10、(6)菌丝后处理：将步骤（5）所得物料用400-500目纱布过滤，65-75℃下干燥40-48h，控制物料含水量低于7%，研磨，过80目筛后得到终产品。

11、进一步的，步骤（1）所用菌株为蝙蝠蛾拟青霉（paecilomyces hepiali），购自中国普通微生物菌种保藏中心，菌种编号为cgmcc no.3.14870。本发明所用菌株可通过中国普通微生物菌种保藏中心公开购买，无需重复保藏。

12、进一步的，步骤（1）斜面培养基mm的组成为：kh2po4 1.0 g，（nh4）2hpo4 1.5 g，mgso4·7h2o 0.6g，thiamine hcl500µg，琼脂粉15g，加水蒸馏水至1l灭菌倒平板。

13、进一步的，步骤（2）一级摇瓶种子培养基的组成为：葡萄糖2-3%、蛋白胨1-1.5%、kh2po4 0.1%、mgso4·7h2o 0.03%，余量为水，ph自然，按质量百分比计。

14、进一步的，步骤（3）二级摇瓶种子培养基的组成为：麦麸提取液30-60%，葡萄糖2-3%，蛋白胨0.5%，kh2po4 0.1%，mgso40.03%，ph值自然，按质量百分比计。

15、进一步的，步骤（4）种子罐培养基的组成为：麦麸提取液30-60%，葡萄糖2-3%，氮源2-3.5%，kh2po40.06%、mgso4·7h2o 0.04%，二甲硅油0.2-0.3%，余量为水，ph自然，按质量百分比计；所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉，两者质量比为2：5。

16、更进一步的，所述麦麸提取液的制备方法为：将麦麸和水按照质量比1：（30-50）混合后进行超声波提取，超声频率为40-60khz，超声时间为40-60min，超声温度为70-80℃，超声完成后用400-500目纱布过滤后得到。

17、进一步的，步骤（5）发酵罐培养基的组成为：葡萄糖2-3%，氮源2-3.5%，kh2po40.06%、mgso4·7h2o0.04%，二甲硅油0.2-0.3%，余量为水，ph自然，按质量百分比计；所述氮源为蛋白胨和低温黄豆饼粉，两者质量比为2：5。

18、进一步的，步骤（6）研磨时使用小钢磨，转速24000r/min。

19、有益效果：(1)本发明对于购买的菌株首先使用斜面培养基mm进行活化培养，使用mm培养基，养分含量相对贫瘠，能够更好的保证菌种不发生变异；

20、(2)一级摇瓶种子培养过程中，使用培养基成分全部为水溶性成分，在固体培养基转接液体培养基过程中，便于直观的观察染菌情况，可以及时做出相应处理；

21、(3)本发明在二级摇瓶培养基和种子罐培养基中加入适量的麦麸提取液，麦麸提取液有利于种子液中菌量的快速增殖，缩短发酵周期，并有利于活性物质的积累；

22、(4)在发酵培养中采用较高的通气量，可以增强菌种的代谢能力，增加活性物质的积累，同时添加相对较多的二甲硅油消泡剂，有效抑制发酵产过程中产生的起泡现象；

23、(5)本发明所得产品，腺苷含量可到0.4%，腺苷、鸟苷以及尿苷总量可到1.72%，核苷含量有效提升，远高于市售产品。