基于VIGS的锦绣杜鹃叶片基因沉默体系及其构建方法

基于vigs的锦绣杜鹃叶片基因沉默体系及其构建方法
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及基于vigs的锦绣杜鹃叶片基因沉默体系及其构建方法。


背景技术：

2.病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，vigs)，是植物抵抗病毒感染的一种机制，通过在 病毒基因组中插入合适的目的基因构建成为重组的病毒载体，实现对植物内源基因表达抑制的一种新的基 因工程技术。vigs技术无需构建转基因植株，具有周期短、操作简便和成本低等优点，是目前功能基因 组学研究领域常用的技术手段之一。广泛应用于植物的生长发育、抗虫病和代谢调控等相关基因功能研究， 包括茄科(烟草、番茄、土豆)、豆科(大豆、苜蓿、豌豆、大豆)、十字花科(拟南芥)、禾本科(大麦、 小麦、水稻、玉米)、罂粟科(罂粟)和大戟科(木薯)以及在各种组织和器官(叶、块茎、根、果实和 种子组织)中。虽然vigs在许多植物中已经得到了广泛的应用，但是在该技术在锦绣杜鹃花上的应用和 相关研究较少。
3.杜鹃花是我国十大传统花卉之一，属于杜鹃花科(ericaceae)杜鹃花属(rhododendron)。杜鹃种类 繁多、花色丰富，有比较高的观赏和经济价值，作为“木本花卉之王”，适宜在公园、街道、广场、居住 区等各类绿地中种植，也可作为节日花卉的盆栽栽培，深受市民欢迎。杜鹃花的地理分布非常广泛，杜鹃 可以在从低海拔到高海拔的不同植被地带生长，但杜鹃花主要分布在海拔1500～4000m的地区，喜冷凉 的环境。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术的不足，本发明提供了基于vigs的锦绣杜鹃叶片基因沉默体系及其构建方法，以 期为下一步锦绣杜鹃功能基因组学研究提供技术平台，为下一步验证锦绣杜鹃基因功能奠定基础。
5.本发明提供的锦绣杜鹃基因沉默体系及其构建方法，具体技术方案如下：
6.基于vigs的锦绣杜鹃叶片基因沉默体系，包括辅助病毒载体和表达病毒载体，所述辅助病毒载体为 烟草脆裂病毒ptrv1，所述表达病毒载体为目的基因片段的烟草脆裂病毒ptrv2，所述目的基因片段来源 于锦绣杜鹃叶片。
7.在某些实施方式中，述目的基因片段为锦绣杜鹃的用于沉默pds基因特异性片段，所述用于沉默pds 基因特异性片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.进一步，所述pds基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明还提供了第二个方案，即基于vigs的锦绣杜鹃叶片基因沉默体系的构建方法，用于构建上述 沉默体系，包括如下步骤：
10.s1，提取锦绣杜鹃叶片总rna，反转录获得锦绣杜鹃cdna；
11.s2，利用特异性引物进行锦绣杜鹃cdna片段pcr扩增，纯化获得目的基因片段；
12.s3，将步骤s2中的目的基因片段与烟草脆裂病毒ptrv2进行重组连接，获得含目的
基因的ptrv2 重组载体；
13.s4，将步骤s3中ptrv2重组载体以及烟草脆裂病毒ptrv1分别转化到农杆菌gv3101感受态细胞， pcr鉴定阳性，分别获得含重组载体trv2的菌液、含trv1载体的菌液；
14.s5，将步骤s4中重组载体trv2的菌液、含trv1载体的菌液离心收集菌体，并用侵染夜重悬至特 定od值后以体积比1：1混匀，即为侵染夜，将所述混合侵染液采用叶背注射法注入锦绣杜鹃叶片中， 实现对特定目标基因的沉默。
15.在某些实施方式中，步骤s2中，所述目的基因片段为锦绣杜鹃叶片的用于沉默pds基因特异性片段 时，对应的所述特异性引物为引物1和引物2，所述引物1的核苷酸序列为seq id no.3所示，所述引物 2的核苷酸序列为seq id no.4所示。
16.在某些实施方式中，步骤s5中，所述侵染液的组成为：以无菌水为母液，并加入200μmol/l乙酰丁 香酮，10mmol/l氯化镁，10mmol/l乙磺酸，ph调制5.6，菌液od600值调至2，现用现配。
17.在某些实施方式中，所述侵染液侵染锦绣杜鹃叶片具体操作如下：将所述侵染液注入锦绣杜鹃新萌发 枝条从上往下第一、二对嫩叶的叶背中，注射后黑暗处理一天，第二天光周期养护。
18.进一步，所述光周期养护的培养条件：光照：600μmolm-2
s-1
，温度设置为：22℃/18℃(昼16h/夜8h)， 空气相对湿度为75％。
