大肠杆菌FIMH突变体和其用途的制作方法

本公开涉及突变的大肠杆菌(escherichia coli)fimh多肽和其使用方法。

背景技术：

0、发明背景

1、尿路感染(uti)在五分之一的女性一生中至少影响一次且造成显著的发病率和死亡率，给医疗保健系统带来了沉重的负担。尽管若干种不同细菌能导致uti，但最常见的病因(90-95％病例)是革兰氏阴性菌大肠杆菌(e.coli)。大部分大肠杆菌uti由尿路致病性大肠杆菌(upec)导致，所述大肠杆菌定植在胃肠道并从粪便菌丛迁移到泌尿生殖道，在该处其粘附宿主尿路上皮细胞，因而建立尿路上行性感染的储存宿主(reservoir)。菌毛粘附素，包括1型菌毛帮助粘附，所述粘附素结合上皮层中或分泌入尿液的甘露糖化糖蛋白。1型菌毛在临床upec分离物中高度保守且由称为fim的基因簇编码，fim编码辅助蛋白(fimc、fimd)、多种结构亚基(fime、fimf、fimg)和称为fimh的粘附素。fimh对小鼠模型中uti感染的所有特征而言是必需的，所述模型模仿人膀胱感染的方面(hannan等，plospathog.2010aug12；6(8):e1001042；doi:10.1371/journal.ppat.1001042；schwartz等，infect immun.2011oct；79(10):4250-9.doi:10.1128/iai.05339-11)。通过模拟甘露糖化受体而靶向fimh的小分子抑制剂进一步确认fimh在uti中的作用，并在动物模型中显示治疗前景(cusumano ck等.sci transl med.2011；3(109):109ra115.doi:10.1126/scitranslmed.3003021)。另外，fimh在大肠杆菌人膀胱炎分离物中处于正选择下(chensl,et al.proc natl acad sci u s a.2009dec 29；106(52):22439-44.doi:10.1073/pnas.0902179106)且正选择的残留物可能影响膀胱炎小鼠模型中的毒力(schwartz,d.j.等.proc natl acad sci u s a 110,15530-15537,doi:10.1073/pnas.1315203110(2013))。

2、fimh由2个结构域构成，即负责结合甘露糖化糖蛋白的凝集素结合域(fimhld)和菌毛蛋白结构域。菌毛蛋白结构域用于通过称为供体链交换的机制连接fimh与其他菌毛结构亚基如fimg(le trong,i等,j.struct biol.2010dec；172(3):380-8.doi:10.1016/j.jsb.2010.06.002)。fimh菌毛蛋白结构域形成不完全免疫球蛋白折叠，产生的沟提供fimg n末端β链的结合位点，形成fimh与fimg之间的强分子间连接。尽管fimhld能以可溶、稳定形式表达，但全长fimh单独并不稳定(vetsch,m.等.j.mol.biol.322:827–840(2002)；barnhart mm等,proc natl acad sci u s a.(2000)jul5；97(14):7709-14)，除非在与伴侣fimc的复合体中或与用肽形式或作为融合蛋白的fimg供体链肽补足(barnhart mm等.,proc natl acad sci u s a.(2000)jul 5；97(14):7709-14；sauer mm等.nat commun.(2016)mar 7；7:10738；barnhart mm等.jbacteriol.2003may；185(9):2723-30)。先前描述了通过经甘氨酸-丝氨酸接头来连接fimg供体肽与全长fimh的全长fimh分子的设计和表达(pct intl.公开号wo2021/084429,2021年5月6日公开)，并命名为fimh-dsg。

3、fimhld被认为在刺激功能性免疫原性方面是弱免疫原。一些研究表明，尽管能用有或没有佐剂的fimhld引发结合抗体滴度，但仅在佐剂存在下观察到功能性中和滴度(pctintl.公开号wo2021/084429,2021年5月6日公开)。研究表明将fimh锁定于开放构象，对甘露糖苷配体的亲和性下降，提高功能性免疫原性(kisiela,d.i.等,proc natl acad sci us a 110,19089-19094(2013))。因此，本领域需要新的fimh突变体，其对甘露糖苷配体的亲和性下降且生化性质改善，产生相对于野生型fimh提高的功能性免疫原性。

技术实现思路

0、发明概述

1、本公开涉及大肠杆菌fimh突变多肽(其产生改善的生化性质和免疫原性)的设计，包含这样的多肽的组合物以及其应用。例如，一方面，本公开提供突变的fimh多肽，其相对于野生型fimh多肽的氨基酸序列包含至少一个氨基酸突变，其中突变位置选自：f1、p12、g14、g15、g16、a18、p26、v27、v28、q32、n33、l34、v35、r60、s62、y64、g65、l68、f71、t86、l107、y108、l109、v112、s113、a115、g116、v118、a119、a127、l129、q133、f144、v154、v155、v156、p157、t158、v163和v185，其中氨基酸位置根据seq id no:59编号。

