对PPO抑制剂类除草剂具有耐受性的PPO多肽及应用的制作方法

对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo多肽及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，更具体地说，本发明涉及对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo多肽及应用。


背景技术：

2.杂草是农业生产中影响作物产量的核心因素之一。除草剂是控制杂草的主要技术手段。美国杂草学会(weedscience.org)根据除草剂在植物体内作用靶位点的不同，将除草剂按作用机制分为28类。其中，第14组(group 14；hrac group e)为抑制原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen ix oxidase)的抑制剂(http://www.weedscience.org/)。
3.原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen ix oxidase，ppox，ppx或ppo；ec 1.3.3.4)是叶绿素和血红素合成通路中最后一个共同的酶。在有氧分子的条件下，原卟啉原氧化酶(ppo)催化原卟啉原(protoporphyrinogen ix)转变为原卟啉(protoporphyrin ix)。
4.在植物中，原卟啉原氧化酶ppo是除草剂的重要靶点，抑制植物体内的原卟啉原氧化酶将导致催化此反应的底物原卟啉原在细胞内的积累，细胞中的叶绿体和线粒体积累原卟啉原会导致原卟啉原被o2发生非酶促的氧化。在光照的条件下，原卟啉原的非酶氧化会产生单态氧。单态氧会导致细胞内膜系统中脂质的氧化，并导致这些内膜系统的氧化解体，从而杀伤植物细胞(future med chem.2014apr；6(6):597
–
599.doi:10.4155/fmc.14.29)。
5.通过序列相似性研究ppo生物界中ppo酶的进化关系，ppo可以分为：hemg、hemj和hemy三类。大多数情况下，单一物种只拥有其中的一类。其中，hemg一般分布于γ-变形菌纲中，hemj分布于α-变形菌纲，并转移至其它变形菌纲和蓝细菌中，而hemy是真核生物中分布的唯一一类ppo酶(genome biol evol.2014aug；6(8):2141-55.doi:10.1093/gbe/evu170)。
6.原卟啉原氧化酶基因已经在一些生物中获得了分离。例如，已知的有烟草的ppol基因(genbank登录号y13465)、ppo2基因(genbank登录号y13466)、拟南芥的ppo基因(genbank登录号d83139)、枯草杆菌的hemy基因(genbank登录号m97208)、小鼠的ppo基因(genbank登录号d45185)、人的ppo基因(genbank登录号d38537)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的ppo基因(genbank登录号z71381)、大肠杆菌的hemg基因(genbank登录号x68660)等。
7.植物体内一般至少有两种ppo基因。分别命名为ppo1和ppo2，其中ppo1一般定位在植物的叶绿体中，而ppo2一般定位在植物细胞的线粒体中。但是，有些苋科植物的ppo2基因的mrna具有不同的翻译起始位点，可以产生不同长度的ppo2多肽。例如在菠菜(spinacia oleracea l)中的ppo2基因可以表达有26个多肽长度差异的，两个分子量分别约为58kd和56kd的ppo2蛋白。其中较长的定位于叶绿体，较短的定位于线粒体(j biol chem.2001jun 8；276(23):20474-81.doi:10.1074/jbc.m101140200.epub 2001mar 23)。
8.当ppo活性被某种化合物所抑制，叶绿素与血红素生成也将被抑制，基质原卟啉原
ix将脱离正常的卟啉生物合成途径，迅速从叶绿素中脱离进入细胞质，氧化为原卟啉ix，累积在细胞膜上。积累的原卟啉ix在光和氧分子作用下产生高活性单线态氧(1o2)破坏细胞膜，迅速导致植物细胞死亡。由于ppo类除草剂的使用，世界上已经有对特定种类的ppo类除草剂产生抗性杂草的案例(pest manag sci.2014sep；70(9):1358-66.doi:10.1002/ps.3728.epub 2014feb 24)。
9.例如：在amaranthus tuberculatus中的ppo2l基因的210位甘氨酸发生缺失(δg210)产生了对除草剂-乳氟禾草灵(lactofen)的抗性(proc natl acad sci u s a.2006aug 15；103(33):12329-34.doi:10.1073/pnas.0603137103.epub 2006aug 7)。
10.在amaranthus palmeri中的ppo2基因的98位精氨基酸突变为甘氨酸或甲硫氨酸(r98g,r98m)产生了对除草剂氟磺胺草醚(fomesafen)的抗性(pest manag sci.2017aug；73(8):1559-1563.doi:10.1002/ps.4581.epub 2017may 16)。
11.在amaranthus palmeri中的ppo2基因的399位甘氨基酸突变为丙氨酸(g399a)产生了对除草剂氟磺胺草醚(fomesafen)的抗性(front plant sci.2019may 15；10:568.doi:10.3389/fpls.2019.00568.ecollection 2019)。
12.在豚草(ambrosia artemisiifolia)中的ppo2基因的98位精氨基酸突变为亮氨酸(r98l)产生了对除草剂丙炔氟草胺(flumioxazin)的抗性(weed science,60(3):335-344(2012))。
13.在牛筋草(eleusine indica)中的ppo1基因的212位丙氨基酸突变为苏氨酸(a212t)产生了对除草剂噁草酮(oxadiazon)的抗性(pest manag sci.2020may；76(5):1786-1794.doi:10.1002/ps.5703.epub 2020jan 23)。
14.发明简述
15.本发明涉及一种对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo多肽或其生物活性片段。
16.本发明还涉及一种分离的多核苷酸，以及相应的植物基因组、载体构建体或宿主细胞。
17.另一方面，本发明还提供了一种能产生或提高对原卟啉原氧化酶类除草剂耐受性的植物细胞或植物的生产方法，及通过所述方法生产的植物。
18.在又一个方面，本发明提供了一种使植物产生或提高对原卟啉原氧化酶类除草剂耐受性的方法。
19.本发明还提供了一种能产生或提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物对原卟啉原氧化酶类除草剂耐受性的方法。
20.本发明另外提供了所述的蛋白或其生物活性片段或者所述的多核苷酸用于产生或提高宿主细胞、植物细胞、植物组织、植物部分或植物对原卟啉原氧化酶类除草剂耐受性的用途。
21.本发明另外涉及一种控制植物栽培场所的杂草的方法。
附图说明
22.图1显示了不同植物原卟啉氧化酶ppo氨基酸序列比对，其中标注的方框表示筛选位点的氨基酸保守基序。从上到下依次代表水稻(oryza sativa l.)、玉米(zea mays)、拟南芥(arabidopsis thaliana)、栽培大豆(glycine max)、烟草(nicotiana tabacum)、高粱
(sorghum bicolor)、番茄(solanum lycopersicum)、大麦(hordeum vulgare)、欧洲油菜(brassica napus)、花生(arachis hypogaea)、普通小麦(triticum aestivum)、甘蓝(brassica oleracea)、谷子(setaria italica)、萝卜(raphanus sativus)、马铃薯(solanum tuberosum)、陆地棉(gossypium hirsutum)、甘薯(dioscorea cayenensis)、木薯(manihot esculenta)、辣椒(capsicum annuum)、南瓜(cucurbita moschata)、黄瓜(cucumis sativus)、莴苣(lactuca sativa)、芝麻(sesamum indicum)、向日葵(helianthus annuus)、桑树(morus notabilis)、豇豆(vigna angularis)、草莓(fragaria vesca)、苹果(malus domestica)、桃(prunus persica)、樱桃(prunus avium)、杏(prunus dulcis)、葡萄(vitis vinifera)、番木瓜(carica papaya)、苜蓿(medicago truncatula)。
23.图2表示用pet44a空载体和水稻osppo1野生型基因(wt)转化ppo缺陷型大肠杆菌(δhemg)之后，用浓度为0nm(纳摩尔)、100nm、300nm和1000nm的化合物a处理后的细胞生长水平。
24.图3表示用浓度为0nm和500nm的化合物a处理时，osppo1野生型基因(由wt表示)或各种osppo1突变基因转化的ppo缺陷型大肠杆菌(δhemg)转化体的细胞生长水平。
25.图4表示用浓度分别为0μm、1μm、10μm、20μm、50μm和100μm的化合物a处理时，用osppo1野生型基因(表示为wt)或各种osppo1突变基因转化的ppo缺陷型大肠杆菌(δhemg)转化体的细胞生长水平。
26.图5表示用浓度分别为0μm、5μm、50μm和100μm的化合物a处理时，用zmppo1野生型基因(表示为zmppo1-wt)或各种zmppo1突变基因转化的ppo缺陷型大肠杆菌(δhemg)转化体的细胞生长水平。
27.图6表示其他作物抗性位点组合对不同ppo抑制剂类除草剂化合物a、苯嘧磺草胺、丙炔氟草胺抗性测试。
28.图7表示其他作物抗性位点组合对不同ppo抑制剂类除草剂epyrifenacil、甲磺草胺、氟嘧硫草酯抗性测试。
29.图8表示其他作物抗性位点组合对不同ppo抑制剂类除草剂氟磺胺草醚、三氟草嗪抗性测试。
30.图9表示分别用100nm丙炔氟草胺、100nm乙氧氟草醚、500nm苯嘧磺草胺、5μm双唑草腈、1μm唑草酮和10μm氟磺胺草醚处理时，用osppo1野生型基因(表示为wt)或各种osppo1突变基因转化的ppo缺陷型大肠杆菌(δhemg)转化体的细胞生长水平。
31.图10显示了突变体酶活测定。水稻osppo野生型(表示为wt)、y425i和l423s/y425i的酶动学曲线。
32.图11表示用含有9g/ha的化合物a处理水稻幼苗，与野生型株系相比，发生l423s/y425i位点同源置换的株系生长情况。
33.图12表示用不同浓度化合物a处理过表达大豆ppo1 wt和l430s/y432i拟南芥种子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达大豆ppo1 wt和l430s/y432i都表现出对化合物a具有一定的耐受性，但过表达l430s/y432i比过表达野生型对化合物a具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-gmppo1 wt表示过表达大豆ppo1；phse-gmppo1 l430s/y432i表示过表达大豆ppo1 l430s/y432i。
34.图13表示用不同浓度化合物a处理过表达油菜ppo1 wt和l424s/y426i拟南芥种
子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达油菜ppo1 wt和l424s/y426i都表现出对化合物a具有一定的耐受性，但过表达l424s/y426i比过表达野生型对化合物a具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-bnppo1-c5 wt表示过表达油菜ppo1；phse-bnppo1-c5 l424s/y426i表示过表达油菜ppo1 l424s/y426i。
35.图14表示用不同浓度化合物a处理过表达玉米ppo1 wt和l424w/y426l拟南芥种子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达玉米ppo1 wt和l424w/y426l都表现出对化合物a具有一定的耐受性，但过表达l424w/y426l比过表达野生型对化合物a具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-zmppo1 wt表示过表达玉米ppo1；phse-zmppo1 l424w/y426l表示过表达玉米ppo1 l424w/y426l。
36.图15表示用不同浓度化合物a处理过表达水稻ppo1 wt和l423s/y425i拟南芥种子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达水稻ppo1 wt和l423s/y425i都表现出对化合物a具有一定的耐受性，但过表达l423s/y425i比过表达野生型对化合物a具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-osppo1 wt表示过表达水稻ppo1；phse-osppo1 l423s/y425i表示过表达水稻ppo1 l423s/y425i。
37.图16表示用不同浓度丙炔氟草胺处理过表达水稻ppo1 wt和l423s/y425i拟南芥种子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达水稻ppo1 wt和l423s/y425i都表现出对丙炔氟草胺具有一定的耐受性，但过表达l423s/y425i比过表达野生型对丙炔氟草胺具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-osppo1 wt表示过表达水稻ppo1；phse-osppo1 l423s/y425i表示过表达水稻ppo1 l423s/y425i。
