包含冠状病毒刺突蛋白的受体结合结构域的嵌合蛋白以及包含其的组合物的制作方法

本发明涉及生物制药工业和生物医学，和特别地涉及疫苗领域。尤其是，本发明涉及针对冠状病毒(引起多种多样疾病的感染因子，其中包括冠状病毒2019(covid-19))的疫苗。本发明揭示了嵌合抗原的设计和获得以及包含其的疫苗组合物，其通过经由不同的施用途径来供给而生成强力的免疫应答。

背景技术：

0、现有技术

1、冠状病毒科(coronaviridae)的成员对于动物和人中的广泛的疾病负有责任。直至2003年还很少引人感兴趣，但是这种情况随着人兽互传的sars-cov(引起严重急性呼吸综合征的冠状病毒)和十年后mers-cov(引起中东呼吸综合征的冠状病毒)的出现而急剧发生了变化。这些冠状病毒已被确认为严重呼吸系统疾病的重要原因，并且引起了累计近10000个病例的两次疾病流行。最近，报道了一种新的冠状病毒，sars-cov-2，其引起后来被世界卫生组织宣布为大流行病的covid-19疾病的爆发。该大流行病已在全世界快速传播，其中直至2020年10月已确证了数百万的sars-cov-2阳性病例，和数十万人死亡。

2、已知在covid-19的恢复期病人中，大部分的针对sars-cov-2的中和抗体应答，以及相当部分的针对其的细胞应答，都是指向刺突蛋白(s)(cao y等人,2020may；brouwerpjm等人,science(80-)2020,369(6504):643-50)。因此，该蛋白是适合于将其包括在针对所述实体的疫苗制备物中的候选物，这不仅得到了以前的关于其他冠状病毒例如sars和mers的文献的支持(zhou y,jiang s,du l.expert rev vaccines.2018,17(8):677-86；wang n,shang j,jiang s,du l.front microbiol.2020,11；jiang s,he y,liu s.emerginfect dis.2005,11(7):1016-20)。

3、然而，以前的用其他致病冠状病毒的研究已显示在免疫扩增的病理学现象中牵涉s蛋白，无论在动物模型中还是在临床情境中(lambert p等人,vaccine.2020jun,38(31):4783-91)，因此在实验性疫苗中使用s蛋白不是没有风险。此外，s蛋白对于其在异源系统中的表达来说是巨大的挑战，如果希望在亚单位疫苗中使用它。它是一种具有相当大小(141kda)的分子，其活性形式为处于具有17至22个n-糖基化位点和可变数目的o-糖基化位点的预融合构象的三聚体(zhang y等人,biorxiv.2020；shajahan a,supekar nt,gleinich as,azadi p.glycobiology,2020,1-8)，其构象通过13个二硫桥来维持(kumars,maurya vk,prasad ak,bhatt mlb,saxena sk.virus disease.2020；wrapp d等人,science(80-)2020feb 19,2011(2865))。事实上，不存在关于使用微生物系统(酵母、真菌或细菌)来异源表达以三聚体构象的刺突的报道。

4、s蛋白负责sars-cov-2与ace2(在人细胞中的其受体)的相互作用(wrapp d等人,science(80-).2020feb 19,2011(2865)；wang q等人,cell.2020,894-904)。该相互作用通过在所述蛋白质中的分开的结构结构域(称为rbd，即受体结合结构域)来产生，所述结构域大约从半胱氨酸336行至半胱氨酸525，具有大约25kd的分子量。虽然rbd相对于该蛋白质的其余部分而言具有一定程度的可动性(处于两种位置，“打开的或向上的”和“关闭的或向下的”，这对于与受体的相互作用来说是重要的)(ke z等人,biorxiv 2020)，但是其结构通过具有复杂拓扑结构的4个二硫桥的存在而受到严格限制，并且其n-末端在天冬氨酰331和343处被n-糖基化(lan j等人,nature.2020,581(7807):215-20)。

5、许多针对rbd的抗体阻断其与ace2的相互作用，因此中和sars-cov-2；事实上，被大量针对s蛋白的中和抗体所识别的表位正是在rbd中(premkumar l等人,sciimmunol.2020,5(48):1-15)。因此，rbd已被认为是有希望的疫苗候选物，不仅针对sars-cov-2而且也针对其他冠状病毒例如sars和mers(zhou y,jiang s,du l.expert revvaccines 2018,17(8):677-86；wang n,shang j,jiang s,du l.s frontmicrobiol.2020,11)。事实上，rbd是在biontech/pfizer的疫苗开发计划期间在临床上令人满意地得到评价的首个抗原(mulligan mj等人,medrxiv 2020jan 1)。根据以前的用sars-cov-1进行的研究，用rbd进行的免疫接种诱导免疫致病现象的概率是低的(jiang s,he y,liu s.emerg infect dis.2005,11(7):1016-20；jaume m等人,hong kong medj.2012,18(supp2):31-6)，并且已在从哺乳动物细胞(hek293、cho)到酵母例如巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)的各种各样的系统中成功地表达了该分子(arbeitman cr等人,biorxiv 2020jan 1)。最后，通过四个二硫桥来稳定化的rbd的相对刚性的结构赋予该抗原以高的热耐受性，这可以在其中有理由预期到冷链失败的情境中对基于所述分子的疫苗给予优势(malladi sk等人,biorxiv 2020jan 1)。

