gp96-RBD融合蛋白及其相关生物材料在活化长效浆细胞中的应用

本发明属于生物，具体涉及gp96-rbd融合蛋白及其相关生物材料在活化长效浆细胞中的应用。

背景技术：

1、

2、毫无疑问，疫苗免疫依旧是预防病毒感染的最有效手段。但是无论是针对新型冠状病毒的疫苗还是流感病毒疫苗都存在抗体维持时间短，不能对机体建立长效保护的问题。目前大部分疫苗以体液免疫反应为主，抗体的水平及维持时间与抗感染的效果及疫情的控制程度具有直接的相关性。因此，提高疫苗免疫的抗体水平及维持时间，对流行病的防控具有重要的现实意义。

3、b细胞是机体特异性体液免疫反应中的主要免疫活性细胞，b淋巴细胞到浆细胞的终末分化，是机体能否产生获得性免疫的关键步骤。浆细胞产生的抗体可以帮助清除病原体，依据抗体分泌细胞(ascs)寿命可分为短寿命浆细胞和长寿命浆细胞。短寿命浆细胞主要在免疫早期时相中产生；长寿命浆细胞，产生于后期时相中的生发中心，此类浆细胞可进入骨髓，并参与全身循环。长寿命浆细胞可持续、长期分泌抗体，并从凋亡途径中逃脱，为“专职长寿抗体分泌细胞”。长寿命浆细胞能产生保护性记忆参与长期免疫，如抗天花疫苗的特异性抗体可存在60年，gatto等发现，大约有10％长寿命浆细胞在小鼠体内可存活一生。目前尚未有关于可以活化长寿浆细胞方法的报道，因此研究可活化长效浆细胞的方法具有重要的社会和经济意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何活化长寿浆细胞。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种融合蛋白。

3、本发明提供的融合蛋白的名称为gp96-rbd，所述gp96-rbd融合蛋白为如下(1) 或(2)：

4、(1)由蛋白质gp96和蛋白质rbd融合得到的融合蛋白：

5、所述蛋白质gp96为如下a1)或a2)所示的蛋白质：

6、a1)氨基酸序列是seq id no.3所示的蛋白质；

7、a2)将a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；

8、所述蛋白质rbd为如下b1)或b2)所示的蛋白质：

9、b1)氨基酸序列是seq id no.5所示的蛋白质；

10、b2)将b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；

11、(2)在(1)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签得到的具有相同功能的融合蛋白。

12、上述融合蛋白中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

13、所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

14、进一步的，所述蛋白质gp96和所述蛋白质rbd之间还包括连接肽。在本发明的一个具体实施例中，所述连接肽为柔性(ggggs)linker，其氨基酸序列如seq id no.1 第231-240位所示。

15、更进一步的，所述融合蛋白为氨基酸序列是seq id no.1所示的蛋白质。

16、上述任一所述融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。所述融合蛋白的编码基因可通过将seq id no.2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。

17、为了解决上述技术问题，本发明又提供了编码上述gp96-rbd融合蛋白的核酸分子。

18、所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

19、1)其编码序列是seq id no.2所示的dna分子；

20、2)在严格条件下与1)限定的dna分子杂交且编码上述gp96-rbd融合蛋白的dna 分子；

21、3)与1)或2)限定的dna分子具有90％以上的同一性且编码上述gp96-rbd融合蛋白的dna分子。

22、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

23、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码gp96-rbd融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码gp96-rbd融合蛋白的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码 gp96-rbd融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

24、所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

25、所述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码seq id no.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

26、为了解决上述技术问题，本发明还提供了下述s1)-s3)中的任一种生物材料：

27、s1)含有上述核酸分子的表达盒；

28、s2)含有上述核酸分子或上述表达盒的重组载体；

29、s3)含有上述核酸分子或上述表达盒或上述重组载体的重组细胞。

30、上述生物材料中，s1)所述的含有上述核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述gp96-rbd融合蛋白的dna，该dna不但可包括启动编码上述gp96-rbd融合蛋白的基因转录的启动子，还可包括终止编码上述gp96-rbd融合蛋白的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