19.在某些实施方式中，步骤4中，筛选得到阳性菌株后，制成菌液接种至含抗生素的lb平板培养基上， 长出单克隆菌斑；挑取单克隆菌斑置于含有抗生素的lb液体培养基上培养，以实现单克隆菌体的增殖， 得到单克隆菌液；然后将所述单克隆菌液以1:20的体积比转入液体诱导lb培养基中进行诱导培养。
20.所述含抗生素的lb平板培养基和所述含有抗生素的lb液体培养基中所含的抗生素为：100mg/l卡 那霉素、100mg/l庆大霉素和50mg/l利福平。
21.所述液体诱导lb培养基中含有100mg/l卡那霉素、100mg/l庆大霉素、50mg/l利福平、10mmol/l 乙磺酸和20μmol/l乙酰丁香酮。
22.本发明具有以下有益效果：本发明具有时间短，速度快，高通量，不需要依赖于稳定的遗传转化的特 点，具体包括以下步骤：构建含有特定目标基因片段的trv2重组质粒(rppds-trv2)，并将rppds-trv2 和trv1分别转化到农杆菌gv3101中，得到阳性农杆菌菌株并分别进行增殖；将两种单克隆菌体离心、 并利用侵染液分别重悬菌体至od600＝2后，将二者等体积混合，得到混合侵染液；将所述混合侵染液注 入锦绣杜鹃叶片中，通过病毒检测以及荧光定量检测获得有效沉默植株，实现对特定目标基因的沉默。本 发明探究了可实现锦绣杜鹃叶片基因沉默的方法，筛选出了侵染时含有菌体的侵染液的od值。利用本发 明所述方法对锦绣杜鹃进行侵染，可使目标基因表达水平降低50％，为下一步锦绣杜鹃功能基因组学研究 提供技术平台，为下一步验证锦绣杜鹃基因功能奠定基础。
附图说明
23.图1是本发明锦绣杜鹃基因沉默体系的构建方法流程图；
24.图2是本发明实施例1中pds目的片段pcr产物电泳图；
25.图3是本发明实施例1中菌液pcr筛选电泳图；
26.图4是本发明实施例1中ptrv2-pds重组质粒的构建的pds质粒酶切电泳图；
27.图5是本发明实施例1中ptrv2-pds重组质粒的构建的ptrv2质粒酶切片段切电泳图；
28.图6是本发明实施例1中ptrv2-pds重组质粒的构建的双酶切验证电泳图；
29.图7是本发明实施例1中农杆菌菌液pcr检测电泳图；
30.图8是本发明实施例1中沉默基因的pcr检测电泳图；
31.图9是本发明实施例1中qrt-pcr检测pds基因表达量对比图；
32.图10是本发明实施例2中hsfc-1like和hsfc-1目的片段pcr产物电泳图。
具体实施方式
33.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图1-10，对本发 明进一步详细说明。
34.实施例1
35.一、锦绣杜鹃总rna提取及cdna合成
36.取样生长发育良好的锦绣杜鹃叶片，取样后液氮速冻，然后从液氮转移至-80℃超低温冰箱保存以备提 取锦绣杜鹃总rna使用。
37.1、本试验采用rna试剂盒提取锦绣杜鹃叶片rna，具体操作参考天根生化科技有限公司rna提取 试剂盒说明书，最终得到高浓度的rna溶液。
38.2、使用天根生化科技有限公司的试剂盒合成cdna。
39.将上述提取的锦绣杜鹃总rna进行cdna合成，具体操作如下：
40.(1)在1.5ml离心管中配制反应液
[0041][0042]
(2)混匀后，65℃保温5min，然后冰上迅速冷却
[0043]
(3)在上述离心管中配制下列反转录反应液，总量为20μl。
[0044][0045]
(4)缓慢摇匀后，置于pcr仪按照下列条件进行反转录反应：42℃
[0046]
(～50℃)30-60min，95℃，5min后，冰上冷却。
[0047]
二、沉默片段pds的扩增
[0048]
根据克隆得到的锦绣杜鹃序列信息，选取保守区域以外的300bp(pds)片段为目的片段，利用pcrprimer stats进行引物设计，引物序列分别加ecori和bamhi酶切位点，用于后期与载体连接，引物序列 为如表1所示。按照表2配制反应体系，3000rpm，10s离心，将反应体系放入pcr扩增仪进行体外复制 (pcr反应循环如表3所示)，反应结束后用1.3％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物。利用普通琼脂糖 凝胶dna回收试剂盒回收目的片段，具体操作参照说明书(天根生化科技有限公司)。
[0049]
表1沉默基因pcr所用引物
[0050][0051]
表2反应体系
[0052][0053]
注a：20μl体系可以变为50μl体系。
[0054]
表3 pcr反应循环