38.图17表示用不同浓度苯嘧磺草胺处理过表达水稻ppo1 wt和l423s/y425i拟南芥种子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达水稻ppo1 wt和l423s/y425i都表现出对苯嘧磺草胺具有一定的耐受性，但过表达l423s/y425i比过表达野生型对苯嘧磺草胺具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-osppo1 wt表示过表达水稻ppo1；phse-osppo1 l423s/y425i表示过表达水稻ppo1 l423s/y425i。
39.图18表示用不同浓度丙炔氟草胺处理过表达大豆ppo1 wt和l430s/y432i拟南芥种子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达大豆ppo1 wt和l430s/y432i都表现出对丙炔氟草胺具有一定的耐受性，但过表达l430s/y432i比过表达野生型对丙炔氟草胺具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-gmppo1 wt表示过表达大豆ppo1；phse-gmppo1 l430s/y432i表示过表达大豆ppo1 l430s/y432i。
40.图19表示用不同浓度苯嘧磺草胺处理过表达大豆ppo1 wt和l430s/y432i拟南芥种子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达大豆ppo1 wt和l430s/y432i都表现出对苯嘧磺草胺具有一定的耐受性，但过表达l430s/y432i比过表达野生型对苯嘧磺草胺具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-gmppo1 wt表示过表达大豆ppo1；phse-gmppo1 l430s/y432i表示过表达大豆ppo1 l430s/y432i。
41.图20表示用不同浓度丙炔氟草胺处理过表达玉米ppo1 wt和l424w/y426l拟南芥种子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达玉米ppo1 wt和l424w/y426l都表现出对丙炔氟草胺具有一定的耐受性，但过表达l424w/y426l比过表达野生型对丙炔氟草胺具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-zmppo1 wt表示过表达玉米ppo1；phse-zmppo1 l424w/y426l表示过表达玉米ppo1 l424w/y426l。
42.图21表示用不同浓度苯嘧磺草胺处理过表达玉米ppo1 wt和l424w/y426l拟南芥种子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达玉米ppo1 wt和l424w/y426l都表现出对苯嘧磺草胺具有一定的耐受性，但过表达l424w/y426l比过表达野生型对苯嘧磺草胺具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-zmppo1 wt表示过表达玉米ppo1；phse-zmppo1 l424w/y426l表示过表达玉米ppo1 l424w/y426l。
43.图22表示用不同浓度丙炔氟草胺处理过表达油菜ppo1 wt和l424s/y426i拟南芥种子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达油菜ppo1 wt和l424s/y426i都表现出对丙炔氟草胺具有一定的耐受性，但过表达l424s/y426i比过表达野生型对丙炔氟草胺具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-bnppo1-c5 wt表示过表达油菜ppo1；phse-bnppo1-c5 l424s/y426i表示过表达油菜ppo1 l424s/y426i。
44.图23表示用不同浓度苯嘧磺草胺处理过表达油菜ppo1 wt和l424s/y426i拟南芥种子，与野生型拟南芥相比，在拟南芥中过表达油菜ppo1 wt和l424s/y426i都表现出对苯嘧磺草胺具有一定的耐受性，但过表达l424s/y426i比过表达野生型对苯嘧磺草胺具有更强的耐受性。其中，野生型表示野生型拟南芥；phse-bnppo1-c5 wt表示过表达油菜ppo1；phse-bnppo1-c5 l424s/y426i表示过表达油菜ppo1 l424s/y426i。
45.图24表示用不同浓度化合物a喷施过表达水稻ppo1 wt和l423s/y425i水稻幼苗的测试结果，其中，wt表示淮稻5号野生型；mt1和mt2表示过表达水稻ppo1 wt；mt3和mt4表示过表达水稻ppo1 l423s/y425i。
46.[0047][0048]
发明详述
[0049]
本说明书中使用的一些术语定义如下。
[0050]
本发明中的“除草剂”是指能够杀死或控制或不利于转变植物生长的活性成分。本发明中的“除草剂耐受性”或“除草剂抗性”是指即便使用过可杀死一般或野生植物或抵抗植物生长，或让植物的生长能力与野生植物相比变弱或停止生长的除草剂，该植物仍然继续生长。上述除草剂包括原卟啉原氧化酶(ppo)抑制剂类除草剂。这种ppo抑制剂类除草剂可分为嘧啶二酮(pyrimidinediones)、二苯醚(diphenyl-ethers)、苯基吡唑(phenylpyrazoles)、n-苯基酰亚胺(n-phenylphthalimides)、噻二唑(thiadiazoles)、噁二唑(oxadiazoles)、三唑啉酮(triazolinones)、噁唑烷二酮(oxazolidinediones)和其他不同化学结构的除草剂。
[0051]
一般而言，如果如本文所述的可在本发明的上下文中使用的ppo抑制性除草剂和/或其他除草化合物能够形成几何异构体例如e/z异构体，则可能在根据本发明的组合物中使用两者，纯异构体及其混合物。如果如本文所述的ppo抑制性除草剂和/或其他除草化合物具有一个或多个手性中心，且因而以对映异构体或非对映异构体存在，则可能在根据本发明的组合物中使用两者，纯对映异构体和非对映异构体及其混合物。如果如本文所述的ppo抑制性除草剂和/或其他除草化合物具有可离子化官能团，则它们还可以以其农业上可接受的盐的形式使用。通常，那些阳离子的盐和那些酸的酸加成盐是适合的，它们的阳离子和阴离子分别对活性化合物的活性无副作用。优选的阳离子为碱金属的离子，优选锂、钠和钾离子，碱土金属的离子，优选钙和镁离子，以及过渡金属的离子，优选锰、铜、锌和铁的离子，进一步为铵和取代的铵，其中1个至4个氢原子被c
1-c
4-烷基、羟基-c
1-c
4-烷基、c
1-c
4-烷
no：80020-41-3)、nitrofluorfen(cas no：42874-01-1)和halosafen(cas no：77227-69-1)。
[0055]
苯基吡唑类除草剂包括但不限于吡草醚(cas no：129630-19-9)和异丙吡草酯(cas no：174514-07-9)。
[0056]
n-苯基酰亚胺类除草剂包括不限于丙炔氟草胺(cas no：103361-09-7)、吲哚酮草酯(cas no：142891-20-1)、flumipropyn(cas no：84478-52-4)和氟烯草酸(cas no：87546-18-7)。
[0057]
噻二唑类除草剂包括不限于嗪草酸甲酯(cas no：117337-19-6)、嗪草酸(cas no：149253-65-6)和噻二唑草胺(cas no：123249-43-4)。
[0058]
噁二唑类除草剂包括不限于丙炔噁草酮(cas no：39807-15-3)和噁草酮(cas no：19666-30-9)。
[0059]
三唑啉酮类除草剂包括不限于唑草酮(cas no：128621-72-7)、唑草酮乙酯(cas no：128639-02-1)、甲磺草胺(cas no：122836-35-5)、唑啶草酮(cas no：68049-83-2)和酰苯草酮(cas no：173980-17-1)。
[0060]
噁唑烷二酮类除草剂包括不限于环戊噁草酮(cas no：110956-75-7)。
[0061]
其他除草剂包括不限于双唑草腈(cas no：158353-15-2)、氟哒嗪草酯(cas no：188489-07-8)、氟唑草胺(cas no：190314-43-3)、三氟草嗪(trifludimoxazin,cas no：1258836-72-4)、n-乙基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1h-吡唑-1-甲酰胺(cas no：452098-92-9)、n-四氢糠基-3-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1h-吡唑-1-甲酰胺(cas no：915396-43-9)、n-乙基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1h-吡唑-1-甲酰胺(cas no：452099-05-7)、n-四氢糠基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1h-吡唑-1-甲酰胺(cas no：452100-03-7)、3-[7-氟-3-氧代-4-(丙-2-炔基)-3,4-二氢-2h-苯并[1,4]噁嗪-6-基]-1,5-二甲基-6-硫代-[1,3,5]三嗪烷-2,4-二酮(cas no：451484-50-7)、2-(2,2,7-三氟-3-氧代-4-丙-2-炔基-3,4-二氢-2h-苯并[1,4]噁嗪-6-基)-4,5,6,7-四氢-异吲哚-1,3-二酮(cas no：1300118-96-0)、(e)-4-[2-氯-5-[4-氯-5-(二氟甲氧基)-1h-甲基-吡唑-3-基]-4-氟-苯氧基]-3-甲氧基-丁-2-烯酸甲酯(cas no：948893-00-3)、wo2016/120116中公开的苯吡啶类、ep09163242.2中公开的苯并噁嗪酮衍生物以及通式i所示的化合物(参见专利cn202011462769.7)；
[0062]
在另一个示例性实施例中，q代表
[0063]
y代表卤素、卤代c1-c6烷基或氰基；
[0064]
z代表卤素；
[0065]
m代表ch或n；
[0066]
x代表-cx1x
2-(c1-c6烷基)
n-、-(c1-c6烷基)-cx1x
2-(c1-c6烷基)
n-或-(ch2)
r-，n代表0或1，r代表2以上的整数；
[0067]
x1、x2分别独立地代表氢、卤素、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、卤代c1-c6烷基、卤代c2-c6烯基、卤代c2-c6炔基、c3-c6环烷基、c3-c6环烷基c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷硫基、羟基c1-c6烷基、c1-c6烷氧基c1-c6烷基、苯基或苄基；
[0068]
x3、x4分别独立地代表o或s；
[0069]
w代表羟基、c1-c6烷氧基、c2-c6烯氧基、c2-c6炔氧基、卤代c1-c6烷氧基、卤代c2-c6烯氧基、卤代c2-c6炔氧基、c3-c6环烷基氧基、苯氧基、巯基、c1-c6烷硫基、c2-c6烯硫基、c2-c6炔硫基、卤代c1-c6烷硫基、卤代c2-c6烯硫基、卤代c2-c6炔硫基、c3-c6环烷基硫基、苯硫基、氨基或c1-c6烷基氨基。
[0070]
在另一个示例性实施例中，通式i所示的化合物选自化合物a：q代表y代表氯；z代表氟；m代表ch；x代表-c*x1x
2-(c1-c6烷基)
n-(c*为手性中心，r构型)，n代表0；x1代表氢；x2代表甲基；x3、x4分别独立地代表o；w代表甲氧基。
[0071]
上文所述的可用于进行本发明的ppo抑制性除草剂通常最好与一种或多种其它除草剂联合应用以获得对多种不希望植物的控制。例如，ppo抑制性除草剂还可以与作物植物天然对其耐受或经由表达一个或多个如前所述的额外转基因而对其有抗性的额外除草剂联合使用。当与其它靶向除草剂联合使用时，本发明要求保护的化合物可与其它一种或多种除草剂一起配制，与其它一种或多种除草剂罐混，或与其它一种或多种除草剂顺序应用。
[0072]
适合的混合物组分例如，选自类别b1)至b15)的除草剂：
[0073]
b1)脂质生物合成抑制剂；
[0074]
b2)乙酰乳酸合酶抑制剂(als抑制剂)；
[0075]
b3)光合作用抑制剂；
[0076]
b4)原卟啉原-ix氧化酶抑制剂，
[0077]
b5)漂白除草剂；
[0078]
b6)烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶抑制剂(epsp抑制剂)；
[0079]
b7)谷氨酰胺合成酶抑制剂；
[0080]
b8)7,8-二氢蝶酸合成酶抑制剂(dhp抑制剂)；
[0081]
b9)有丝分裂抑制剂；
[0082]
b10)非常长链脂肪酸合成抑制剂(vlcfa抑制剂)；
[0083]
b11)纤维素生物合成抑制剂；
[0084]
b12)去偶除草剂(decoupler herbicides)；
[0085]
b13)生长素除草剂(auxinic herbicides)；
[0086]
b14)生长素运输抑制剂；和
[0087]