31、上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明的一个具体实施例中，所述重组载体将seq id no.2所示的dna分子插入表达载体 pfastbactm 1的bamhi和xbai酶切位点间，且保持表达载体pfastbactm 1的其它序列不变后得到的载体。

32、上述生物材料中，所述细胞可为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。在本发明的一个具体实施例中，所述重组细胞为含有上述重组载体的昆虫细胞。

33、为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备上述gp96-rbd融合蛋白的方法。

34、本发明提供的制备上述gp96-rbd融合蛋白的方法包括如下步骤：使上述gp96-rbd融合蛋白的编码基因在生物或生物细胞中进行表达，得到所述gp96-rbd融合蛋白。

35、进一步的，使上述gp96-rbd融合蛋白的编码基因在生物或生物细胞中进行表达的方法包括如下步骤：将上述gp96-rbd融合蛋白的编码基因导入生物或生物细胞中。

36、所述生物细胞可为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。所述非人动物细胞可为哺乳动物细胞或昆虫细胞。在本发明的一个具体实施例中，所述生物细胞具体可为昆虫细胞(如sf9细胞)。

37、所述融合蛋白的编码基因为seq id no.2所示的dna分子。

38、再进一步的，所述gp96-rbd融合蛋白的编码基因通过重组昆虫病毒表达载体或重组昆虫病毒导入生物或生物细胞中。

39、所述重组昆虫病毒表达载体为可在细菌和昆虫细胞之间转移和扩增的病毒穿梭质粒。具体的，所述病毒穿梭质粒为杆状病毒穿梭质粒。在本发明的一个具体实施例中，所述重组昆虫病毒表达载体为将seq id no.2所示的dna分子插入表达载体 pfastbactm 1的bamhi和xbai酶切位点间，且保持表达载体pfastbactm 1的其它序列不变后得到的载体。

40、所述重组昆虫病毒是通过所述重组昆虫病毒表达载体在昆虫细胞中表达或传代得到的。

41、更进一步的，所述方法可包括如下步骤：

42、1)将上述重组昆虫病毒表达载体转染sf9细胞，孵育，离心，收集上清液，该上清液即为p1代病毒；

43、2)完成步骤1)后，向sf9细胞悬浮培养液中加入所述p1代病毒，孵育，离心，收集上清液，该上清液即为p2代病毒；

44、3)完成步骤2)后，向sf9细胞悬浮液中加入所述p2代病毒，培养，离心，收集上清液，该上清液即为p3代病毒，p3代病毒中含有gp96-rbd融合蛋白。

45、上述步骤1)中，每1×106个sf9细胞可转染4μg重组昆虫病毒表达载体。所述孵育的条件可为27℃孵育72h。所述离心的条件可为4000rpm离心5min。

46、上述步骤2)中，所述sf9细胞悬浮培养液可为将含1×108个sf9细胞的sf9细胞悬浮液在27℃培养8～10h后得到的培养液。所述p1代病毒的剂量可为0.05～0.1 moi。所述孵育的条件可为27℃孵育72h。所述离心的条件可为4000rpm离心5min。

47、上述步骤3)中，所述sf9细胞悬浮液可含1.6×108个sf9细胞。所述p2代病毒的剂量可为0.05～0.1moi。所述培养的条件可为27℃、100～120rpm培养72h。所述离心的条件可为4000rpm离心5min。