6、虽然在文献中最多研究的rbd变体是从精氨酸319行至苯丙氨酸541的变体，但是它在n-末端处留下一条链，所述链在s蛋白的天然结构的情景下实际上构成β-片层的一部分，并且在c-末端处留下一个游离的半胱氨酸，其可以潜在地与另一个rbd分子形成二聚体或者催化二硫桥的互换，从而影响所述分子的结构并且有助于分子间聚集体的形成(rabdano so等人,sci rep 2017,7(1):1-20)。此外，扩大的变体，例如包括氨基酸319-541和其他相关变化(氨基酸318-510，氨基酸319-591)的变体具有比更短的rbd变体(例如，分别包括氨基酸331-528和331-532的那些)潜在地更不耐热并且对于蛋白酶的作用更敏感的缺点，这是由于它们向该蛋白质的末端所提供的额外的柔韧性(karshikoff a,nilsson l,ladenstein r.febs j.2015,282(20):3899-917)。

7、s蛋白的rbd通过介导病毒与细胞受体ace2的相互作用而在病毒复制循环中发挥必不可少的作用。rbd还是强有力的中和抗体的靶标，因此被认为是用于开发亚单位疫苗候选物的基础，其中的几个已处在临床试验中。

8、rbd是大约200个氨基酸的结构域，其折叠的特征在于：a)存在有在其两侧包装在小的环和螺旋区段上的具有五条链的中心反平行β片层，b)在与受体的相互作用中所牵涉的突出的β发夹环，c)具有三条链的外周的混合型小β片层，d)两个糖基化位点，和e)四个二硫桥。

9、所述结构域位于s蛋白的顶部位置(突出的上面部分)中，显示出“呼吸”的动态行为，这导致s蛋白的不同构象的交替。在一个称为“全向下”的构象中，所述三个rbd结构域显示出c3(假)对称，其中所述结构域与s三聚体的相邻链的相应的rbd结构域进行蛋白质-蛋白质和蛋白质-聚糖接触。在该构象中，蛋白质表面残基的接近是最小的，该表面的很大一部分被掩蔽在与其他蛋白质的相互作用中，大部分被聚糖球形屏蔽。处于这种构象的s蛋白不能够与受体ace2相互作用，与ace2的接触表面是不可接近的并且因此是无活性的。备选地，刺突的一个、两个或三个rbd可以处于“向上”抬起构象，其分别命名为“一个向上”、“两个向上”和“三个向上”。构象变化主要在于在位于残基lys529附近的柔性区域周围的铰链型运动，并且牵涉rbd相对于s蛋白的其余部分而言的方向变化、rbd与相邻结构域(亚结构域1，sd1)的分开以及在rbd和sd1的残基之间与亚基s2的接触的丧失。

10、采取“向上”类型构象的rbd暴露了与受体相互作用的表面，因此这是相关于进入细胞的过程的起始而言在生物学上有活性的构象。通过冷冻电镜术的研究已显示，s蛋白以某个比例采取所描述的类型的构象：“全向下”、“一个向上”、“两个向上”和“全向上”。rbd的该呼吸现象允许病毒“节省”可得的受体结合位点的数量/刺突(s三聚体)，并且以这种方式使诱导阻断与受体结合的强有力的中和抗体的可能性最小化。这种保护rbd结构域的ace2结合位点的策略是可行的，这首先是由于10nm的该相互作用的高亲和力。另一方面，ace2的二聚体结构具有这样的独特性，即在该链中的rbd结合位点与其对应物相隔大约10nm(与在sars-cov-2病毒粒子表面上的相邻刺突之间存在的距离相当)。因此，在sars-cov-2病毒的结合过程期间受体ace2的完全占据仅需要在两个相邻的s三聚体中的以“向上”构象的rbd，从而导致具有非常高的表观亲和力的二价相互作用。

11、s蛋白和rbd的结构-功能关系的表征在疫苗候选物(尤其是基于重组rbd蛋白的亚单位疫苗候选物)的设计中具有重要意义。这些候选物应当能够诱导强力的抗体应答(高免疫原性)。同时，应答的质量具有很大的重要性；所生成的抗体应当具有高亲和力，能够与rbd-ace2相互作用竞争，甚至在上面所描述的二价相互作用的情况下。