b15)选自溴丁酰草胺(bromobutide)、氯甲丹(chlorflurenol)、氯甲丹(chlorflurenol-methyl)、环庚草醚(cinmethylin)、苄草隆(cumyluron)、茅草枯(dalapon)、棉隆(dazomet)、苯敌快(difenzoquat)、苯敌快(difenzoquat-metilsulfate)、噻节因(dimethipin)、甲胂钠(dsma)、香草隆(dymron)、敌草腈(endothal)及其盐、乙苯酰草(etobenzanid)、氟燕灵(flamprop)、氟燕灵(flamprop-isopropyl)、甲氟燕灵(flamprop-methyl)、强氟燕灵(flamprop-m-isopropyl)、麦草伏(flamprop-m-methyl)、抑草丁(flurenol)、抑草丁(flurenol-butyl)、调嘧醇(flurprimidol)、膦铵素(fosamine)、膦铵素(fosamine-ammonium)、茚草酮(indanofan)、indaziflam、抑芽丹(maleic hydrazide)、氟草磺(mefluidide)、威百亩(metam)、methiozolin(cas no：403640-27-7)、叠氮甲烷(methyl azide)、溴甲烷(methyl bromide)、苯丙隆(methyl-dymron)、碘甲烷(methyl iodide)、甲胂一钠(msma)、油酸(oleic acid)、氯噁嗪草(oxaziclomefone)、壬酸(pelargonic acid)、稗草畏(pyributicarb)、灭藻醌(quinoclamine)、苯氧丙胺津(triaziflam)、灭草环(tridiphane)和6-氯-3-(2-环丙基-6-甲基苯氧基)-4-哒嗪醇(cas no：499223-49-3)及其盐和酯的其它除草剂；
[0088]
包括它们农业可接受的盐或衍生物。
[0089]
此外，当与如上所述的其他除草剂化合物组合使用时，可能有用的是与安全剂组合施用ppo抑制性除草剂。安全剂是防止或降低对有用植物的损害但不对除草剂在不希望的植物上的除草作用具有显著影响的化合物。它们可以在播种之前施用(例如在种子处理时、在枝或秧苗上)或在有用植物的萌发前或萌发后施用。
[0090]
此外，安全剂、ppo抑制性除草剂和/或其他除草剂化合物可以同时或依次施用。
[0091]
ppo抑制性除草剂和b1)-b15)组的除草剂化合物和安全剂是已知的除草剂和安全剂，例如参见wo2013/189984；the compendium of pesticide common names(http://www.alanwood.net/pesticides/)；farm chemicals handbook 2000，第86卷，meister publishing company，2000；b.hock，c.fedtke，r.r.schmidt，herbizide[除草剂]，georg thieme verlag，stuttgart，1995；w.h.ahrens，herbicide handbook，第7版，weed science society of america，1994以及k.k.hatzios，herbicide handbook，第7版增补，weed science society of america，1998。
[0092]
本发明中采用的“植物”没有特定限制，包括单子叶或双子叶植物。植物还包括草本植物或木本植物。单子叶植物包括但不限于泽泻科、水鳖科、水麦冬科、芝菜科、眼子草科、茨藻科、大叶藻科、百合科、血皮草科、龙舌兰科、石蒜科、薯蓣科、雨久花科、鸢尾科、水玉簪科、灯心草科、鸭距草科、谷精草科、禾本科、天南星科、浮萍科、黑三棱科、香蒲科、莎草科、芭蕉科、姜科、美人蕉科、兰科的植物。
[0093]
双子叶植物包括但不仅限于岩梅科、山柳科、鹿蹄草科、杜鹃花科、紫金牛科、报春花科、蓝雪科、柿树科、安息香料、山矾属、木犀科、马钱科、龙胆科、睡菜科、夹竹桃科、萝藦科、茜草科、花葱科、旋花科、紫草科、马鞭草科、唇形科、茄科、玄参科、紫葳科、爵床科、胡麻科、列当科、苦苣苔科、狸藻科、透骨草科、车前草科、忍冬科、五福花科、败酱科、川绿断科、桔梗科、菊科、杨梅科、胡桃科、杨柳科、桦木科、山毛榉科、榆科、桑科、荨麻科、檀香科、桑寄生科、蓼科、商陆科、紫茉莉科、番杏科、马齿苋科、石竹科、藜科、苋科、仙人掌科、木兰科、八角科、樟科、连香树科、毛茛科、小檗科、木通科、防己科、睡莲科、金鱼藻科、莼菜科、三白草科、胡椒科、金粟蓝科、马兜铃科、猕猴桃科、山茶科、藤黄科、茅膏菜科、罂粟、黄花菜、十字花科、悬铃木科、金缕梅科、景天科、虎耳草科、杜仲科、海桐花科、蔷薇科、豆科、酢浆草科、牻牛儿苗科、旱金莲科、蒺藜科、亚麻科、大戟科、水马齿科、芸香科、木科、楝科、远志科、漆树科、槭树科、无患子科、七叶树科、清风藤科、凤仙科、冬青科、卫矛科、省沽油科、黄杨科、岩高兰科、鼠李科、葡萄科、杜英科、椴树科、锦葵科、梧桐科、瑞香科、胡颓子科、大风子科、堇菜科、、柽柳科、沟繁缕科、秋海棠科、葫芦科、千屈菜科、石榴科、柳叶菜科、小二仙草科、八角枫科、山茱萸科、五加科、伞形科(繖形花科)的植物。
[0094]
在另一个示例性实施例中，植物包括但不仅限于(1)粮食作物：稻属(oryza spp.)，例如稻、阔叶稻(oryza latifolia)、水稻(oryza sativa l.)、光稃稻(oryza glaberrima)；小麦属(triticum spp.)，例如普通小麦(triticum aestivum)、硬粒小麦(t.turgidum ssp.durum)；大麦属(hordeum spp.)，例如大麦(hordeum vulgare)、亚利桑那大麦(hordeum arizonicum)；黑麦(secale cereale)；燕麦属(avena spp.)，例如燕麦(avena sativa)、野燕麦(avena fatua)、比赞燕麦(avena byzantina)、野燕麦原变种(avena fatua var.sativa)、杂种燕麦(avena hybrida)；稗属(echinochloa spp.)，例如，珍珠粟(pennisetum glaucum)、高粱(两色高粱)、黑小麦、玉蜀黍、玉米、粟、稻(rice)、谷子、糜子、两色蜀黍、黍子、荞麦属(fagopyrum spp.)、黍(panicum miliaceum)、小米、沼生菰(zizania palustris)、埃塞俄比亚画眉草(eragrostis tef)、稷(panicum miliaceum)、龙爪稷(eleusine coracana)；(2)豆类作物：大豆属(glycine spp.)(例如大豆)、野豌豆属(vicia spp.)、豇豆属(vigna spp.)、豌豆属(pisum spp.)、芸豆(field bean)、羽扇豆属(lupinus spp.)、蚕豆属(vicia)、酸豆(tamarindus indica)、兵豆(lens culinaris)、山黧豆属(lathyrus spp.)、扁豆属(lablab)、蚕豆、绿豆、红豆、鹰嘴豆；(3)油料作物：花生(arachis hypogaea)、落花生属(arachis spp)、胡麻属(sesamum spp.)、向日葵属(helianthus spp.)(例如向日葵(helianthus annuus))、油棕属(elaeis)(例如油棕(eiaeis guineensis)、美洲油棕(elaeis oleifera))、油菜、芸苔、芝麻、芥菜(brassica juncea)、油菜籽油菜(oilseed rape)、油茶、油棕、油橄榄、蓖麻、欧洲油菜、卡诺拉油菜(canola)；(4)纤维作物：剑麻(agave sisalana)、棉属(棉花、海岛棉(gossypium barbadense)、陆地棉(gossypium hirsutum))、红麻、剑麻、蕉麻、亚麻(linum usitatissimum)、黄麻、苎麻、大麻(cannabis sativa)、火麻；(5)水果类作物：枣属(ziziphus spp.)、香瓜属(cucumis spp.)、鸡蛋果(passiflora edulis)、葡萄属(vitis spp.)、越桔属(vaccinium spp.)、西洋梨(pyrus communis)、李属(prunus spp.)、番石榴属(psidium spp.)、石榴(punica granatum)、苹果属(malus spp.)、西瓜(citrullus lanatus)、柑桔属(citrus spp.)、无花果(ficus carica)、金桔属(fortunella spp.)、草
virgatum)、草原草(prairie grasses)、印度草(indiangrass)、大须芒草(big bluestem grass)、梯牧草(phleum pratense)、草皮草(turf)、莎草科(高山嵩草、脚苔草(carexpediformis)、低苔草)、苜蓿、梯牧草、紫花苜蓿、草木犀、紫云英、柽麻、田菁、红萍、水葫芦、紫穗槐、羽扇豆、三叶草、沙打旺、水浮莲、水花生、黑麦草；(12)糖料作物：甘蔗(甘蔗属物种(saccharum spp.))、甜菜(beta vulgaris)；(13)饮料作物：大叶茶(camellia sinensis)、茶(camellia sinensis)、茶树(tea)、咖啡(咖啡属物种(coffea spp.))、可可树(theobroma cacao)、蛇麻花(啤酒花)；(14)草坪植物：固沙草(ammophila arenaria)、早熟禾属(poa spp.)(草地早熟禾(poa pratensis)(蓝草))、剪股颖属物种(agrostis spp.)(剪股颖、匍匐剪股颖(agrostis palustris))、黑麦草属物种(lolium spp.)(黑麦草)、羊茅属物种(festuca spp.)(羊茅)、结缕草属物种(zoysia spp.)(结缕草(zoysia japonica))、狗牙根属物种(cynodon spp.)(百慕大草、狗牙根)、侧钝叶草(stenotaphrum secunda tum)(圣奥古斯丁草)、雀稗属物种(paspalum spp.)(巴哈草)、假俭草(eremochloa ophiuroides)(百足草)、地毯草属物种(axonopus spp.)(地毯草)、指形垂穗草(bouteloua dactyloides)(野牛草)、垂穗草属变种物种(bouteloua var.spp.)(格兰马草)、马唐(digitaria sanguinalis)、香附子(cyperus rotundus)、短叶水蜈蚣(kyllinga brevifolia)、阿穆尔莎草(cyperus amuricus)、加拿大飞蓬(erigeron canadensis)、天胡荽(hydrocotyle sibthorpioides)、鸡眼草(kummerowia striata)、地锦(euphorbia humifusa)、耕地堇菜(viola arvensis)、白颖苔草、异穗苔草、草皮草(turf)；(15)树木作物：松属(pinus spp.)、柳属(salix sp.)、槭树属(acer spp.)、木槿属(hibiscus spp.)、桉属(eucalyptus sp.)、银杏(ginkgo biloba)、箣竹属(bambusa sp.)、杨属(populus spp.)、牧豆树属(prosopis spp.)、栎属(quercus spp.)、刺葵属(phoenix spp.)、山毛榉属(fagus spp.)、吉贝(ceiba pentandra)、樟属(cinnamomum spp.)、黄麻属(corchorus sp.)、南方芦苇(phragmites australis)、酸浆属(physalis spp.)、山蚂蝗属(desmodium spp.)、杨、常春藤、白杨、珊瑚树、栎类、臭椿、木荷、冬青、悬铃木、女贞、大叶黄扬、落叶松、黑荆树、马尾松、思茅松，云南松、南亚松、油松、红松、黑胡桃、柠檬、悬铃木、蒲桃、珙桐、木棉、爪哇木棉、洋紫荆、羊蹄甲、雨树、合欢、龙牙花、刺桐、广玉兰、苏铁、紫薇、针叶树、乔木、灌木、桑树；(16)坚果作物：巴西栗(bertholletia excelsea)、栗属(castanea spp.)、榛属(corylus spp.)、山核桃属(carya spp.)、核桃属(juglans spp.)、阿月浑子(pistacia vera)、腰果(anacardium occidentale)、澳洲坚果(全缘叶澳洲坚果(macadamia integrifolia))、碧根果、夏威夷果、开心果、巴旦木以及产生坚果的植物；(17)其他：拟南芥、臂形草、蒺藜草、大狗尾草、牛筋草、cadaba farinosa、藻类(algae)、carex elata、观赏植物、大果假虎刺(carissa macrocarpa)、菜蓟属(cynara spp.)、野胡萝卜(daucus carota)、薯蓣属(dioscorea spp.)、蔗茅属(erianthus sp.)、苇状羊茅(festuca arundinacea)、萱草(hemerocallis fulva)、百脉根属(lotus spp.)、luzula sylvatica、紫苜蓿(medicago sativa)、草木樨属(melilotus spp.)、黑桑(morus nigra)、烟草属(nicotiana spp.)、木犀榄属(olea spp.)、鸟足豆属(ornithopus spp.)、欧防风(pastinaca sativa)、接骨木属(sambucus spp.)、白芥属(sinapis sp.)、蒲桃属(syzygium spp.)、鸭茅状摩擦禾(tripsacum dactyloides)、triticosecale rimpaui、香堇(viola odorata)等。
[0095]
在一个具体实施例中，植物为水稻、高粱、小麦、大麦、谷子、玉米、甘蔗、拟南芥、大豆、花生、烟草、棉花、萝卜、甘蓝、甘薯、木薯、马铃薯、番茄、辣椒、茄子、西瓜、南瓜、黄瓜、生菜、莴苣、芝麻、油菜、向日葵、桑树、豇豆、草莓、苹果、桃、樱桃、杏、葡萄、番木瓜或苜蓿。
[0096]
在本发明中，术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。
[0097]
在本发明中，“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。
[0098]
在本发明中，“宿主生物”应理解为可以引入突变型蛋白编码核酸的任何单细胞或多细胞生物，包括例如细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。
[0099]