48、所述步骤3)后还包括纯化的步骤。所述纯化的方法可包括如下步骤：

49、a、向sf9细胞悬浮液中加入所述p3代病毒，培养，获得悬浮液；

50、b、完成步骤a后，取所述悬浮液，离心，获得上清液；

51、c、完成步骤b后，取所述上清液，经滤膜过滤，获得上样液；

52、d、完成步骤d后，将所述上样液上样于ni亲和层析柱，然后用不含咪唑的 tris-hcl缓冲液冲洗，再用含有咪唑的tris-hcl缓冲液洗脱，获得洗脱液；

53、e、完成步骤d后，将所述洗脱液用超滤管进行超滤换液，获得置换液；

54、f、完成步骤e后，将所述置换液上样于q离子交换柱，先用ph7.5、200mm的pbs 缓冲液冲洗；然后用ph7.5、300mm的pbs缓冲液冲洗；再用ph7.5、600mm的pbs缓冲液冲洗，最后收集过柱后溶液并采用超滤管进行超滤浓缩，得到浓缩液，该浓缩液即为纯化后的重组融合蛋白gp96-rbd溶液。

55、所述步骤a中，所述sf9细胞悬浮液可含4.5×108个sf9细胞。所述p3代病毒的剂量可为5moi。所述培养的条件可为27℃、100～120rpm培养72h。

56、所述步骤b中，所述离心的条件可为7000rpm离心20min。

57、所述步骤c中，所述滤膜可为0.22mm滤膜。

58、所述步骤d中，所述ni柱亲和层析可为histrap hp亲和层析柱。上样流速控制可为1ml/min。

59、所述步骤e中，所述超滤管可为截留分子量为50kd的超滤管。

60、所述步骤f中，所述q离子交换柱可为hitrap-q sepharose离子交换层析柱。上样流速可为1ml/min。所述超滤管可为截留分子量为50kd的超滤管。

61、为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述gp96-rbd融合蛋白或上述核酸分子或上述生物材料的新用途。

62、本发明提供了上述gp96-rbd融合蛋白或上述核酸分子或上述生物材料在如下t1)-t8)中任一种中的应用：

63、t1)制备活化长效浆细胞的产品；

64、t2)制备提高机体长寿浆细胞水平(增加机体长寿浆细胞数量)的产品；

65、t3)制备提高机体抗体分泌水平和/或抗体维持时间的产品；

66、t4)制备预防和/或治疗新冠病毒感染的产品；

67、t5)活化长效浆细胞；

68、t6)提高机体长寿浆细胞水平(增加机体长寿浆细胞数量)；

69、t7)提高机体抗体分泌水平和/或抗体维持时间；

70、t8)预防和/或治疗新冠病毒感染。

71、为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种具有如下x1)-x4)任一所述功能的产品：

72、x1)活化长效浆细胞；

73、x2)提高机体长寿浆细胞水平(增加机体长寿浆细胞数量)；

74、x3)提高机体抗体分泌水平和/或抗体维持时间；

75、x4)预防和/或治疗新冠病毒感染。

76、本发明提供的产品的活性成分为上述gp96-rbd融合蛋白或上述核酸分子或上述生物材料。

77、上述任一所述应用或产品中，所述抗体为新冠病毒rbd抗体。

78、上述任一所述应用或产品中，所述机体为哺乳动物机体。所述哺乳动物包括人、鼠。

79、上述任一所述应用或产品中，所述gp96-rbd融合蛋白可通过皮下注射方式进行施用，所述施用对象可为哺乳动物；所述哺乳动物包括人、鼠。所述鼠具体可为雌性 balb/c小鼠。每只小鼠注射剂量可为10μg-50μg，优选40μg。

80、上述任一所述应用或产品中，所述产品可为药物。

81、本发明将人热休克蛋白gp96的编码基因5’端通过柔性linker与新冠病毒s蛋白rbd的编码基因融合得到gp96-rbd编码基因，并将其导入昆虫细胞中进行高效表达，得到gp96-rbd融合蛋白。本发明通过实验证明，本发明制备的gp96-rbd融合蛋白具有提高机体抗体表达水平和长寿浆细胞水平的功能。本发明的热休克蛋白gp96与病毒蛋白的受体结合区域的gp96-rbd融合蛋白对于预防病毒感染，建立长效保护功能具有重要的应用价值。