一种与鸡肉垂厚相关的分子标记及其应用

1.本发明涉及生物基因技术领域，特别是涉及一种与鸡肉垂厚相关的分子标记及其应用。


背景技术：

2.禽类的性成熟受到下丘脑-垂体-性腺轴的高度调控，垂体分泌的促卵泡素能促进精细管的生长发育和精子生成；促黄体素则刺激睾丸的间质细胞分泌雄激素，并间接地有助于精子的形成。随着睾丸分泌雄激素进而刺激公禽出现第二性征。家禽的第二性征是繁殖性状的间接表征，因而可通过对第二性征的间接选择加快品种繁殖性能的选育进展。优质鸡公鸡一般在20-30日龄鸡冠开始发育，颜色变红、鸡冠面积变大，鸡冠变厚，肉垂的颜色、大小、长度与厚度也相应的发生变化(张德祥等，2013)，这些性状可以间接反映公鸡雄性化发育的程度。张德祥等(2013)研究发现睾丸重与肉垂发育的相关程度要高于鸡冠，肉垂发育的遗传力估计值为中等偏上程度(0.184-0.626)，变异系数也大(11.80％-59.87％)，可作为选择睾丸重的间接选种指标。梁远东等(2008)以良凤花肉用型父母代种公鸡为实验素材发现肉垂长的公鸡，睾丸也相对大些，认为肉垂大小可作为衡量公鸡性腺发育的依据及选择目标。周敏等(2019)分析了本实验群体不同周龄肉垂厚的变异系数，发现变异系数也较大(15.40％-22.00％)，与16w睾丸重呈极显著正相关(p《0.01)，肉垂厚在12周龄前都是影响16周龄睾丸重的主要因素之一，12周龄前是肉垂厚发育的快速时期。近几年来有关鸡性早熟性状选育大多是通过世代选育的方法不断从后备鸡群中选择早熟个体，建立核心群后扩繁和选育，这种方法比较缓慢且稳定性较差。目前对性早熟的研究主要集中在母鸡中，对于公鸡性早熟的研究还未见报道。随着分子遗传标记辅助选择在育种中的应用，候选基因法是家鸡进行性早熟分子选育行之有效、易于操作的方法。
3.抑制素(inhibin，inh)是一种由卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞分泌的二聚体糖蛋白激素，属于转化生长因子β超家族成员，最基本的生物学作用是抑制促卵泡激素合成和分泌，并可通过复杂的反馈机制，调节体液促卵泡激素水平，还可通过局部作用，调节卵巢内卵泡的发育。抑制素是由α和β两个不同的亚单位通过二硫键结合在一起，α单位上有糖基化位点，β单位有a、b两种类型，抑制素有抑制素a(αβa)和抑制素b(αβb)，分离的α和β亚单位均无生物活性(马勇江等，2000；李晓丽等，2003)。inha基因目前在鸡上的研究主要集中在该基因多态性及其与母鸡繁殖性能如300日龄产蛋量、出雏体重、开产体质量、开产日龄、开产冠高、开产胫长、70日龄体重、98日龄体重/冠高、冠长等方面(金恒，2016；桂涛涛等，2018；cui等，2019；范迪等，2020)以及卵巢发育(lovell等，2003；cui等，2019；cui等，2020；wasti等，2020；cui等，2021；francoeur等，2021)。金恒(2016)发现该位点与母鸡21日龄体重、70日龄体重、98日龄体重以及330日龄产蛋数显著相关(p《0.05)，但inha基因与地方鸡种公禽肉垂性状的相关性还未见有报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种与鸡肉垂厚相关的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明以inha基因内含子1上c22056470t位点为候选标记检测该位点在地方鸡种宁都黄公鸡中的多态性并分析其与不同周龄肉垂厚的关系，以便为地方鸡种品种选育及标记辅助选择提供依据。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种与鸡肉垂厚相关的分子标记，所述分子标记如附图1所示。
7.进一步地，附图1所示的序列的c22056470t位点处存在c/t的碱基突变，出现cc、ct或tt的基因分型。
8.本发明还提供一种检测如上所述的与鸡肉垂厚相关的分子标记的引物对，其核苷酸序列如seq id no.3-4或seq id no.5-6所示。
9.本发明还提供一种试剂盒，包括如上所述的引物对。
10.本发明还提供一种检测如上所述的与鸡肉垂厚相关的分子标记的方法，包括以下步骤：
11.(1)提取待检测鸡的基因组dna；
12.(2)利用权利要求3所述的引物对进行pcr扩增，获取扩增产物；
13.(3)当步骤(2)使用如seq id no.3-4所示引物时，对所得的扩增产物进行测序，获得分子标记的基因型；
14.当步骤(2)使用如seq id no.5-6所示引物时，对所得的扩增产物进行凝胶电泳，根据带型判定基因型；
15.(4)根据基因分型结果判断所述待测鸡的肉垂性状。
16.本发明还提供一种如上所述的分子标记、如上所述的引物对、或如上所述的试剂盒在检测鸡肉垂厚相关性状中的应用。
17.本发明还提供一种如上所述的分子标记、如上所述的引物对、或如上所述的试剂盒在鸡育种中的应用。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.本发明提供一种与鸡肉垂厚相关的分子标记，该分子标记是以位于鸡inha基因内含子1上c22056470t位点为检测位点，分析该位点多态性与鸡肉垂厚性状的相关性，通过实验发现，该位点的等位基因t有利于鸡肉垂厚的发育。这为通过鸡肉垂厚性状进行鸡种选育及分子标记辅助选择提供了理论基础和参考数据。利用本发明分子标记构建的检测方法，相对于传统的通过表型数据选育，不仅成本低、操作简便，而且结果准确，并且该方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为inha基因引物inha-i1f-1/inha-i1r-1扩增的pcr产物测序结果；