在一个方面，本发明提供了一种对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo多肽或其生物活性片段，所述多肽含有基序“lllnyi”(“亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸-天冬氨酰-酪氨酸-异亮氨酸”)，其中所述基序内第三位的亮氨酸l被任何其他氨基酸取代或第五位的酪氨酸y被任何其他氨基酸取代。
[0100]
在一个实施方案中，所述“lllnyi”基序内，第三位的亮氨酸l发生突变为丝氨酸s，简写表示为“llsnyi”；或
[0101]
第三位的亮氨酸l发生突变为异亮氨酸i，简写表示为“llinyi”；或
[0102]
第三位的亮氨酸l发生突变为甘氨酸g，简写表示为“llgnyi”；或
[0103]
第三位的亮氨酸l发生突变为苏氨酸t，简写表示为“lltnyi”；或
[0104]
第三位的亮氨酸l发生突变为缬氨酸v，简写表示为“llvnyi”；或
[0105]
第三位的亮氨酸l发生突变为色氨酸w，简写表示为“llwnyi”；或
[0106]
第五位的酪氨酸y发生突变为甲硫氨酸m，简写表示为“lllnmi”；或
[0107]
第五位的酪氨酸y发生突变为异亮氨酸i，简写表示为“lllnii”；或
[0108]
第五位的酪氨酸y发生突变为亮氨酸l，简写表示为“lllnli”；或
[0109]
第五位的酪氨酸y发生突变为缬氨酸v，简写表示为“lllnvi”。
[0110]
在另一个实施方案中，所述“lllnyi”基序内，第三位的亮氨酸l被任何其他氨基酸取代且第五位的酪氨酸y被任何其他氨基酸取代。
[0111]
在又一个实施方案中，所述“lllnyi”基序内，第三位的亮氨酸l发生突变为丝氨酸s且第五位的酪氨酸y发生突变为异亮氨酸i，简写表示为“llsnii”；或
[0112]
第三位的亮氨酸l发生突变为苏氨酸t且第五位的酪氨酸y发生突变为异亮氨酸i，简写表示为“lltnii”；或
[0113]
第三位的亮氨酸l发生突变为苏氨酸t且第五位的酪氨酸y发生突变为缬氨酸v，简写表示为“lltnvi”；或
[0114]
第三位的亮氨酸l发生突变为丝氨酸s且第五位的酪氨酸y发生突变为缬氨酸v，简写表示为“llsnvi”；或
[0115]
第三位的亮氨酸l发生突变为缬氨酸v且第五位的酪氨酸y发生突变为亮氨酸l，简写表示为“llvnli”；或
[0116]
第三位的亮氨酸l发生突变为色氨酸w且第五位的酪氨酸y发生突变为亮氨酸l，简
写表示为“llwnli”。
[0117]
在一个实施方案中，所述多肽包含与seq id no:1-19中的任一者所示的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的自由组合的氨基酸序列及其片段的变体，该变体包含上述所定义的一个或多个氨基酸突变。
[0118]
在另一个实施方案中，所述多肽具有seq id no:1-19中的任一者所示的氨基酸序列，区别在于具有上述所定义的一个或多个氨基酸突变；优选地，所述多肽的氨基酸序列如seq id no:1-19中的任一者所示，区别在于上述所定义的一个或多个氨基酸突变。
[0119]
在又一个实施方案中，其氨基酸序列与野生型水稻ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:1所示的野生型水稻ppo1蛋白氨基酸序列中的第423和425位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0120]
与野生型玉米ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:2所示的野生型玉米ppo1蛋白氨基酸序列中的第424和426位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0121]
与野生型油菜ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:3所示的野生型油菜ppo1蛋白氨基酸序列中的第424和426位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0122]
与野生型油菜ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:4所示的野生型油菜ppo1蛋白氨基酸序列中的第423和425位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0123]
与野生型花生ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:5所示的野生型花生ppo1蛋白氨基酸序列中的第445和447位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0124]
与野生型花生ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:6所示的野生型花生ppo1蛋白氨基酸序列中的第439和441位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0125]
与野生型大豆ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:7所示的野生型大豆ppo1蛋白氨基酸序列中的第430和432位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0126]
与野生型高粱ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:8所示的野生型高粱ppo1蛋白氨基酸序列中的第423和425位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0127]
与野生型小麦ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:9、10或11所示的野生型小麦ppo1蛋白氨基酸序列中的第418和420位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0128]
与野生型番茄ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:12所示的野生型番茄ppo1蛋白氨基酸序列中的第445和447位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0129]
与野生型马铃薯ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:13所示
的野生型马铃薯ppo1蛋白氨基酸序列中的第444和446位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0130]
与野生型烟草ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:14所示的野生型烟草ppo1蛋白氨基酸序列中的第440和442位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0131]
与野生型拟南芥ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:15所示的野生型拟南芥ppo1蛋白氨基酸序列中的第423和425位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0132]
与野生型陆地棉ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:16所示的野生型陆地棉ppo1蛋白氨基酸序列中的第426和428位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0133]
与野生型萝卜ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:17所示的野生型萝卜ppo1蛋白氨基酸序列中的第425和427位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0134]
与野生型谷子ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:18所示的野生型谷子ppo1蛋白氨基酸序列中的第422和424位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变；或者，
[0135]
与野生型甘蓝ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:19所示的野生型甘蓝ppo1蛋白氨基酸序列中的第424和426位中的一个或多个位置处具有一个或多个突变。
[0136]
在又一个实施方案中，其氨基酸序列与野生型水稻ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:1所示的野生型水稻ppo1蛋白氨基酸序列中的第423和425位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l423s、l423i、l423g、y425m、y425i和y425v，优选地具有如下突变：l423s/y425i；或者，
[0137]
与野生型玉米ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:2所示的野生型玉米ppo1蛋白氨基酸序列中的第424和426位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l424t、l424s、l424v、y424w、y426v、y426i和y426l，优选地具有如下突变：l424t/y426v、l424s/y426v、l424v/y426l、l424w/y426l或l424s/y426i；或者，
[0138]
与野生型油菜ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:3所示的野生型油菜ppo1蛋白氨基酸序列中的第424和426位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l424s和y426i，优选地具有如下突变：l424s/y426i；或者，
[0139]
与野生型油菜ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:4所示的野生型油菜ppo1蛋白氨基酸序列中的第423和425位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l423s和y425i，优选地具有如下突变：l423s/y425i；或者，
[0140]
与野生型花生ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:5所示的野生型花生ppo1蛋白氨基酸序列中的第445和447位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l445s和y447i，优选地具有如下突变：l445s/y447i；或者，
[0141]
与野生型花生ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:6所示的野生型花生ppo1蛋白氨基酸序列中的第439和441位中的一个或多个位置处具有选自下述中
的一个或多个突变：l439s和y441i，优选地具有如下突变：l439s/y441i；或者，
[0142]
与野生型大豆ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:7所示的野生型大豆ppo1蛋白氨基酸序列中的第430和432位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l430s和y432i，优选地具有如下突变：l430s/y432i；或者，
[0143]
与野生型高粱ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:8所示的野生型高粱ppo1蛋白氨基酸序列中的第423和425位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l423s和y425i，优选地具有如下突变：l423s/y425i；或者，
[0144]
与野生型小麦ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:9、10或11所示的野生型小麦ppo1蛋白氨基酸序列中的第418和420位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l418s和y420i，优选地具有如下突变：l418s/y420i；或者，
[0145]
与野生型番茄ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:12所示的野生型番茄ppo1蛋白氨基酸序列中的第445和447位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l445s和y447i，优选地具有如下突变：l445s/y447i；或者，
[0146]
与野生型马铃薯ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:13所示的野生型马铃薯ppo1蛋白氨基酸序列中的第444和446位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l444s和y446i，优选地具有如下突变：l444s/y446i；或者，
[0147]
与野生型烟草ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:14所示的野生型烟草ppo1蛋白氨基酸序列中的第440和442位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l440s和y442i，优选地具有如下突变：l440s/y442i；或者，
