一种南极磷虾主要过敏原的制备方法与流程

本发明属于过敏原蛋白提取，具体涉及到一种南极磷虾原肌球蛋白提取、纯化及制备方法。

背景技术：

1、南极磷虾属于磷虾目磷虾科磷虾属，是生活在南冰洋的一种类虾的海洋甲壳类动物。南极磷虾具有丰富的生物资源和较高的营养价值，是未来优质动物蛋白的主要来源。由于南极磷虾被广泛用作食品原料，其潜在的致敏性（过敏原蛋白引发）和其他食品安全问题受到了特别关注。

2、原肌球蛋白已经被证实是甲壳类水产品的主要过敏原，是一个分子量为34-38kda的热稳定性蛋白，其蛋白质的氨基酸序列高度保守，在许多无脊椎动物中被认为是一种交叉反应的过敏原。基于此免疫交叉反应，研究人员利用甲壳类动物过敏患者的血清结合免疫印迹方法证实了原肌球蛋白是南极磷虾的主要过敏原。在研究过敏原的致敏特性、生物体内的化学变化、多种抗体的制备及过敏原检测时，往往需要纯度更高的过敏原。获得纯化、单一过敏原组分在研究加工方式对过敏原活性的影响、开发低致敏性海产品的食品加工技术中具有重要的意义。

3、甲壳类水产品中主要过敏原的制备方法主要包括传统的分离纯化方法，如盐溶液提取、盐析和层析柱纯化；另外，使用基因克隆及重组蛋白表达手段得到重组过敏蛋白，也是过敏原制备的一种方法。利用基因工程技术得到的重组过敏蛋白的结构特征及致敏性，在一定程度上并不能与天然过敏原相比较，其构建的动物致敏模型也并不能完全模拟实际情况下的食物过敏，也就无法准确地探索其致敏机理。鉴于此，仍然需要大量天然提纯且具有高纯度及具有生物活性的过敏蛋白。传统的分离纯化方法制备过敏原，针对不同的甲壳类水产品，其提取和纯化制备方法也有较大的区别。目前，关于极地海洋生物过敏原的研究较少，关于极地甲壳类水产动物过敏原的研究则更少，随着我国极地海洋权益的增加和极地渔业的发展，亟需开展这方面的研究。因此，针对南极磷虾主要过敏原，我们对其制备技术进行了研究。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题：提供一种南极磷虾主要过敏原的制备方法，所制备的过敏原纯度较高，且与虾/蟹过敏患者的血清具有很高的ige结合反应性。本发明提供的主要过敏原制备及方法可以供后续磷虾过敏原致敏性及致敏机理研究提供样本及基础信息，也为后续研究加工方式对过敏原活性的影响、开发低致敏性海产品的食品加工技术具有重要的意义。

2、为了实现上述目的，本发明提出了如下技术方案：一种南极磷虾主要过敏原的制备方法，包括，对tris-nacl缓冲液提取的南极磷虾肌原纤维蛋白溶液依次进行加热煮沸、等电点沉淀；对沉淀后的蛋白进行硫酸铵分级盐析，sds-page分析确定最佳盐析条件；对最佳盐析条件下获得的沉淀物进行缓冲盐透析，然后将透析液上样于阴离子交换柱进行洗脱分离；对洗脱液进行透析、冻干，得到南极磷虾主要过敏原；sds-page分析主要过敏原的蛋白成分及纯度；对主要过敏原的血清ige反应性进行考察；对过敏原的一级结构进行鉴定，最终确定了制备的主要过敏原为南极磷虾原肌球蛋白（tm）。

3、 优选的，所述南极磷虾肌肉组织与tris-hcl缓冲液的料液比为1:5～1:8（w/v），于冰浴下均质机均质2～3 min。

4、 优选的，所述均质并离心后的沉淀重新悬浮于8～10倍体积的1×pbs缓冲液中，并于4 °c、离心力10000～12000 r/min下离心20～25 min，重复这一步骤2～4次。

