一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法及其应用

1.本发明涉及微生物降解技术领域，具体涉及一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法及其应用。


背景技术：

2.苯酚属于一种常见的酚类物质，广泛应用于杀菌剂、树脂、石油和药品等生产过程中，含酚废水的排放不仅对环境造成严重的污染，还会危害到动、植物以及人类的健康。人类长期饮用被苯酚污染过的水或食物，会损害肝、肾功能，甚至导致死亡。因此，该类废水具有来源广、水量多、危害大和盐度高的特点。
3.作为一种需要被优先控制的污染物，含酚废水的处理方法主要分为物理法、化学法和生物法。其中生物法以其经济、高效和无二次污染等优点，受到越来越多的关注。目前科学家们已经筛选出多种苯酚降解菌，主要有芽孢杆菌属(bacillus sp.)、假单胞菌属(pseudomonas sp.)、不动杆菌属(acinetobacter sp.)和红球菌属(rhodococcus sp.)等，但废水中较高的盐度严重制约了这些微生物降解苯酚的能力。因此，研究既可以高效降解苯酚又可以耐受高盐度的微生物仍然是国内外学者工作的重点。
4.海洋微生物的生存环境与陆生的微生物存在着巨大差异，海洋环境的特殊性造就了海洋微生物的多样性和特异性。由于海洋环境有高盐、高压、低温、寡营养、低光照(甚至无光照)等特征，海洋微生物长期适应复杂的海洋环境而生存，因而具备嗜盐、嗜压、嗜冷、低营养性、趋化性与附着生长、多形性、发光性等独特性状，使其在环境修复领域中具有很大的应用潜力。因此，从深海极端环境中筛选出耐盐且高效降解苯酚的微生物菌种将为高盐有机工业废水的处理提供一种的可行性思路。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的问题是：提供一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法及其应用，能够解决高盐环境下微生物难降解苯酚的问题。
6.本发明为解决上述问题所提供的技术方案为：一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法，所述方法包括以下步骤
7.(1)、深海耐盐菌的富集；
8.(1.1)、培养基配制；
9.(1.2)、混合菌液的富集：取深海底泥样品加入到培养基中培养5天，然后以10％的接种量(v/v)转接至新鲜的经同样处理的培养基中，连续富集培养四次；检测第五代富集液中菌种的浓度；当第五代培养液在培养5天后菌浓度大于1
×
109个/ml时，富集培养结束，得到富集培养菌液；
10.(2)、混合菌种耐盐能力驯化：将上述富集培养菌液进行驯化培养，采用逐步提高驯化培养的培养基中nacl浓度的方法对富集培养菌液的耐盐能力进行梯度驯化。
11.优选的，所述步骤(1)中培养基的配方为将以下重量份数配比的组分：蛋白胨5份、
酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、nacl 19.45份、mgcl
2 5.98份、na2so
4 3.24份、cacl
2 1.8份、kcl 0.55份、na2co
3 0.16份、kbr 0.08份、srcl
2 0.034份、h3bo
3 0.022份、na2sio
3 0.04份、naf 0.0024份、nh4no
3 0.0016份、na2hpo
4 0.008份加热溶解于蒸馏水中高压灭菌。
12.优选的，高压灭菌的条件为自然ph，温度为121℃，时间为15分钟。
13.优选的，所述步骤(1.2)中培养的条件为30℃、150rpm摇床培养5天。
14.优选的，所述步骤(1.2)中检测第五代富集液中菌种的浓度的方法具体包括
15.(1.2.1)、菌浓标准曲线的制作
16.用血细胞计数板计数培养24小时的菌悬液，取1ml的菌悬液放入离心机，在3000rpm下离心5min，然后再将上清液转入另一个干净的1.5ml的离心管中，再在10000rpm下离心5min，倒掉上清液，并用无菌水分别稀释调整浓度到每毫升的含菌量为3.2
×
108、1.6
×
108、8
×
107、4
×
107、2