[0148]
与野生型拟南芥ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:15所示的野生型拟南芥ppo1蛋白氨基酸序列中的第423和425位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l423s和y425i，优选地具有如下突变：l423s/y425i；或者，
[0149]
与野生型陆地棉ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:16所示的野生型陆地棉ppo1蛋白氨基酸序列中的第426和428位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l426s和y428i，优选地具有如下突变：l426s/y428i；或者，
[0150]
与野生型萝卜ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:17所示的野生型萝卜ppo1蛋白氨基酸序列中的第425和427位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l425s和y427i，优选地具有如下突变：l425s/y427i；或者，
[0151]
与野生型谷子ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:18所示的野生型谷子ppo1蛋白氨基酸序列中的第422和424位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l422s和y424i，优选地具有如下突变：l422s/y424i；或者，
[0152]
与野生型甘蓝ppo1的氨基酸序列相比，在对应于/仅对应于seq id no:19所示的野生型甘蓝ppo1蛋白氨基酸序列中的第424和426位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：l424s和y426i，优选地具有如下突变：l424s/y426i。
[0153]
在又一个实施方案中，所述多肽具有seq id no:20-48中的任一者所示的氨基酸序列；优选地，所述多肽的氨基酸序列如seq id no:20-48中的任一者所示。
[0154]
术语“基序”或“共有序列”是指进化的相关蛋白质序列中的短保守区。基序通常是结构域的高度保守部分，但也可以仅包括结构域的一部分，或者位于保守结构域之外(如果基序的所有氨基酸都落在限定的结构域之外)。
[0155]
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。
[0156]
对于说明书中所用的有关氨基酸取代的术语，第一个字母代表特定序列某一位置上天然存在的氨基酸，后面的数字代表相对于seq id no:1的位置，第二个字母代表取代该天然氨基酸的不同氨基酸。譬如l423s表示相对于seq id no:1的氨基酸序列而言，第423位的亮氨酸被丝氨酸取代。对于双重或多重突变，各突变之间以“/”隔开。例如，l423s/y425i表示相对于seq id no:1的氨基酸序列而言，第423位的亮氨酸被丝氨酸取代，以及第425位的酪氨酸被异亮氨酸取代，全部两个突变均存在于所述具体的突变型osppo1蛋白内。
[0157]
本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与seq id no:1或seq id no:2-19等进行比对而确定的，譬如用smith-waterman运算法则或用clustalw2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照wilbur,w.j.and lipman,d.j.(1983)rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks.proc.natl.acad.sci.usa,80:726-730中所述的方法进行计算。在clustalw2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝gonnet；蛋白质/dna端隙＝-1；蛋白质/dna gapdist＝4。
[0158]
优选采用alignx程序(vectornti组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10；缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与seq id no:1进行比对来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。
[0159]
氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，使用可从美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的blast运算法则(altschul et al.,1990,mol.biol.215:403-10)，使用默认参数确定。
[0160]
本领域技术人员还清楚的是，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维构型产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。只要取代不损害蛋白质的生物活性，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。
[0161]
因此，本发明的突变型蛋白除了包含上述突变之外，还可以在氨基酸序列中包含一个或多个其他突变例如保守性取代。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的突变型蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。
[0162]
如本领域中所熟知的，可以从蛋白质的n和/或c末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，在另一方面，本发明还涉及从突变型蛋白的n和/或c末端缺失了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的片段，它们也在本发明的范围内，被称为生物活性片段。在本发明中，“生物活性片段”是指本发明的突变型蛋白的一部分，其保留
了本发明的突变型蛋白的生物学活性。例如，突变型蛋白的生物学活性片段可以是在所述蛋白质的n和/或c末端缺失了一个或多个(例如1－50个、1－25个、1－10个或1－5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。
[0163]
术语"突变"是指相对于正规序列或野生型序列或参考序列，多肽中的单个氨基酸变异和/或核酸序列中的至少单个核苷酸变异。在一些实施方案中，突变是指相对于非抗除草剂的ppo蛋白的核苷酸或氨基酸序列，多肽中的单个氨基酸变异和/或核酸序列中的至少单个核苷酸变异。在一些实施方案中，突变是指相对于参考ppo氨基酸序列如seq id no:1-19中的任一者所示的氨基酸位置处或在其不同物种同源基因的同源位置处具有一个或多个突变。在某些实施方案中，突变可包括置换、缺失、倒位或插入。在一些实施方案中，置换、缺失、插入、或倒位可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的变异。在一些实施方案中，置换、缺失、插入、或倒位可包括在1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸位置处的变异。
[0164]
术语“野生型”和突变是相对来说的，指的是在特定种群中最高频率的表型，或具有这种表型的系统、生物和基因。在一些例子中，野生型等位基因是指在基因座处的标准等位基因，或在特定种群中具有最高频率的等位基因，可以由特定氨基酸或核酸序列表示。例如，野生型水稻ppo蛋白可由seq id no:1表示。例如，野生型玉米ppo蛋白可由seq id no:2表示。
[0165]
在又一方面，本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含选自下述的核酸序列：
[0166]
(1)编码所述的ppo多肽或其生物活性片段的核酸序列或其部分序列或其互补序列；
[0167]
(2)在严谨条件下与(1)所示序列杂交的核酸序列；和
[0168]
(3)因遗传密码的简并性而与(1)所示序列编码相同氨基酸序列的核酸序列，或其互补序列。
[0169]
在一个实施方案中，所述的多核苷酸是dna分子。
[0170]
术语“多核苷酸”、"核酸"、"核酸分子"或"核酸序列"可以互换使用，是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸和其片段或部分，其可以是单链或双链，并且表示有义或反义链。核酸包括dna、rna或者其杂交体，并且可以具有天然或合成来源。例如，核酸可包括mrna或cdna。核酸可包括已被扩增(例如，使用聚合酶链反应)的核酸。核苷酸的单字母代码如美国专利局专利审查程序手册第2422节表1中所述。在这一点上，核苷酸名称"r"意指嘌呤例如鸟嘌呤或腺嘌呤；"y"意指嘧啶例如胞嘧啶或胸腺嘧啶(如果是rna则为尿嘧啶)；"m"意指腺嘌呤或胞嘧啶；"k"意指鸟嘌呤或胸腺嘧啶；以及"w"意指腺嘌呤或胸腺嘧啶。术语“分离”，当提及核酸时，是指这样的核酸，所述核酸与其天然存在于其中的基因组的实质部分分开和/或与天然伴随该核酸的其他细胞组分基本上分离。例如，已经通过合成(如通过连续碱基缩合)而产生的任意核酸被认为是分离的。同样地，重组表达的核酸、克隆的核酸、通过引物延伸反应(例如pcr)产生的核酸或另外切离基因组的核酸也被认为是分离的。
[0171]
本领域技术人员十分清楚，由于遗传密码的简并性，有多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同蛋白质的其他核酸序列在本领域普通技术人员的能力范围内，因此本发明涵盖因遗传密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的核酸序列。例如，为了在目标宿主生物例如植物中实现异源基因的高表达，可以对所述基因采用宿
主生物偏好的密码子进行优化，以使其更好地表达。
[0172]
本发明还提供了一种植物基因组，其中包含所述的多核苷酸。
[0173]
在一个实施方案中，植物基因组用至少一个突变修饰。在另一个实施方案中，植物基因组用至少两个突变修饰。
[0174]
在一个实施方案中，植物基因组突变修饰的是质体ppo基因；例如，水稻质体osppol。在另一个实施方案中，植物基因组突变修饰的是质体ppo基因等位基因；例如，bnppo1-c5或bnppo1-a10。
[0175]
本发明还提供了一种载体构建体，其中包含所述的多核苷酸以及与之可操作的连接的同源或非同源启动子。
[0176]
本发明还提供了一种宿主细胞，其中包含所述的多核苷酸或载体构建体。
[0177]
在一个实施方案中，所述的宿主细胞是植物细胞。
[0178]
本发明还提供了一种能产生或提高对原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂耐受性的植物细胞的生产方法，其中包括采用基因编辑的方法在植物细胞中生成上述的多核苷酸或上述的载体构建体，或者采用转基因的方式在植物细胞中导入上述的多核苷酸或上述的载体构建体。
[0179]
本发明还提供了一种能产生或提高对原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂耐受性的植物的生产方法，其中包括将上述的植物细胞或采用上述方法生产的植物细胞再生成植物。
[0180]
本发明还提供了通过上述的方法所生产的植物。
[0181]
在一个实施方案中，上述植物或植物细胞是非转基因的。
[0182]
在另一个实施方案中，上述植物或植物细胞是转基因的。
[0183]
术语“转基因”植物是指包含异源多核苷酸的植物。优选地，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得多核苷酸传递至连续世代。异源多核苷酸可以单独整合到基因组中或作为重组表达盒的一部分整合。“转基因”在本文中用于指任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型由于异源核酸的存在而被改变，包括那些最初被改变的转基因生物体或细胞，以及从初始转基因生物体或细胞杂交或无性繁殖所产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不旨在包括通过常规植物育种方法(例如，杂交)或通过天然发生的事件(如，自体受精、随机杂交受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)改变基因组(染色体或染色体外)。
[0184]
术语“基因编辑的植物”，“基因编辑的植物部分”或“基因编辑的植物细胞”是指包含一个或多个通过基因编辑系统编辑的内源基因的植物，其部分或细胞。“基因编辑系统”是指当被引入到细胞中时能够修饰内源性dna序列的靶基因座的蛋白质、核酸或其组合。许多适用于在本发明的方法中使用的基因编辑系统是本领域已知的，包含但不限于锌指核酸酶(zfns)系统、转录激活样效应因子核酸酶(talen)系统和crispr/cas系统。如本文所用的术语“基因编辑”通常是指在基因组中进行dna插入、删除、修改或替换的一项技术。例如，所述基因编辑可以包括敲入(knock-in)法。所述敲入的方法可以是本领域技术人员所常用的操作方法，例如可以参见“基因打靶：一个实用的方法”，joyner编辑，牛津大学出版社有限公司，2000。
[0185]
本发明还提供了一种使植物产生或提高对原卟啉原氧化酶类除草剂耐受性的方
法，其中包括在编码具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白的基因中引入修饰以产生所述的ppo多肽或其生物活性片段。