5、 优选的，所述pbs缓冲液清洗后的沉淀复溶于含0.1～0.2 m nacl的tris-hcl（50～100 mm，ph 7.5）中，使用均质机于冰浴下低速搅拌10～40 s，并置于4 °c中过夜浸提；次日，于4 °c、离心力12000～14000 r/min下离心20～25 min，离心后得到的沉淀重复此提取步骤2～3次；最后合并几次提取得到的过敏原粗提物。

6、 优选的，所述对提取的过敏原粗提物进行热处理，即将粗提物于100 °c下煮沸10～20 min，冷却后离心取上清液。

7、 优选的，所述对煮沸后得到的粗提物上清液进行等电点沉淀，调节溶液的ph值至4.4～4.6，4 °c下静置1～2 h；离心后得到的沉淀复溶于20 mm、ph 7.5的tris-hcl缓冲液中，并调节溶液的ph至7.5。

8、优选的，所述等电点沉淀后所得蛋白溶液的浓度，采用bca蛋白质定量检测试剂盒进行测定。

9、 优选的，所述对煮沸、等电点沉淀后所得蛋白溶液进行硫酸铵分级盐析，最终，最佳盐析条件为：蛋白溶液浓度为1～3 mg/ml；向1倍体积的蛋白溶液中逐滴加入4倍体积60%饱和度的硫酸铵溶液（ph，7.4～7.6），充分混匀后，冰浴放置30～60 min；再次加入2倍体积此蛋白溶液，混匀后继续冰浴放置30～60 min；然后加入1倍体积饱和硫酸铵溶液（ph，7.4～7.6），混匀后继续冰浴放置30～60 min；再加入1倍体积饱和硫酸铵溶液，充分混匀后，置于4 °c下过夜静置；次日，离心分离上清和沉淀。

10、优选的，所述对硫酸铵分级盐析得到的沉淀进行sds-page分析，以根据目标蛋白的电泳条带得出硫酸铵盐析的最佳条件。

11、 优选的，所述阴离子交换柱分离主要过敏原，层析填料为二乙胺基乙基键合琼脂糖凝胶；填料装柱长度40～50 cm，内径3～4 cm，柱流速1～2 ml/min；蛋白洗脱梯度：含0.2～0.25 m nacl、0.4～0.45 m nacl、0.8～1m nacl的tris-hcl（20 mm，ph7.5）洗脱溶液。

12、优选的，所述对阴离子交换柱分离后的洗脱液进行蛋白含量测定，采用考马斯亮蓝g-250染色法测定蛋白质含量。

13、优选的，所述对阴离子交换柱分离后的蛋白洗脱液进行透析除盐、真空冷冻干燥，得到南极磷虾主要过敏原。

14、本发明还提供了上述制备方法得到的南极磷虾主要过敏原，其中，所述南极磷虾主要过敏原与虾/蟹过敏患者血清具有很强的ige反应性，说明所制备的过敏原具有免疫反应性。

15、本发明还提供了上述制备方法得到的南极磷虾主要过敏原，其中，对制备的南极磷虾主要过敏原进行一级结构鉴定，鉴定结果表明此主要过敏原为南极磷虾原肌球蛋白（tropomyosin，tm）。

16、具体的：

17、所述的对过敏原的血清ige反应性，即对制备的南极磷虾主要过敏原进行血清ige反应性检测，即采用蛋白斑点免疫印迹法验证过敏原的ige结合能力，所述方法主要步骤包括，取nc膜，在超纯水中浸泡10～15 min后，取出并放置至膜半干；制备的过敏原溶于cbs溶液后点样于nc膜，过敏原的点样量2～5mg/点，点样体积1～5 ml/点，点样后的nc膜室温静置晾干10～15 min；随后将膜浸泡于5%的脱脂奶粉中封闭1～2 h；封闭后用1×tbst洗膜3～5次，每次3～5min；加入用1×tbst稀释的虾/蟹过敏患者血清（稀释比例1:4～1:6，v/v），于4°c下孵育过夜；一抗孵育结束后，洗膜，加入用1×tbst稀释的hrp标记的羊抗人ige（稀释比例1:4000～1:8000，v/v），摇床上室温孵育1～1.5 h；二抗孵育结束后，洗膜，将膜置于ecl发光试剂中反应1～2min后显色，用凝胶成像仪拍照，曝光时间10～50 s。