×
107和1
×
107，然后测定于660nm波长处各管的od值，此时用无菌水做空白对照，最后以od值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制出菌浓标准曲线；
17.(1.2.2)、实际菌浓的测定
18.取1ml实际菌样，在3000rpm下离心5min，然后再将上清液转入另一个干净的1.5ml的离心管中，再在10000rpm下离心5min，倒掉上清液，用1ml无菌水去冲离心管底的菌团，并涡旋3min，测定此时的od
600
值，通过菌浓标准曲线计算得到其菌浓。
19.优选的，所述步骤(2)中驯化培养的培养基中，nacl的浓度调整为0％-12％，具体可以为0％，2％，4％，6％，8％，10％，12％，或上述任意两个值之间的任意数值。
20.优选的，所述步骤(2)中驯化培养的条件包括温度为28-30℃、转速为120-150r/min、培养时间为5-7天，而后测定培养基中菌种浓度，以确定菌种是否能够耐受该设置下的盐浓度，每组实验设置三次重复。
21.优选的，所述步骤(2)中驯化培养的培养基中，除nacl外，还包括以下质量份数的组分：蛋白胨5份、酵母浸粉1份，加热溶解于蒸馏水中，自然ph，121℃高压灭菌15分钟，备用。
22.本发明的另一目的在于提供一种通过如上述任意一项选育方法选育得到的深海耐盐苯酚降解菌在高盐有机工业废水中的应用。
23.与现有技术相比，本发明的优点是：本发明选育得到的深海耐盐苯酚降解菌具有盐度适应范围广、耐盐含量高、苯酚降解能力强及降解速率快等优点，在高盐苯酚废水生物处理中具有较大的应用潜力。
附图说明
24.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
25.图1是本发明菌浓标准曲线图；
26.图2是本发明菌种对nacl的最大耐受能力示意图；
27.图3是本发明苯酚标准曲线图；
28.图4是本发明菌种对不同浓度苯酚的降解图；
29.图5是本发明深海耐盐菌驯化培养液的属水平物种丰度占比图；
30.图6是本发明深海耐盐菌群对实际废水的处理效果图。
具体实施方式
31.以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
32.应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
33.还应当理解，在此本发明实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明实施例。如在本发明实施例说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
34.在本发明的描述中，需要说明的是，对于方位词，如有术语“中心”，“横向”、“纵向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示方位和位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于叙述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定方位构造和操作，不能理解为限制本发明的具体保护范围。
35.此外，如有术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或隐含指明技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”特征可以明示或者隐含包括一个或者多个该特征，在本发明描述中，“数个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
36.在本发明中，除另有明确规定和限定，如有术语“组装”、“相连”、“连接”术语应作广义去理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；也可以是机械连接；可以是直接相连，也可以是通过中间媒介相连，可以是两个元件内部相连通。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述的术语在本发明中的具体含义。