[0186]
本发明还提供了一种能产生或提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物对原卟啉原氧化酶类除草剂耐受性的方法，其中包括在所述植物细胞、植物组织、植物部分或植物中表达所述的ppo多肽或其生物活性片段；
[0187]
或者，其中包括将表达所述的ppo多肽或其生物活性片段的植物与另一植物杂交，以及筛选能产生或提高对原卟啉原氧化酶类除草剂耐受性的植物或其部分；
[0188]
或者，其中包括对所述植物细胞、植物组织、植物部分或植物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白进行基因编辑，以实现在其中表达所述的ppo多肽或其生物活性片段。
[0189]
本发明还提供了所述的ppo多肽或其生物活性片段或者所述的多核苷酸用于产生或提高宿主细胞、植物细胞、植物组织、植物部分或植物对原卟啉原氧化酶类除草剂耐受性的用途。
[0190]
在一个实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞或真菌细胞。
[0191]
上述除草剂抗性ppo蛋白通过本行业最为通常的自然萃取和提炼方式获取。也可通过化学合成方法获得合成蛋白质，或通过基因重组技术获得重组蛋白质方式获取。当使用化学合成方式，蛋白质通过本行业通用的多肽合成方法获取。当使用基因重组技术，除草剂抗性ppo蛋白的核酸编码将借助适当的表达载体插入，上述载体将转化成宿主细胞。培养该宿主细胞表达目标蛋白质后，即可在宿主细胞中发现并获取除草剂抗性ppo蛋白。蛋白质在所选宿主细胞被表达后，采用通用生物化学分离。例如蛋白质沉淀剂(盐析)、离心分离、超声消融术、超滤、透析、分子筛色谱分析(凝胶过滤)、吸附色谱分析、离子交换色谱分析、亲和色谱分析等类型处理进行隔离和净化。通常为了能够得到高纯度的分离蛋白质，可以结合上述方法中几种方法来进行。
[0192]
除草剂抗性ppo核酸分子可通过标准分子生物法来分离和准备。例如：化学合成或重组技术。可在商用化的方法中选择其中之一进行。
[0193]
上述获取的ppo蛋白可转移到植物，用来增强植物的除草剂抗性。
[0194]
上述除草剂抗性ppo基因根据本行业中通用的方法，可以导入植物中，可通过适当的植物转化表达载体进行转基因或基因编辑操作。
[0195]
包括载体在内选用任何适当的启动子是进行植物转基因或基因编辑时行业内通用的方法。例如：在植物转基因或基因编辑中常用的启动子包括但不限于sp6启动子、t7启动子、t3启动子、pm启动子、玉米泛素启动子、花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、胭脂氨酸合成酶(nos)启动子、玄参花叶病毒35s启动子、甘蔗杆状的病毒启动子、竹节花黄斑驳病毒启动子、光诱导启动子核酮糖-1，5-酮糖羧化酶(ssrubisco小亚基)、大米胞质磷酸丙糖异构酶(tpi)启动子、拟南芥腺嘌呤转磷酸核糖基酶(aprt)启动子、章鱼碱合成酶启动子和bcb(蓝铜结合蛋白)启动子。
[0196]
植物转基因或基因编辑载体包括可引起3
’‑
端聚腺苷酸化的多聚腺苷酸信号序列。例如，包括但不限于农杆菌的胭脂氨酸合成酶基因的nos 3
’‑
末端衍生物、农杆菌的章鱼碱合成酶基因的章鱼碱合成酶3
’–
末端衍生物、番茄或马铃薯蛋白酶抵抗剂i或ii基因的3
’‑
末端、camvpoly a信号序列、稻米α-淀粉酶基因3
’–
末端和菜豆碱基因3
’–
末端。
[0197]
上述转基因载体要表达叶绿体中的除草剂抗性ppo基因，定标在叶绿体上的转运
肽可连接在ppo基因的5
’‑
末端。
[0198]
载体也包括可选择性标记为报道分子的基因编码，可选择性标记的例子包括但不限于抗生素(例如:新霉素、羧苄青霉素、卡那霉素、大观霉素、潮霉素、争光霉素、氯霉素等)或抗除草剂(草甘膦、草铵膦、草胺膦等)基因。
[0199]
载体转化的方法包括使用农杆菌介导转化法、电穿孔、微粒轰击法、聚乙烯乙二醇-介质吸收等方法将重组质粒导入到植物中。
[0200]
本发明中植物转化受体包括植物细胞(包含悬浮培养细胞)、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、芽和成熟的植物体。
[0201]
转基因或基因编辑植物的范围不仅包括基因导入的当代获得的植物体，还包括它的克隆和后代(tl代、t2代或随后的几代)。例如：包含本发明中所提供的对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo多肽编码核苷酸序列的转基因或基因编辑植物，通过有性和无性生殖获得含有上述对ppo抑制剂类除草剂具有耐受性的ppo多肽编码核苷酸序列的后代，具有遗传除草剂抗性特性的植物也包括在内。本发明的范围还包括上述转基因或基因编辑植物通过杂交和融合后显示出初代转基因或基因编辑植物特点的所有突变体和变体。本发明的范围还包括植物的一部分，如种子、花、茎、果实、叶、根、块茎、块状茎，这些部分来自通过本发明中提及的方法提前进行转基因或基因编辑修饰的植物，或它的后代，至少要由转基因或基因编辑修饰细胞的一部分组成。
[0202]
本发明还提供了一种控制植物栽培场所的杂草的方法，其中所述植物包括前述的植物或者通过前述方法制备的植物，所述方法包括对所述栽培场所施用除草有效量的原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂。
[0203]
在一个实施方案中，用一种原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂来控制杂草。
[0204]
在另一个实施方案中，有两种或更多种的原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂依次或同时使用来控制杂草。
[0205]
在又一个实施方案中，所述原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂与一种或多种另外的除草剂联合施用。
[0206]
在本发明中，术语“场所”包括栽培本发明植物的场地例如土壤，也包括例如植物种子、植物苗以及长成的植物。术语“除草有效量”指的是除草剂的量足以影响目标杂草的生长或发育，例如阻止或抑制目标杂草的生长或发育，或者杀灭所述杂草。有利地，所述除草有效量不会显著影响本发明植物种子、植物苗或植物的生长和/或发育。本领域技术人员可以通过常规实验确定这样的除草有效量。
[0207]
本发明可以通过多种不同形式实施，实施方法不受本文阐述方法限制。本文提供的实施个例是为达到彻底和完全效果提供，行业内人士可充分了解本发明的范围。相同的参考编号在本发明当中指代相同的因素。
[0208]
本文中使用的“第一”，“第二”，“第三”是为了描述多种不同因素和成分，这些因素和成分不受术语限制。这些术语是为区分一个因素和成分和另外一个因素和成分使用。
[0209]
本文中使用术语是为了描述特定的实施例，不是为了设定限制。除非是文中明确特别指出的内容外，上述内容中英文版本中使用的“a，”“an”和“the”也包含它们的复数形式。本文中使用的术语“组成-comprises”和/或“组成-comprising，”或“包括-includes”和/或“包括-including”特指本文中描述的特点，因素和/或成分的存在，不排除存在和追
加一个或多个其他特点，因素和成分。上述内容中使用的术语“和/或”包括所有一个或多个组合清单中的项目。
[0210]
本发明已经通过一系列实施例进行详尽的阐述，但本发明不仅限于已经揭示的实施例。符合本发明范围内的任何数量变动，替换，置换等，本文中未进行阐述，或可根据耕种需要进行修改。
[0211]
本发明的有益效果为：所述突变形式可以降低原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂对含有突变形式原卟啉原氧化酶的抑制作用，但同时这些突变不会降低原卟啉原氧化酶自身的催化活性，通过基因编辑的手段将植物内原的原卟啉原氧化酶(ppo)修改为这些突变形式或者通过转基因的手段在植物中引入带有这些突变形式原卟啉原氧化酶的基因，可以大大提高植物对原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂的抗性，可使用在包括经济作物在内的植物上，根据除草剂抗性特性和除草剂选择使用，从而达到经济地控制杂草生长的目的。
具体实施方式
[0212]
以下结合实施例对本发明做进一步说明。在这些实施例中描述的所有方法和操作是以举例方式提供的，其不应被理解为限制性的。
[0213]
实施例1：植物原卟啉原氧化酶ppo氨基酸序列比对
[0214]
原卟啉原氧化酶在动物、植物、细菌和真菌中都存在，它在分子氧的条件下，催化原卟啉原ix生成原卟啉ix，原卟啉原氧化酶是四吡咯生物合成中的最后一个关键酶，主要合成亚铁血红素和叶绿素。在植物体中，原卟啉原氧化酶存在2种同工酶，分别位于线粒体和叶绿体中。对水稻(ncbi编号xm_015770568.2(seq id no：1))、玉米(ncbi编号nm_001112094(seq id no：2))、油菜(ncbi编号bnppo1-c5：xm_013841402.2(seq id no：3)；bnppo1-a10：xm_013810914.2(seq id no：4))、花生(ncbi编号ahppo1-a：xm_025762937.2(seq id no：5)；ahppo1-b：xm_025820369.2(seq id no：6))、大豆(ncbi编号xm_003535957.4(seq id no：7))、高粱(ncbi编号xm_002455439.2(seq id no：8))、小麦(ncbi编号tappo1-a：xp_037432241.1(seq id no：9)；tappo1-b：xm_037583444.1(seq id no：10)；tappo1-d：(seq id no：11))、番茄(ncbi编号nm_001348379.1(seq id no：12))、马铃薯(ncbi编号np_001275224.1(seq id no：13))、烟草(ncbi编号xm_016654498.1(seq id no：14))、拟南芥(ncbi编号at4g01690(seq id no：15))、陆地棉(ncbi编号xm_016840317.1(seq id no：16))、萝卜(ncbi编号xp_018459031.1(seq id no：17))、谷子(ncbi编号xp_004967639.1(seq id no：18))、甘蓝(ncbi编号xm_013731605.1(seq id no：19))、甘薯(ncbi编号xp_039129342.1)、木薯(ncbi编号xm_021757904.2)、辣椒(ncbi编号xm_016683798.1)、南瓜(ncbi编号xm_023107680.1)、大麦(ncbi编号xm_045092307.1)、黄瓜(ncbi编号xm_004149431.3)、莴苣(ncbi编号xm_023904577.2)、芝麻(ncbi编号xm_011081162.2)、向日葵(ncbi编号xm_022132124.2)、桑树(ncbi编号xm_010093132.2)、豇豆(ncbi编号xm_017556834.1)、草莓(ncbi编号xm_004289391.2)、苹果(ncbi编号xm_008383404.3)、桃(ncbi编号xm_007221411.2)、樱桃(ncbi编号xm_021956996.1)、杏(ncbi编号xm_034353497.1)、葡萄(ncbi编号xm_002273757.4)、番木瓜(ncbi编号xm_022041496.1)、苜蓿(ncbi编号xm_013613689.3)等不同植物的原卟啉原氧化酶的氨基酸序列进行对比，如图1，对比发现，ppo蛋白基序lllnyi在不同物种之间很保守。因此这个基序
对应位点的突变产生的生物学作用在不同物种中也可能是一致的。
[0215]
实施例2：水稻原卟啉原氧化酶ppo1基因的克隆
[0216]
水稻(oryza sativa japonica group)原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen ix oxidase，ppo)基因位于1号染色体os01g18320位点。根据其cdna序列和载体pet44a(novagen)的序列，设计和合成引物nusos-f:acgattgatgacgacgacaagatggcggcggcggcggcg和nusos-r:tccacgagctcccggactcttacttgtacgcatacttggtc。以野生型水稻的cdna为模板，用kod dna聚合酶进行pcr扩增。扩增条件为：98℃2分钟；然后98℃20秒，65℃30秒和68℃60秒，重复35次；最后68℃5分钟。扩增片段在琼脂糖凝胶电泳中显示为1.6kb，回收后通过紫外吸收法确定其dna浓度。
[0217]
pet44a(novagen)质粒经pshai(neb,new england biolabs,boston,usa)在37℃酶切1小时后，加热至65℃失活pshai。取等量osppo1dna片段与pshai线性化的pet44a载体混合，加入等体积2
×
gibson assembly master mix(汉恒生物，中国，上海)，混匀后，于50℃孵育一个小时，取5ul连接产物来转化大肠杆菌dh5a感受态，将菌液涂布至含100ppm氨苄青霉素的lb固体培养基平板表面，在37℃过夜培养。第二天，挑取单克隆，经单菌落pcr确定正确克隆后，在37℃下过夜培养三个正确克隆，提取足够质粒dna送到擎科生物技术公司(中国，北京)用sanger法测序，所用测序引物为：nus-f:gctgctgcgaaatttgaacg；nus-r:tacagctgtgcggccgcaag。测序结果证明得到了正确的全长水稻osppo1编码区dna，此表达水稻野生型ppo表达载体命名为pet44a-osppo1 wt。
[0218]