22.图2为inha基因引物inha-i1f-1/inha-i1r-1扩增的pcr序列在ncbi比对的结果；
23.图3为inha基因引物inha-i1f-1/inha-i1r-1扩增的pcr序列在ucsc鸡基因组比对的结果；
24.图4为c22056470t位点在鸡7号染色体上的位置，其中，加粗大写字母表示c22056470t位点，黑色大写字母表示比对的序列，小写字母表示比对序列上下游的序列；
25.图5为inha基因c22056470t位点不同基因型测序图，其中，阴影部分为c22056470t位点；
26.图6为inha基因引物inha-i1f-2/inha-i1r-2的pcr产物检测结果，其中，m为dl2000 marker，1-6为pcr产物；
27.图7为inha基因c22056470t位点不同基因型电泳图。
具体实施方式
28.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
29.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
30.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
31.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
32.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
33.实施例1
34.1 材料与方法
35.1.1 试验材料、指标测定及样品采集
36.试验鸡群由江西南师科技有限公司提供，饲养时间为2018年4月-2018年8月，鸡苗数为700羽，饲养模式为种公鸡笼养模式，按照肉种鸡常规免疫程序进行统一免疫，其它均按照常规方法进行饲养管理。在出生第一天戴上翅号，第5周戴上脚号。试验分别在6、8、10、12、14、16周龄进行全群肉垂厚指标测定，去除死亡、逃逸、以及明显错误与重复数据，最后得到的试验公鸡499只。指标测定参照ny/t 823—2004《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》规定的方法。在翅下静脉采血1～2ml，用2％edta抗凝，-20℃保存备用。所采血样用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组dna，并稀释成100ng/μl备用。
37.1.2 引物设计与合成
38.为了筛选内含子1上的snp位点，从ncbi上下载鸡inha基因组序列(genbank登录号：nm_001031257.2)，应用genetool软件设计上下游引物，扩增包含全部内含子1上下游750bp的序列，引物名称与序列分别为：
39.inha-i1f-1(seq id no.3):5'-gcagggaggtgacgtgggagagt-3'，
40.inha-i1r-1(seq id no.4):5'-ggccgagtggttgggagcag-3'。
41.模板是从499只群体中随机抽取20只个体的基因组dna。引物由湖南擎科生物有限公司合成。
42.设计引物扩增inha基因内含子1上的c22056470t位点上下游492bp片段，引物名称与序列分别为：
43.inha-i1f-2(seq id no.5):5'-cagggatggggccgcagaag-3'，
44.inha-i1r-2(seq id no.6):5'-ccgagggctggaagaggtaagt-3'。
45.模板是499只宁都黄公鸡的基因组dna。引物由湖南擎科生物有限公司合成。
46.以引物inha-i1f-1/inha-i1r-1进行pcr扩增，pcr反应体系为(50μl)：2
×
pcr mix 25μl，上下游引物各0.4μl，dna模板1.0μl，ddh2o 23.2μl。pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；后延伸72℃10min。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小是否符合预期。检测后的pcr产物送往湖南擎科生物有限公司利用上游引物进行直接测序，根据每个个体测序结果判定基因型。
47.以引物inha-i1f-2/inha-i1r-2进行pcr扩增，pcr反应体系为(10μl)：2
×
pcr mix 5μl，上下游引物各0.2μl，dna模板0.6μl，ddh2o 4μl。pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；后延伸72℃7min。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小是否符合预期。检测后的pcr产物使用rflp分型。酶切反应体系为：pcr产物6.5μl，内切酶pst i 0.3μl，10