37.本发明提供了一种利用深海耐盐菌降解苯酚的方法，
38.1.深海耐盐菌的富集
39.(1)培养基配制
40.本步骤中所使用的2216e液体培养基1l配方为：蛋白胨5g、酵母浸粉1g、柠檬酸铁0.1g、nacl 19.45g、mgcl
2 5.98g、na2so
4 3.24g、cacl
2 1.8g、kcl 0.55g、na2co
3 0.16g、kbr 0.08g、srcl2 0.034g、h3bo
3 0.022g、na2sio
3 0.04g、naf 0.0024g、nh4no
3 0.0016g、na2hpo
4 0.008g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，自然ph，121℃高压灭菌15分钟，备用。
41.(2)混合菌液的富集
42.取1.0g深海底泥样品加入到100ml含有海盐培养基中(以下简称2216e)培养，30℃、150rpm摇床培养5天，然后以10％的接种量(v/v)转接至新鲜的经同样处理的培养基中，连续富集培养四次。采用紫外分光光度计检测第五代富集液中菌种的浓度。当第五代培养液在培养5天后菌浓可以大于1
×
109个/ml时，富集培养结束，所获得的富集培养菌液命名为nh-1。
43.(3)菌浓测试方法：紫外分光光度法
44.(ⅰ)菌浓标准曲线的制作
45.用血细胞计数板计数培养24小时的菌悬液，取1ml的菌悬液放入离心机，在
3000rpm下离心5min，然后再将上清液转入另一个干净的1.5ml的离心管中，再在10000rpm下离心5min，倒掉上清液，并用无菌水分别稀释调整浓度到每毫升的含菌量为3.2
×
108、1.6
×
108、8
×
107、4
×
107、2
×
107和1
×
107，然后测定于660nm波长处各管的od值，此时用无菌水做空白对照，最后以光密度(od)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制出菌浓标准曲线。
46.(ⅱ)实际菌浓的测定
47.取1ml实际菌样，在3000rpm下离心5min，然后再将上清液转入另一个干净的1.5ml的离心管中，再在10000rpm下离心5min，倒掉上清液，用1ml无菌水去冲离心管底的菌团，并涡旋3min，测定此时的od
600
值，通过菌浓标准曲线计算得到其菌浓。
48.2.混合菌种耐盐能力驯化
49.将上述富集培养菌液进行驯化培养，采用逐步提高所述驯化培养的培养基中nacl浓度的方法对富集培养菌液(nh-1)的耐盐能力进行梯度驯化。
50.所述驯化培养的培养基中，nacl的浓度调整为0％-12％，具体可以为0％，2％，4％，6％，8％，10％，12％，或上述任意两个值之间的任意数值。
51.将上述富集培养菌液(nh-1)以10％(v/v)的接种量接种于新鲜配制的驯化培养基中，所述驯化培养的条件包括温度为28-30℃、转速为120-150r/min、培养时间为5-7天，而后测定培养基中菌种浓度，以确定菌种是否能够耐受该设置下的盐浓度，每组实验设置三次重复。
52.所述驯化培养的培养基中，除nacl外，还包括的组分：蛋白胨5g、酵母浸粉1g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，自然ph，121℃高压灭菌15分钟，备用。
53.由图2可知：随着盐浓度的增加，菌种的生长情况受到了一定程度的抑制，但是该菌群在2％-10％的盐浓度下生长良好，最大菌浓均可达到109cells/ml，说明经梯度驯化后该深海富集菌种(nh-1)对nacl的最大耐受能力可以高达10％。
54.3.菌种对不同初始浓度苯酚的降解能力
55.配制不同浓度的苯酚降解培养基，苯酚浓度为200-1200mg/l，具体可以为200mg/l，400mg/l，600mg/l，800mg/l，1000mg/l，1200mg/l，或上述任意两个值之间的任意数值。将上述富集菌液(nh-1)以10％(v/v)的接种量接种于新鲜配制的苯酚降解培养基中，所述苯酚降解培养的条件包括温度为28-30℃、转速为120-150r/min、培养时间为5-7天，而后测定菌种对苯酚的降解情况，每组实验设置三次重复。