使用ppo缺陷型大肠杆菌(δhemg)测试水稻osppo1对除草剂的耐受性。δhemg菌株是缺乏hemg型ppo基因并具有卡那霉素耐受性的大肠杆菌菌株(watanabe n,che f s,iwano m,et al.dual targeting of spinach protoporphyrinogen oxidase ii to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame initiation codons[j].journal of biological chemistry,2001,276(23):20474-20481.)。将以上制备的水稻osppo1克隆质粒添加到δhemg感受态细胞中，通过电转法转化，使敲除菌重新获得ppo活性，能够在普通加氨苄青霉素和卡那霉素的lb琼脂培养基上生长。
[0219]
为了验证该体系能否用做水稻ppo1基因对化合物a耐受性的进化筛选，利用水稻野生型pet44a-osppo1 wt回补菌株，测试回补菌株在含有ppo抑制剂类除草剂的平板上的生长差异。将转化所得回补菌株δhemg/pet44a，δhemg/pet44a-osppo1 wt挑取单克隆，在100ul lb培养基中重悬，再次以十分之一的系数将稀释的溶液连续稀释4次。然后在含有浓度为0nm、300nm和1000nm化合物a的lb琼脂培养基(培养皿)上，分别滴加各稀释溶液3μl。将lb琼脂培养基在28℃下培养，在培养40至48小时后评估生长抑制水平。
[0220]
如图2所示，在不含除草剂的培养基上，δhemg/pet44a回补株系未生长，而转化的水稻δhemg/pet44a-osppo1 wt的回补株系能够正常生长。表明回补的osppo1能够在缺陷型的大肠杆菌里面正常的发挥ppo功能。
[0221]
同时也可以看出，在含有不同浓度化合物a的培养基里面，野生型水稻δhemg/pet44a-osppo1 wt回补菌株在300nm处生长出现了抑制，平板上未长出克隆。而且也证明该体系可以用作水稻osppo1基因对化合物a耐受性的进化筛选。
[0222]
实施例3：使用ppo缺陷型大肠杆菌(δhemg)筛选水稻osppo1对化合物a具有耐受性的位点
[0223]
为了筛选出水稻osppo1基因对化合物a具有耐受性的位点，依据实施例1不同植物ppo氨基酸比对结果，对水稻中具有lllnyi基序的位点进行氨基酸的饱和突变。这是通过用一个含有将需要突变的氨基酸编码子改为nnk的引物与另一适当的常规引物做pcr扩增来实现的。在nnk中，n代表a/t/g/c,k代表g/t,因此nnk密码子可以编码20种氨基酸以及终止子中的任何一个，所以这是饱和突变。参考kille s,acevedo-rocha cg,parra lp,zhang zg,opperman dj,reetzmt,acevedojp(2013)reducing codon redundancy and screening effort of combinatorial protein libraries created by saturation mutagenesis.acs synth biol 2(2):83-92；directed evolutionlibrary creation:methods and protocols 2nd ed.edited by elizabeth m.j.gillam,janine n.copp and david f.ackerley new york,ny united states:springer,2014.doi:10.1007/978-1-4939-1053-3。这将产生大量的突变体。把构建好的不同位点饱和库的质粒转化δhemg感受态细胞中，利用实施例2中的大肠杆菌筛选体系对水稻ppo1基因的不同位点对化合物a的耐受性进行筛选测试，在含有化合物a的平板上挑取生长正常的抗性克隆，对其基因型进行鉴定。筛选到6个单氨基酸突变体，它们是l423s(seq id no：20)、l423i(seq id no：21)、l423g(seq id no：22)、y425m(seq id no：23)、y425i(seq id no：24)和y425v(seq id no：25)，这些抗性突变体相对于野生型，在含有500nm化合物a的lb培养基上面生长正常，如图3所示。
[0224]
具体实验方法：
[0225]
1、以合成的osppo1-423-f和osppo1-423-r为引物，实施例2中制备的pet44a-osppo1wt质粒为模板，用kod dna聚合酶进行pcr扩增。扩增条件为：98℃/3分；98℃/20秒；65℃/30秒；72℃/3分(重复35次)；72℃/5分钟。通过琼脂糖凝胶电泳检测后，回收大小为9kb左右正确的条带。并通过紫外吸收法确定浓度。
[0226]
2、取5ul回收产物，加入等体积2
×
gibson assembly master mix(汉恒生物，中国，上海)，混匀后，于50℃孵育一个小时，取5ul连接产物来转化大肠杆菌dh5a感受态，将菌液涂布至含100ppm氨苄青霉素的lb固体培养基平板表面，在37℃过夜培养。将平板上所有克隆(菌落)刮下，提取质粒，并用紫外吸收法定量dna。
[0227]
3、取100ng构建好的质粒转化δhemg感受态细胞中，涂布在含有500nm化合物a的lb培养基平板上，培养过夜后，在含有化合物a的平板上挑取生长正常的抗性克隆，对其基因型进行鉴定。
[0228]
表1用于制备水稻ppo突变体的引物
l423s、δhemg/pet44a-osppo1 y425i、δhemg/pet44a-osppo1 l423s/y425i挑取单克隆，在100ul lb培养基中重悬，再次以十分之一的系数将稀释的溶液连续稀释4次。然后在含有浓度为0nm、1nm、10nm、20nm、50nm和100nm化合物a的lb琼脂培养基(培养皿)上，分别滴加各稀释溶液3μl。将lb琼脂培养基在28℃下培养，在培养40至48小时后评估生长抑制水平。
[0237]
实施例5：验证玉米zmppo1中lllnyi蛋白基序突变对化合物a的耐受性
[0238]
为了验证在其他植物中对ppo1保守的lllnyi蛋白基序进行突变，是否也能产生对除草剂的抗性，用上述实施例中同样的方法对lllnyi蛋白基序中第三位的亮氨酸残基和第五位的酪氨酸残基进行突变组合，用含有除草剂化合物a的lb培养基进行筛选，观测生长抑制情况。如图5所示，与野生型zmppo1-wt(seq id no：2)相比，lllnyi蛋白基序中第三位的亮氨酸残基和第五位的酪氨酸残基突变组合l424t/y426v(seq id no：27)、l424s/y426v(seq id no：28)、l424v/y426l(seq id no：29)和l424w/y426l(seq id no：30)在含有5um化合物a的平板上面生长正常，并未出现抑制情况，并且随着化合物a浓度的提高，大部分都表现出较强的耐受性，说明在不同植物中ppo保守蛋白基序lllnyi对应位点的突变产生的对除草剂耐受性的作用也是一致的。
[0239]
实施例6：验证其他作物ppo1中lllnyi蛋白基序突变对化合物a及其他ppo抑制剂类除草剂的耐受性
[0240]
为了进一步验证其他作物中，ppo保守蛋白基序lllnyi对应位点的突变产生的对除草剂耐受性的作用，利用实施例3和4里面相同方法，引物见表2所示，构建了含有水稻ppo1野生型osppo1 wt(seq id no:1)，水稻ppo1突变型osppo1 l423s/y425i(seq id no:26)，玉米ppo1野生型zmppo1wt(seq id no：2)，玉米ppo1突变型zmppo1 l424s/y426i(seq id no:31)，小麦ppo1野生型tappo1-a wt(seq id no:9)，小麦ppo1突变体tappo1-a l418s/y420i(seq id no:38)，油菜ppo1野生型bnppo1-a10 wt(seq id no:4)，油菜ppo1突变体bnppo1-a10 l423s/y425i(seq id no:33)，棉花ppo1野生型ghppo1 wt(seq id no:16)，棉花ppo1突变体ghppo1 l426s/y428i(seq id no:45)，拟南芥ppo1野生型atppo1wt(seq id no:15)，拟南芥ppo1突变体atppo1 l423s/y425i(seq id no:44)表达基因的载体，转化到ppo缺陷型大肠杆菌(δhemg)进行回补。挑取不同作物ppo1野生型基因或各种ppo1突变基因转化的ppo缺陷型大肠杆菌(δhemg)转化体的克隆在100ul lb培养基中重悬，再次以十分之一的系数将稀释的溶液连续稀释2次，然后分别滴加各稀释溶液3μl在含0.1、0.5、1、10、100um化合物a，0.1、0.5、1、10、100um苯嘧磺草胺，0.1、0.5、1、10、100um丙炔氟草胺，0.1、0.5、1、10、100um epyrifenacil，0.1、0.5、1、10、100um甲磺草胺，0.1、0.5、1、10、100um氟嘧硫草酯，0.1、0.5、1、10、100um氟磺胺草醚，0.1、0.5、1、10、100um三氟草嗪的lb琼脂培养基(培养皿)上，置于28℃恒温培养箱中培养，在培养40至48小时后评估生长抑制水平。结果如图6-8所示，实施例3和4里面的抗性位点或组合对其他ppo类型的除草剂也同样具有耐受性。
[0241]
表2引物列表
[0242][0243][0244]
实施例7：验证水稻osppo1抗性位点组合对不同类ppo除草剂的耐受性
[0245]
为了验证实施例3和4里面的抗性位点或组合是否对其他ppo类型的除草剂也具有耐受性，优选了部分位点或者组合用不同类型ppo除草剂进行耐受性验证。挑取osppo1野生型基因(表示为wt)或各种osppo1突变基因转化的ppo缺陷型大肠杆菌(δhemg)转化体的克隆在100ul lb培养基中重悬，再次以十分之一的系数将稀释的溶液连续稀释2次，然后分别滴加各稀释溶液3μl在含有100nm丙炔氟草胺、100nm乙氧氟草醚、500nm苯嘧磺草胺、5μm双唑草腈、1μm唑草酮和10μm氟磺胺草醚的lb琼脂培养基(培养皿)上，置于28℃恒温培养箱中培养，在培养40至48小时后评估生长抑制水平。结果如图9所示，实施例3和4里面的抗性位点或组合对其他ppo类型的除草剂也同样具有耐受性。
[0246]
实施例8：水稻osppo1抗性位点组合蛋白质(多肽)体外酶活性和抗性测试
[0247]
1.原卟啉原制备
[0248]
利用钠汞齐还原原卟啉，制备ppo催化的底物原卟啉原。称取10mg原卟啉溶解到
10ml溶剂中，避光氮气保护下，按照0.2g/ml添加20％钠汞齐，反应2小时。避光氮气保护下过滤，反应过后，颜色应变为无色或浅棕色。加入反应缓冲液(100mm tris
–
hcl,1mm edta,5mm dtt,0.1％tween 20/80)稀释，并利用10％盐酸调节ph至8.0左右，最终原卟啉原浓度大约为100um，分装并在液氮中或-80℃保存。
[0249]
2.osppo1蛋白表达纯化
[0250]
1)以pet44a-osppo1-wt及筛选突变体为模板，引物28mbp-osppo1-t38f:ccgcgcggcagccatatggcgggttctggtacgattg和28mbp-osppo1-t38rn:gagctcgaattcggatccttacttgtacgcatacttggtcag，用kod dna聚合酶进行pcr扩增。扩增条件为：95℃/3分；98℃/10秒；60℃/30秒；68℃/1分(重复35次)；68℃/5分钟。通过琼脂糖凝胶电泳检测后，回收大小为1.5kb左右正确的条带，并通过紫外吸收法确定浓度。
[0251]
2)取4ul回收产物，1ul pet28a-mbp载体，加入等体积2
×
gibson assembly master mix(汉恒生物，中国，上海)，混匀后，于50℃孵育一个小时，取5ul连接产物来转化大肠杆菌dh5a感受态，将菌液涂布至含100mg/l硫酸卡那霉素的lb固体培养基平板表面，在37℃过夜培养，将平板上克隆挑下测序。
[0252]
3)将构建好的融合表达载体pet28a-mbp-osppo1，转入大肠杆菌bl21(de3)中，经0.5mm iptg诱导表达，再利用ni-nta柱纯化，然后经过thrombin酶切，透析过dextrin和ni柱二次纯化，具体方法如下。将osppo1酶重组表达载体转化到bl21(de3)菌株中，挑取单克隆到10ml lb培养基中，kana抗性37℃，200rpm培养过夜，转入含有1l tb培养基的2l摇瓶中，37℃，200rpm，培养到od600达到0.6-0.8时，降温到18℃，0.5mm iptg诱导表达过夜，4000xg离心收菌。将收集好的菌体利用ni-buffer a：50mm tris ph8.0,500mm nacl,50mm咪唑重悬，高压破碎仪破碎后，40000xg，4℃离心30min，取上清过ni柱纯化。sds-page检测蛋白纯化效果。视蛋白量，加入thrombin酶，透析换buffer至50mm tris ph8.0,500mm nacl,1mm dtt。第二天过dextrin然后过ni柱纯化，目的蛋白在流出液中，收集流出液浓缩分装于-80℃备用。
[0253]
3.osppo1活性测试
[0254]
酶的底物亲和性和催化活性测定：利用反应buffer(100mm tris
–
hcl,1mm edta,5mm dtt,0.1％tween 20/80)配制含不同浓度底物原卟啉原的反应液，测试浓度为0.125、0.5、2、4、8、16um，将osppo1酶稀释至10um，吸取5ul至96孔黑色酶标板，加入反应液至100ul，酶最终工作浓度为500nm。立即混匀，荧光酶标仪检测，410nm激发，630nm检测，并制作反应曲线，如图10所示。
[0255]
实施例9：crispr/cas9介导的水稻ppo1突变体同源置换以获得除草剂抗性
[0256]
为了获得抗除草剂的非转基因水稻，对上述l423s/y425i突变点组合进行crispr/cas9介导的同源置换。水稻osppo1基因有9个外显子(exon)，8个内含子(intron)，而l423s和y425i都位于第8个外显子上。
[0257]