12、s蛋白的三聚体构象(其包括亚基s1和s2)实际上是该蛋白质的亚稳态的预融合构象：在与受体ace2相结合的过程之后，这介导结构去稳定化、蛋白质剥离或亚基s1丧失(这是其中牵涉由弗林蛋白酶和蛋白酶tmprss2进行的s1/s2和s2*蛋白水解切割的过程，其导致采取融合结构)、融合肽暴露和膜融合过程。因此，rbd-ace2相互作用的抑制阻断病毒复制循环的所有后来的过程，并且构成基于rbd的针对冠状病毒的疫苗策略的基本机制基础。

13、在专业文献中存在有一些保证通过鼻内途径的免疫接种对于预防sars-cov-2感染的适切性的要素。例如，已知在具有covid-19的有症状和无症状的患者中，鼻拭子生成了比咽拭子更高的病毒载量，这证明鼻上皮是初始感染和传播的门户(zhou p等人,nature.2020mar,579(7798):270-3)。此外，在特定的呼吸道、角膜和肠上皮细胞中检测到与sars-cov-2的病毒进入相关联的基因。在鼻上皮细胞中，这些基因与在先天免疫中所牵涉的基因共表达，这强调了这些细胞在初始病毒感染、其繁殖和其消除中的潜在作用。这些发现也暗示，鼻上皮细胞是对于个体内和个体间传播的可能储库(sungnak w等人,naturemedicine.2020may,26(5):681-7)。

14、现有数据暗示，在病毒复制循环的初始阶段期间，ace2可能是对于sars-cov-2病毒进入的一个限制因素。尽管通常是低的表达水平，但是ace2通过呼吸道在多种类型的上皮细胞中以及在ii型肺泡上皮细胞中以与以前的研究相一致的方式进行表达。特别地，鼻上皮细胞在呼吸系统中的所有所调查的细胞之中显示出最高的表达(sungnak w等人,nature medicine.2020may,26(5):681-7)。在鼻样品中相对高的ace2表达和平行的来自鼻表面的上皮培养物的高感染性暗示，鼻腔对于sars-cov-2的早期感染来说是一个盛产位点。可能的是，鼻感染由表面上皮中的纤毛细胞占支配地位。病毒的感染/复制功效从近端气道至肺泡呼吸区域明显地变化(hou yj等人,cell.2020may 27)。总之，鉴于鼻运输可能是sars-cov-2传播的关键特征，通过鼻内途径施用的药物和疫苗对于限制繁殖来说可能是非常有效的。

15、另一方面，在大肠杆菌(escherichia coli)中产生的乙型肝炎病毒核衣壳抗原(hbcag)(具有183个氨基酸的完全抗原)的病毒样颗粒(vlp)是一种大约30nm的纳米颗粒(aguilar jc,lobaina y,muzio v等人,immunol cell biol 2004,82:539-546)。以前已描述了这种颗粒的佐剂或免疫增强效应(riedl p等人,j immunol 2002,168(10):4951-4959；vanlandschoot p,cao t,leroux-roels g.antiviral res 2003,60(2):67-74)。当与其他抗原共施用时，表现出该免疫增强效应，无论通过鼻途径(aguilar jc等人,immunolcell biol 2004,82(5):539-546；lobaina y等人,mol immunol 2005,42(3):289-294)还是通过肠胃外途径(riedl p等人,j immunol 2002,168(10):4951-4959)。此外，已知该vlp在小鼠中是非常具有免疫原性的，其中生成与在人中所观察的那种相似的免疫应答(milich dr,semin liver dis 1991,11(2):93-112)。最后，在小鼠中所获得的结果在很大程度上预测了其可以在人中成功。

16、在为预防由冠状病毒引起的感染而采用的策略之中包括了开发亚单位疫苗，其在于使用通过重组dna技术而获得的病毒蛋白质作为免疫原。在这些之中，几种基于rbd结构域的疫苗候选物已被提出和/或处于临床阶段。大部分疫苗候选物基于单体rbd结构域，它们不再现病毒的刺突蛋白的四级结构并且稍微具有免疫原性。相反，这些候选物中的一些基于多聚体构建物，例如rbd与三聚体“卷曲螺旋”区段的融合蛋白。然而，这些构建物未以最佳方式模拟在天然s蛋白的rbd结构域之间的空间关系，也未模拟病毒颗粒所固有的超分子结构。还采用了与载体蛋白和/或基于聚合物(其具有免疫刺激特性)的纳米颗粒进行化学缀合的策略。具有广泛的辅助t表位清单的载体蛋白增加了所负载的蛋白质的免疫原性，并且其与所负载的蛋白质的缀合构成了现有技术中现有的疫苗候选物的设计策略。化学缀合导致在rbd蛋白和载体蛋白或聚合物的官能团之间的共价键的形成，通过基本上随机性质的化学反应，这可以影响在rbd结构域或载体蛋白的表面上的潜在地重要的表位，通常导致高度异质的制备物，其需要额外的纯化步骤以消除不希望的试剂和副产物。

17、由于这个原因以及冠状病毒感染的潜在影响，设计和获得在预防由该病毒类型引起的感染中有效的新型疫苗抗原仍然是令人感兴趣的。

技术实现思路