56.所述苯酚降解培养基中，除苯酚外，还包括组分：蛋白胨5g，酵母浸粉1g，nacl 100g,加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，备用。
57.(1)苯酚浓度测定方法：紫外分光光度法
58.由于苯酚在270nm波长处有稳定的最大吸收峰，且浓度与od
270nm
有良好的线性关系(y＝15.34x-0.0011，其中r2＝0.9998，y为od
270
nm值，x为苯酚浓度)，因此使用紫外分光光度法测定接菌培养液和未接菌对照培养液中的苯酚含量，按(不接菌对照苯酚浓度-接菌培养液苯酚浓度)/不接菌对照苯酚浓度
×
100％计算苯酚降解率。最终三次重复实验得到接菌nh-1菌株的培养液苯酚降解率。
59.60.(c0：不接菌对照苯酚浓度；c：接菌培养液苯酚浓度)
61.由图4可知：该深海富集培养菌液(nh-1)对苯酚有较好的降解效果，可以耐受1000mg/l的苯酚，苯酚浓度在1000mg/l范围内均有良好的降解效果，降解率高达90％以上。
62.4.目标菌种群落组成分析(门及属水平)
63.深海耐盐菌群驯化培养液培养时，考察不同培养时期微生物群落结构的变化。将制得的深海耐盐菌驯化培养液以10％的接种量接种到含10％nacl和1000mg/l苯酚的苯酚降解培养基中，在29℃、120r/min的条件下进行恒温恒速培养。
64.待培养至第2天、第7天、第10天时，分别取100ml菌液，先以3000rpm的转速离心10min12000 rpm的转速离心10min后收集菌体，将菌体放置于-80℃冰箱保存，送至天津诺和致源生物检测公司对混菌微生物群落的16s rrna的v4区进行检测，检测结果如下：
65.通过16s rrna的基因测序结果如图1所示：深海耐盐菌群的微生物群落结构在与苯酚接触后，随着处理天数的延长，微生物群落结构发生了明显的变化，具体表现为：在属水平，物种丰富度排名前10的物种中，盐单胞菌属的丰度始终高于36％，位于物种丰度排名的前两位，据文献报道盐单胞菌属是一类能够在nacl浓度为0.1％～32％条件下生长的耐盐细菌，在盐湖、盐场、盐碱地、海冰和海洋极端环境中都有分布，这也解释了本发明中的混合菌群为何能耐受较高浓度的盐刺激。相较于盐单胞菌属，其余9个属的微生物所占的丰度均有不同程度的提升。变化最为明显的为海源菌属与海洋杆菌属的细菌，其中海源菌属的丰度由23.1％上升至处理中期的43.6％，末期的38.0％；海洋杆菌属由0.54％上升至0.61％(中期)、6.8％(后期)。这两类细菌均为近海微生物，除了能够耐受高盐环境外，它们还具有降解有机污染物的能力。因此，本发明中深海耐盐菌群不仅可以耐受较高浓度的盐刺激，还可以有效降解水中的苯酚。
66.5.考察深海耐盐菌群对不同类型的含苯酚废水的处理效果
67.(1)、测定三种不同含苯酚废水(a、b、c)的ph后，用0.1mol/l的naoh溶液将苯酚废水的ph调至6.5-7.5，用无菌水对废水进行适当稀释，稀释后苯酚浓度如表1所示。
68.(2)、将制得的深海耐盐菌群驯化培养液培养至对数期(菌浓度为109cells/ml以上)，以20％的接种量接入步骤(1)获得的三种不同的苯酚废水中，苯酚废水中以0.1g/l的比例添加蛋白胨、酵母浸膏作为外源性的营养物质，在29℃、120r/min的条件下进行恒温恒速培养10天，每隔两天检测各个培养液的上清液中金属离子的浓度，测试结果见表1。
69.(3)、深海耐盐菌群驯化培养液随时间对苯酚的去除率图6所示，本发明中的深海耐盐菌群对三种含苯酚水体均有明显的处理效果，培养10天后苯酚的降解率为92.4-100％，且该驯化菌群对高盐的苯酚废水亦有较好的处理效果，在盐含量8％，苯酚750.0mg/l下仍可降解92.4％的苯酚。
70.本发明表明深海耐盐菌群nh-1具有盐度适应范围广、耐盐含量高、苯酚降解能力强及降解速率快等优点，在高盐苯酚废水生物处理中具有较大的应用潜力。
71.表1深海耐盐菌群处理三种苯酚废水10天后去除效率
[0072][0073]
以上仅就本发明的最佳实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化。凡在本发明独立权利要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明保护范围内。