×
buffer缓冲液1.0μl，ddh2o 2.2μl，37℃恒温箱放置过夜。2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。凝胶成像系统拍照，根据带型判定基因型。
48.1.3统计分析
49.由于所观察群体拥有相同的遗传背景，均为16w公鸡，且在饲养标准相同条件下饲养，所以标记与肉垂厚性状间的关联分析采用sas 9.0glm程序进行统计分析，构建模型如下：y
ij
＝μ+gi+e
ij
。其中y
ij
为性状表型值，μ为该性状的总体均值，gi为基因型效应值，e
ij
为随机残差效应。
50.2 结果与分析
51.2.1 引物inha-i1f-1/inha-i1r-1的pcr产物检测结果
52.引物inha-i1f-1/inha-i1r-1扩增的pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测发现在750bp处有清晰的单一条带，与预期片段大小一致。检测后的pcr产物直接测序，测序序列见图1(seq id no.1)，除掉5’端与3’端测序结果较差的部分，得到了675bp序列。将得到的序列经https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi进行比对，进一步验证得到的序列是否为inha基因的序列，比对结果见图2，从图中可看出测序得到的序列为inha基因的部分序列。进一步将测序获得的序列在http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgblat进行基因组的比对，结果见图3，这段序列在鸡基因组7号染色体的位置见图4。通过lasergene 7.1软件包中的megalign程序分析了20个个体的pcr产物测序结果，发现在基因组7号染色体22056470
位置处存在psti内切酶的t
→
c的多态位点(图5)。
53.seq id no.1：
54.ccagggagatggggagggctgaggagcgggcagagcaggacactggagtgggatggtagagaatggggcagggtgctgggaatgggatgctaagtgatgggttacgatgctgaaggatggagtgggatacccagggatggggccgcagaaggatgctcagggttgcaacaggatactcggggttgcagcatagtgcaggaggacagagcaggacacagtggaatgggtacaccagaccatcccggggcatggaggggcttggtgacctcactaggcagctcagccaagcccggccatatgaagaaggtggctgaatcccacagccccaagaccgtggggtgccaggtgccgcagctgtgcctggctggcagcacaagccaggcagagccttgcgcagggctggatctgctgcagggtttggctgcaggacacagcagcaggtgctgcgtggcactggatgtcgtcagctcctgtgtctccccccataccctatccccacagtggggcacaacaccctgagccactctttccccacagacgtgccgggcgagcccacgcagccagacaagctgctggaggaagaaggcatcttcacttacctcttccagccctcggcgcacgccctgagccgcacgctgacatccgcccagctctggttctacagcggcccctcgg
55.seq id no.2：
[0056][0057][0058]
2.2 引物inha-i1f-2/inha-i1r-2的pcr产物检测结果
[0059]
inha基因引物inha-i1f-2/inha-i1r-2扩增的pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测见图6，在492bp处有清晰的单一条带，与预期片段大小一致。
[0060]
2.3 inha基因c22056470t位点的基因型检测
[0061]
499只宁都黄公鸡inha基因c22056470t位点pcr产物经psti酶切，电泳检测酶切产物发现了3种基因型，分别为cc(492bp)、ct(288bp+204bp+492bp)和tt(288bp+204bp)(图7)。
[0062]
2.4 inha基因c22056470t位点与宁都黄公鸡不同周龄肉垂厚的相关性
[0063]
inha基因内含子1中c22056470t位点不同基因型与不同周龄肉垂厚性状的相关性见表1。从表1可以看出，在所测定的6个肉垂厚性状中，6w-12w不同基因型间存在显著差异(p《0.05)或极显著差异(p《0.01)，tt型个体的肉垂显著(p《0.05)或极显著(p《0.01)厚于ct型与cc型个体；该位点与14w与16w的肉垂厚差异不显著(p》0.05)。
[0064]
表1位点rs16492031基因型与笼养宁都黄公鸡肉垂厚性状的相关性
[0065][0066]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。