2、另一方面是突变的fimh多肽，其包含选自以下的至少一个突变：f1i、f1l、f1v、f1m、f1y、f1w、p12c、g14c、g15a、g15p、g16a、g16p、a18c、p26c、v27a、v27c、v28c、q32c、n33c、l34c、l34n、l34s、l34t、l34d、l34e、l34k、l34r、v35c、r60p、s62c、y64c、g65a、l68c、f71c、t86c、l107c、y108c、l109c、v112c、s113c、a115v、g116c、v118c、a119c、a119n、a119s、a119t、a119d、a119e、a119k、a119r、a127c、l129c、q133k、f144c、v154c、v156c、p157c、t158c、v163i和v185i，或其任何组合。例如，突变的fimh多肽包含突变g15a和g16a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变p12c和a18c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变g14c和f144c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变p26c和v35c。还有例如，突变的fimh多肽包含突变p26c和v154c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变p26c和v156c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变v27c和l34c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变v28c和n33c。还有例如，突变的fimh多肽包含突变v28c和p157c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变q32c和y108c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变n33c和l109c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含n33c和p157c。还有例如，突变的fimh多肽包含突变v35c和l107c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变v35c和l109c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变s62c和t86c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变s62c和l129c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变y64c和l68c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变y64c和a127c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变l68c和f71c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变v112c和t158c。还有例如，突变的fimh多肽包含突变s113c和g116c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变s113c和t158c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变v118c和v156c。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变a119c和v155c。还有例如，突变的fimh多肽包含突变l34n和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变l34s和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变l34t和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变l34d和v27a。还有例如，突变的fimh多肽包含突变l34e和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变l34k和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变l34r和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变a119n和v27a。还有例如，突变的fimh多肽包含突变a119s和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变a119t和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变a119d和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变a119e和v27a。还有例如，突变的fimh多肽包含突变a119k和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变a119r和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变g15a和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变g16a和v27a。还有例如，突变的fimh多肽包含突变g15p和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变g16p和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变g15a、g16a和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变g65a和v27a。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变v27a和q133k。进一步，例如，突变的fimh多肽包含突变g15a、g16a、v27a和q133k。进一步，例如，突变的fimh多肽包含seq idno:2-58和60-64中任一者的序列。进一步，例如，本文所公开的突变的fimh多肽，其中所述多肽是经分离的。

3、在另一个示例中，本公开提供药物组合物，其包含(i)本文所公开的突变的fimh多肽和(ii)药学上可接受的载体。

4、在另一个示例中，本公开提供包含本文所公开的突变的fimh多肽的免疫原性组合物。例如，所述免疫原性组合物还包含至少一种额外抗原，如多糖或糖缀合物或蛋白。进一步，例如，所述免疫原性组合物还包含至少一种佐剂。

5、在另一个示例中，本公开提供核酸分子，其包含编码本文所公开的突变的fimh多肽的氨基酸序列的核苷酸序列。

6、在另一个示例中，本公开提供本文所公开的突变的fimh多肽，其中所述多肽具有免疫原性。

7、本公开还提供重组哺乳动物细胞，其包含编码本文所公开的突变的fimh多肽的多核苷酸。

8、本公开还提供包含本文所公开的重组细胞的培养物，其中所述培养物的大小是至少5升、至少10升、至少20升、至少50升、至少100升、至少200升、至少500升、至少1000升或至少2000升。

9、本公开还提供生产本文所公开的突变的fimh多肽的方法，所述方法包括在合适条件下培养本文所公开的重组哺乳动物细胞，从而表达所述多肽；和收获所述多肽。

10、本公开还提供(i)在对象中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫应答，或(ii)在对象中诱导对肠外致病性大肠特异的调理吞噬抗体和/或中和抗体产生的方法，其中所述方法包括给对象施用有效量的本文所公开的组合物。在一个示例中，所述对象处于发展尿路感染的风险。在另一个示例中，所述对象处于发展菌血症的风险。在另一个示例中，所述对象处于发展败血症的风险。在另一个示例中，所述对象处于发展克罗恩氏病的风险。

11、本公开还提供在哺乳动物中引发针对大肠杆菌的免疫应答的方法，包括给所述哺乳动物施用有效率的本文所公开的组合物。在一个示例中，所述免疫应答包括针对大肠杆菌的调理吞噬抗体和/或中和抗体。在另一个示例中，所述免疫应答保护哺乳动物免于大肠杆菌感染。

12、本公开还提供在对象中预防、治疗或缓解细菌性感染、疾病或病症的方法，包括给对象施用免疫有效量的本文所公开的组合物。