18、所述对制备的南极磷虾主要过敏原的一级结构进行鉴定，其鉴定步骤包括，200～500 μg冻干的过敏原粉末溶解于50 mm nh4hco3中，经过还原（100～500 mm dtt，50～60 °c下还原30～60 min）和烷基化（100～500 mmiaa于室温下避光烷基化反应15～30 min）处理后，加入trypsin（1:40～1:50，w/w），于37 °c下酶解15～20 h；酶解产物脱盐后冻干，复溶于0.1%～0.15%甲酸水溶液中。液相色谱-串联质谱分析条件：流动相分别为0.1%～0.15%甲酸水溶液（a液）和0.1%～0.15%甲酸的乙腈水溶液（乙腈体积比80%，b液）；色谱柱以95%的a液平衡后，样品上样至分析柱acclaim pepmap rslc，c18（75 μm×25 cm，2 μm）；30 min内5%到35～40%流动相b；质谱离子源为纳升喷雾nano flex离子源；喷雾电压1.7～2.2 kv；离子传输管加热温度265～280 °c；质谱扫描方式为dda，一级质谱扫描范围 m/z 300-2000，分辨率70000；多肽及其二级碎片的质荷比按照每次全扫描后采集20～25个碎片图谱；hcd设置为28～35 ev；质谱测试原始文件用mascot 2.2软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果，搜库参数为：酶，trypsin；数据库，ncbi和uniprot下载的 euphausia superba蛋白数据库；固定修饰，carbamidomethyl（c）；可变修饰，oxidation（m）；最大漏切位点，2；肽一级质谱质量容差，10～20 ppm；二级碎片质量容差，0.05～0.1 da。

19、本发明所具有的有益效果：

20、本发明以南极磷虾肌肉组织为原料，采用tris-nacl缓冲液、加热煮沸、等电点沉淀、硫酸铵分级盐析、阴离子交换柱分离、透析、冻干等技术，制备得到南极磷虾主要过敏原，其中煮沸后再提取纯化过敏原更能真实地反映人们对虾蟹等甲壳类水产品的食用烹饪方法。本发明制备工艺操作简单，所制备的过敏原纯度较高，耐受高温处理，与虾/蟹过敏患者血清具有很强的ige反应性。

21、南极磷虾因其优良的营养价值和较高的经济价值，已经成为我国重要的远洋捕捞对象，其潜在的食品安全问题有可能会对我国远洋渔业，特别是对南极磷虾捕捞和加工产生巨大的影响。如何防控南极磷虾可能引发的食物过敏问题已经成为一项迫切而紧急的工作。因此本发明以南极磷虾为研究对象，分离纯化制备其主要过敏原，并对过敏原的致敏性进行考察、一级结构进行鉴定，这对于阐明南极磷虾潜在致敏问题的预警和防控具有现实意义。

22、在研究过敏原的致敏特性，生物体内的化学变化，致敏反应机理，致敏性消减技术，以及多种抗体的制备、免疫技术检测食品中的过敏原时，往往需要纯度更高的过敏原，因此如何制备高纯度的过敏原成为研究食物过敏的一个重要课题。与现有的过敏原提取纯化技术相比，本发明采用温和的蛋白提取缓冲液、高温加热煮沸、等电点沉淀、特定饱和度的硫酸铵分级盐析及特定摩尔浓度的nacl洗脱液对南极磷虾主要过敏原进行了有效地分离和纯化，去除了南极磷虾中含量最丰富的精氨酸激酶（蛋白）的干扰，得到了纯度较高且保持过敏原活性的南极鳞虾主要过敏原tm。本发明提供的主要过敏原制备及其方法可以供后续磷虾过敏原致敏性及致敏机制研究提供样本及基础信息，也为后续研究加工方式对过敏原活性的影响、开发低致敏性海产品的食品加工技术具有重要的意义。