[0055][0056][0057]
注b：pcr扩增仪上盖温度设置为105℃。
[0058]
以锦绣杜鹃的cdna为模板，利用引物进行扩增，pcr电泳结果显示(图2)获得的pds片段长度为 300bp，目的片段符合预期大小，经过回收以及转化大肠杆菌感受态dh5α细胞，菌液pcr(图3)。测序 后，经过与原始序列信息比对结果显示，使用该引物扩增获得的片段是正确的。
[0059]
三、重组载体的构建
[0060]
1、将目的基因片段与trv2载体进行转化
[0061]
1)大肠杆菌dh5α感受态细胞从-80℃冰箱拿出，迅速插入冰中，5min待菌块融化，
分别加入2μl 目的片段、2μl trv2,并用手拨打ep管底轻轻混匀(避免用移液枪进行吸打)，冰中静置25min。
[0062]
2)42℃水浴热激45s，迅速放回冰上并静置2min。轻拿轻放避免出现晃动，不然可能会降低转化 的效率。
[0063]
3)向离心管中加入700μl的不含抗生素的无菌液体培养基，混匀之后放进摇床并设置温度37℃， 转速200rpm复苏60min。
[0064]
4)5000rpm离心1min倒掉废液收集菌体，留取大约100μl的上清液轻轻吹打重悬菌块然后涂布到 含抗生素kan的培养基上。
[0065]
将平板倒置放于37℃的恒温培养箱过夜。
[0066]
2、过夜培养好的菌斑进行菌液pcr和测序，操作如下：
[0067]
1)在无菌操作台上，在离心管中加入10μl无菌水，挑取大小中等的菌斑后在离心管中进行反复吸 打，充分混合。
[0068]
2)吸取2μl混合液作为pcr反应的模板，pcr反应体系如表4所示，反应条件如表5所示。
[0069]
表4 pcr反应体系
[0070][0071]
表5 pcr反应条件
[0072][0073][0074]
3)取pcr产物进行电泳鉴定，检测大肠杆菌里是否转化进trv2质粒和目的片段。
[0075]
4)确定菌液中含有目的片段后，将剩余的8μl混合液转接到含kan的lb培养基中，过夜摇菌培养 然后送至北京擎科生物公司测序。
[0076]
3、进行重组载体的构建
[0077]
将测序正确的菌液利用高纯度质粒小提试剂盒进行质粒提取。具体操作在说明书(天根生化科技有限 公司)指导下进行，最后可以获得浓度较高的重组载体质粒。
[0078]
分别使用ecor
ꢀⅰ
和bamh
ꢀⅰ
限制性内切酶对ptrv2载体质粒进行双酶切。酶切反应
体系表6所示。
[0079]
表6酶切体系
[0080][0081]
37℃，酶切2-3h。反应完成后，用1.3％琼脂糖凝胶进行电泳检测是否完成酶切，并且对凝胶进行胶 回收。胶回收完成后获得与目的基因带有相同酶切位点的线性trv2载体。
[0082]
使用in-fusion连接酶将得到的线性目的基因pcr产物与酶切获得的线性trv2载体进行连接，连接 体系如表7所示。
[0083]
表7连接体系
[0084][0085]
轻吹吸打混匀，在pcr仪中50℃反应15min。将连接之后的产物转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞 中，具体操作步骤同2.2.3。然后挑选单个菌斑进行摇菌，将摇好的菌液送至北京擎科生物公司进行测序。
[0086]
测序正确后，将目的片段质粒进行ecor i和bamh i双酶切，回收符合目的片段pds大小的300bp 片段(图4所示)与同样经过双酶切的载体ptrv2相连接(图5所示)，构成ptrv2-pds重组干扰载 体，重组质粒转化大肠杆菌感受态，菌液pcr筛选出阳性菌落，通过菌液测序和跑胶的结果显示(图6 所示)切出符合目的基因大小的小片段和一个符合trv2载体大小的大片段。
[0087]
四、重组载体转化农杆菌感受态细胞gv 3101
[0088]
将测序正确的病毒重组质粒和空载质粒ptrv1、ptrv2转化农杆菌感受态细胞gv 3101。具体操作步 骤如下：
[0089]
1)取保存在-80℃的农杆菌感受态细胞在室温放置数分钟或者将其置于手心片刻等到农杆菌感受态细 胞部分融化，处于冰水混合的状态时迅速将其插入冰中。
[0090]
2)每100μl的感受态细胞中加5μl的质粒dna，用手轻轻拨打管底将感受态细胞和质粒dna混 合均匀，然后按照步骤依次首先在冰上静置5min、液氮速冻5min、37℃水浴5min、最后冰浴5min。
[0091]
3)在上一步完成后的离心管中加入700μl不含抗生素的液体培养基，于28℃震荡培养2-3h。
[0092]