grna设计：在l423s的上游和y425i的下游各设计一个grna，拟各切一刀，再用同源置换的方法把两个位点同时置换。把水稻osppo1序列输入到http://crispor.tefor.net/crispor.py，评估所有可能的grna，根据特异性分数值大于90(hsu pd,scott da,weinstein ja,ran fa,konermann s,agarwala v,li y,fine ej,wu x,shalem o,cradick tj,marraffini la,bao g,zhang f.nat biotechnol.2013sep；31(9):827-32.doi:
10.1038/nbt.2647.epub2013jul 21)，尽量避免脱靶效应和缩短其长度等原则，选择了下列2个grna：osppo1 grna5-2:acatgaactagtaatgattgggg(top strand)；osppo1 grna8-3:agcagctggagttgaaaaacagg(bottomstrand)，其中有下划线的为pam序列。
[0258]
修复模板的设计：两个选定的靶向rna切割出来的dna片段大小为1212bp，而423和425位点距离很近，因此在设计修复模板时，左端同源臂为1127bp，右端同源臂为82bp，再加上为了从载体上切割修复模板在左右两端各加上切割靶点，修复模板总长1258bp(seq id no：49)。
[0259]
编辑载体：用水稻u3启动子分别表达osppo1 grna5-2和osppo1 grna8-3。因此，将这两个grna表达框与修复模板一起送到金斯瑞生物科技有限公司(南京)合成。用bsai酶对合成的两个grna的表达框和prgeb32(addgene#63142)骨架载体进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测后纯化回收，用t4dna ligase(neb，new england biolabs，boston，usa)进行连接转化，产生编辑载体。
[0260]
基因枪转化、筛选、分化、生根和土培苗：将上述构建的编辑载体经测序和用多种酶酶切验证后，与合成的修复模板dna一起用于基因枪介导的水稻转化。
[0261]
基因枪介导的水稻愈伤转化的具体方法：
[0262]
1.挑选优质的淮稻5号、金粳818种子，经过70％酒精和20％次氯酸钠溶液灭菌，无菌水冲洗干净后接种于愈伤诱导培养基。培养1周后去除胚芽，将剥离后的愈伤接种于愈伤诱导培养基。2周后继代处理，准备用于后续侵染。
[0263]
2.制备微弹及基因枪转化
[0264]
(1)制备金粉悬浮液：用1.5ml的进口ep管，称取30mg金粉(直径0.6μm)；加入1ml 70％的乙醇，充分涡旋，离心后弃上清；加入无菌水冲洗，重复操作3次。加入500μl灭菌甘油(50％)，充分涡旋，制成浓度为60μg/μl的金粉悬浮液，-20℃保存。
[0265]
(2)dna包裹：向1.5ml离心管中，依次加入25μl的金粉悬浮液(60μg/μl)、编辑载体与修复模板(1:10)、25μlcacl2(sigma)(2.5mol/l)和10μl的亚精胺(0.1mol/l)；将上述混合样品充分涡旋3-5min，冰上静置10min后，离心去上清；最终加入30μl无水乙醇重悬、定容。
[0266]
(3)基因枪轰击：清理超净台，酒精擦拭台面，调节仪器，按照操作说明进行轰击。调节轰击参数27真空度，1100psi，6cm。轰击后25℃，黑暗培养16h，将愈伤移至恢复培养基中，25℃，暗培养1周。
[0267]
(4)抗性愈伤组织的筛选与植株分化：愈伤移至筛选培养基中筛选，2周换一次培养基，筛选4周，取样检测是否发生目标替换。
[0268]
(5)将检测阳性的抗性愈伤转移至分化培养基，28℃，光照培养箱分化培养。
[0269]
待抗性愈伤诱导成水稻幼苗，提取转基因水稻基因组dna，以该dna为模板，进行pcr扩增检测，成功获得了同时置换水稻osppo1基因l423s/y425i位点的t0代水稻株系。为了进一步验证获得的t0代水稻苗对化合物a的耐受性，用含有9g/ha的化合物a处理水稻幼苗，与野生型株系相比，发生l423s/y425i位点同源置换的株系生长正常，而野生型株系处理3天后即枯死，如图11所示。说明经过对水稻osppo1基因l423s/y425i的突变，赋予了植物对除草剂化合物a的耐受性。收获种子后继续培育，经验证获得的t1及t2代水稻苗同样对化合物a具有耐受性，其中t2代水稻苗对化合物a的耐受性结果如表3所示。
[0270]
表3t2代水稻苗对化合物a的耐受性(土壤封闭处理，13daa)
[0271][0272]
注：0-无差异，1-轻微灼伤，2-明显灼伤，3-严重灼伤，4-轻微干枯，5-明显干枯，6-严重干枯，7-少数死亡，8-多数死亡，9-全部死亡。
[0273]
实施例10：在拟南芥中过表达其他作物ppo1中lllnyi蛋白基序突变对化合物a的耐受性
[0274]
为了在植物中快速验证不同作物ppo1中lllnyi蛋白基序突变对化合物a的耐受性，分别构建了水稻、玉米、大豆、油菜过表达野生型和突变型ppo1基因的载体。
[0275]
1、过表达载体的构建
[0276]
1)引物：根据选取的酶切位点以及基因本身的核苷酸序列，设计引物用于扩增野生型和突变型。设计的引物由北京擎科生物技术有限公司合成：
[0277][0278]
2)pcr扩增：利用合成的引物和q5dna聚合酶(neb，new england biolabs，boston，usa)扩增目的基因。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，按照tian quick midi purification kit操作说明，回收产物。回收完成后，用nanodrop检测提取的dna浓度。
[0279]
3)过表达载体构建：将经xbai和saci酶切后回收的ppo1片段和质粒phse401v，采用汉恒生物科技(上海)有限公司的hb-in fusiontm无缝克隆试剂盒构建过表达载体。经转化到感受态的e.coli dh5α，得到阳性克隆，再经测序验证和限制性内切酶酶切验证后，转化农杆菌待用。
[0280]
2、拟南芥蘸花转化
[0281]
1)播种：选取种粒饱满春化后的野生型拟南芥种子，用75％的酒精处理1min，10％naclo消毒6min，无菌水洗涤种子5-6次，灭菌处理后，种植于ms培养基平板上，待一周后移栽到灭菌处理后的营养土(营养土:蛭石＝1:1)中，于(25
±
2)℃温室内培养，光周期为16h/
8h(光/暗)。
[0282]
2)农杆菌的活化及制备：将低温保存的带有表达载体的农杆菌菌株，在含有卡拉霉素和利福平的抗性平板上划线，挑取单菌落接种于5ml的已加入对应抗生素的液体lb培养基中，28℃下250rpm振荡培养18-24h。然后相同条件下按照1:100接种扩大培养，总菌液体积为50ml，直到od600值在1.0-1.5范围内；
[0283]
3)侵染液的制备：将培养好的菌液6000rpm离心10min，弃去上清，用含有5％蔗糖的侵染液重新悬浮菌体至od600＝0.8左右，在菌液中加入0.02％-0.04％的silwetl-77混匀；
[0284]
4)拟南芥花序侵染：选取长势较好，花序茂盛的待侵染的拟南芥，在转化前用剪刀剪去植株上果荚，将拟南芥的花序在制备好的侵染液中蘸取0.5-1min。然后将侵染后的拟南芥苗放置于黑暗湿润的条件下24h，一周后重复侵染一次；
[0285]
5)转基因株系筛选
[0286]
将收取的蘸花转化后的拟南芥t0代种子播种于含有30mg/l的潮霉素的抗性ms平板上以筛选阳性植株。将筛选出来的阳性苗移至装有土壤的花盆中置温室进行培养，获得在拟南芥中过表达水稻osppo1 l423s/y425i和过表达osppo1 wt幼苗或事件；在拟南芥中过表达大豆gmppo1 l430s/y432i和过表达gmppo1 wt幼苗或事件；在拟南芥中过表达油菜bnppo1-c5 l424s/y426i和过表达bnppo1-c5 wt幼苗或事件；在拟南芥中分别过表达玉米zmppo1 l424t/y426v、zmppo1 l424s/y426v、zmppo1 l424v/y426l、zmppo1 l424w/y426l、zmppo1 l424s/y426i和过表达zmppo1 wt幼苗或事件。
[0287]
3、除草剂抗性测试
[0288]
将获得的不同作物过表达突变型和野生型的拟南芥种子在含有不同浓度ppo抑制剂类除草剂化合物的ms培养基(培养皿)上面进行抗性测试，如图12-23所示，与野生型的拟南芥相比，过表达不同作物ppo1中lllnyi蛋白基序突变和过表达ppo1 wt后都对所述化合物具有一定的耐受性/抗性，两者在50nm处理浓度下抗性水平相近，但在更高施药浓度2um下，过表达不同作物ppo1中lllnyi蛋白基序突变仍表现抗性，而过表达不同作物ppo1 wt与野生型拟南芥对照无差异，说明在不同作物中过表达lllnyi蛋白基序突变后对ppo抑制剂类除草剂化合物的耐受性水平更高。
[0289]
实施例11：过表达水稻osppo1 l423s/y425i突变体获得除草剂抗性
[0290]
为了在植物体中进一步测试获得的突变体对除草剂的耐受性，对水稻中筛选出来的l423s/y425i突变体在水稻中进行过表达。
[0291]
1、过表达载体的构建
[0292]
1)引物：根据选取的酶切位点以及基因本身的核苷酸序列，设计引物用于扩增l423s/y425i突变型。设计的引物由北京擎科生物技术有限公司合成：
[0293]
ppo1-f:gccagtgccaagctctgcagattcgggtcaaggcgga；
[0294]
ppo1-r:acatgattacgaattctctagtaacatagatgacaccgcgc
[0295]
2)pcr扩增：利用合成的引物和q5dna聚合酶(neb，new england biolabs，boston，usa)扩增目的基因。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，按照tian quick midi purification kit操作说明，回收产物。回收完成后，用nanodrop检测提取的dna浓度。
[0296]
3)水稻过表达载体构建：将经kpni和hind iii酶切后回收的ppo1片段和质粒
pcambia1301，采用汉恒生物科技(上海)有限公司的hb-in fusiontm无缝克隆试剂盒构建水稻过表达载体pcambia1301-osppo1 l423s/y425i。经转化到感受态的e.coli dh5α，得到阳性克隆，再经测序验证和限制性内切酶酶切验证后，转化农杆菌。
[0297]
2、水稻愈伤的农杆菌转化和转基因事件产生：
[0298]
1)吸取水稻过表达载体pcambia1301-osppo1 l423s/y425i和pcambia1301-osppo1 wt载体质粒100ng分别加入到农杆菌eha105感受态中，放在冰上5分钟，浸入液态氮中速冻5分钟，捞出放在37℃下5分钟，最后放置在冰上5分钟。加入500μl yeb液体培养基(无抗生素)，置于28℃、200转/分摇床中培养2～3h；用3500转/分离心收集菌体，将收集的菌体涂布于yeb(卡拉霉素+利福平)平板上，28℃培养箱培养2天；挑取单克隆至液体培养基培养，-80℃保菌。
[0299]
2)农杆菌的培养：挑取转化后的农杆菌单克隆，yeb液体培养基(卡拉霉素+利福平)中28℃振荡培养至od600为0.5，3500转/分收集菌落，等量aam(1ml aam+1μl 1000
×
as)液体培养基稀释后侵染愈伤组织。
[0300]
3)诱导水稻淮稻5号愈伤组织：在准备农杆菌之前，先要准备水稻愈伤。剥取水稻种子，无菌水清洗种子，直至洗后的水变清澈，不限次数，70％酒精消毒30秒，之后5％次氯酸钠置于水平摇床摇晃培养20分钟，次氯酸钠消毒后无菌水清洗5次，置于无菌吸水纸，风干种子表面水分，接种于诱导培养基上在28℃下培养愈伤。
[0301]
4)农杆菌侵染水稻愈伤：选取继代培养10天，直径为3mm的淮稻5号愈伤组织，将愈伤组织收集至50ml的离心管中；将已调至浓度的农杆菌菌液倒入含有愈伤组织的离心管中，置于28℃、200转/分摇床中侵染20分钟；侵染完毕，倒掉菌液，将愈伤组织放置于无菌滤纸上风干20min左右，置于共同培养基平板上共同培养，平板上铺有一张aam(1ml aam+30μl 1000
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as)液体培养基浸湿的无菌滤纸；侵染3天后，清洗去除农杆菌(先用无菌水洗5遍，再用500mg/l的头孢抗生素清洗20分钟)，置于50mg/l潮霉素筛选培养基上筛选培养。
[0302]
5)抗性愈伤的筛选、分化和生根：将共培养后的愈伤组织移至筛选培养基进行第一轮筛选(2周)；第一轮筛选完毕后将新长出的愈伤移至筛选培养基(含50mg/l潮霉素)进行第二轮筛选(2周)；筛选完成后，挑取生长状态良好的黄白色愈伤组织进行分化，3～4周后可以获得1cm左右的幼苗；将分化出的幼苗移至生根培养基进行生根培养；将生根完成的幼苗进行炼苗处理后，移至装有土壤的花盆中置温室进行培养；获得过表达osppo1 l423s/y425i和过表达osppo1 wt幼苗或事件。
[0303]
3、转基因苗(t0代)除草剂抗性检测：对移栽在花盆里面的过表达水稻osppo1 l423s/y425i和osppo1 wt的t0代水稻苗喷施不同浓度的化合物a进行抗性测试。如图24所示，与野生型的淮稻5号相比，过表达水稻osppo1 l423s/y425i和过表达osppo1 wt后都对化合物a具有一定的耐受性/抗性，两者在45g/ha施药浓度抗性水平相近，但在更高施药浓度如135g/ha和270g/ha下，过表达osppo1 l423s/y425i仍表现抗性，而过表达osppo1 wt与野生型对照无差异，说明过表达osppo1 l423s/y425i后水稻对化合物a的耐受性水平更高。
[0304]
同时经过很多测试发现，将本发明所述相应抗性位点或组合转基因或基因编辑到其他植物中也同样具有对ppo抑制剂类除草剂的耐受性，具有良好的产业价值。
[0305]
说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，如同每篇出版物或专利申请被单独、特别地通过引用并入本文一样。
[0306]
尽管为清楚理解起见，前述发明已通过举例说明和实施例的方式较为详细地进行了描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求书的范围内实施某些改变和修改，这样的改变和修改均在本发明的范围之内。