4)6000rpm离心1min收菌，将废液倒掉，同时留取上清液约100μl左右轻轻用移液枪吹打重悬菌 块并涂布到含相应抗生素(kan 100μg/ml、rif 50μg/ml、gen 100μg/ml)的lb平板上，倒置放于28℃ 培养箱培养2-3d。
[0093]
挑取单菌落于含有2ml相应抗生素(kan 100μg/ml、rif 50μg/ml、gen 100μg/ml)的液体lb中， 28℃，220rpm/min摇床震荡过夜。摇好的菌液添加甘油分装并保存于-80℃备用。
[0094]
验证正确的重组质粒转化农杆菌感受态细胞gv3101，获得含有重组载体的农杆菌。经过含kan、rif 和gen抗生素的lb培养基培养，挑取单菌落进行pcr筛选，如图7所示。1-4条泳道都出现了相对应的 目的条带，说明重组质粒已经成功转入农杆菌中。
[0095]
五、植株的侵染
[0096]
1、侵染液的制备
[0097]
1)将含有ptrv1、ptrv2、和重组载体pds-trv2的农杆菌菌液涂布与含相应抗生素(kan 100μg/ml、 rif 50μg/ml、gen 100μg/ml)的固体lb培养基中，28℃恒温培养箱培养48h-60h，观察菌落生长情况 是否良好。
[0098]
2)挑取单菌落的农杆菌，接种与2ml含相应抗生素(kan 100μg/ml、rif 50μg/ml、gen 100μg/ml) 的液体lb中，28℃，220r/min摇床中培养12-16h。
[0099]
3)按照相应的比例(1：20)将摇好的菌液转接到诱导lb(kan 100μg/ml、rif 50μg/ml、gen 100μg/ml、 as 20μmol/l、mes 10mmol/l)中，然后设置温度28℃，220r/min在摇床中震荡培养14h左右。
[0100]
4)震荡完成后，5000r/min离心10min，弃上清收集菌体。
[0101]
5)配制完成的侵染液(mes 10mmol/l、as 200μmol/l、mgcl
2 10mmol/l)重悬菌体。取少量悬浮 菌液使用微量分光光度计测量其浓度，使菌体浓度(od
600
)达到试验设计要求。然后置于室温下3-4h， 将含trv1载体的菌液与含ptrv1、ptrv2、和重组载体pds-trv2的菌液以体积比1：1混匀。备用。
[0102]
(2)侵染试验设计
[0103]
本试验共设置3组处理分别为：对照组(ck)：未侵染植株；空载组：trv1+trv2；沉默组： trv1+trv2-pds。用1ml无菌注射器在锦绣杜鹃叶片背部进行注射接种，每组处理3株，设置3次重复 实验。侵染后植株黑暗处理1d，后续正常养护。
[0104]
(3)接种后检测
[0105]
为了鉴定携带沉默载体的农杆菌侵染后是否成功沉默了该基因，侵染完成后，植物出现沉默表型后进 行对照组、空载组和沉默组(侵染叶片上面又重新萌发出的嫩叶)取样，提取锦绣杜鹃叶片总rna，反转 录成cdna。
[0106]
1)提取完成的锦绣锦绣杜鹃rna进行pds基因沉默的病毒分子检测：
[0107]
以上述cdna为模板，根据trv2的基因序列设计引物，进行病毒分子pcr检测，pcr反应体系表8 所示，反应条件如表9所示。
[0108]
表8 pcr反应体系
[0109][0110]
表9 pcr反应条件
[0111][0112]
反应结束后用1.3％琼脂凝胶电泳检测。
[0113]
2)rt-pcr检测目的基因表达
[0114]
以锦绣杜鹃的ubq基因作为内参基因为对照，设计荧光定量引物检测锦绣杜鹃叶片中pds的基因表 达。
[0115]
表10 qpcr检测目的基因沉默效果的引物
[0116][0117]
以沉默后的锦绣杜鹃叶片为样本反转录cdna为模板，用trv2的特异性引物进行pcr扩增，凝胶 电泳检测结果显示(如图8所示)。在未侵染trv病毒的ck植株阴性对照中没有扩增出目的条带，实验 组能扩增出trv特异性条带，说明trv病毒已经有校地入侵锦绣杜鹃中，并且在植株中转移和复制。
[0118]
采用qrt-pcr的方法测定未处理组(ck)、空载组和沉默组叶片中pds基因的表达量。如图9所示， 与未处理组(ck)相比，沉默组叶片中pds基因表达量显著下降，其表达率为正常水平的46％，表明重 组载体trv1+trv2-pds产生了干扰效果并且液造成了锦绣杜鹃的
基因沉默。
[0119]
上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的 技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。