抗MUC16抗体及其应用的制作方法

抗muc16抗体及其应用
1.本技术是申请号为201680028517.9(申请日：2016年3月16日，发明 名称：抗muc16抗体及其应用)的中国专利申请的分案申请。
2.本技术要求2015年3月17日提交的美国临时申请号62/134,402的权 益，其在此全文引入作为参考。
3.本技术参考引入了作为文本文件与申请一同提交的名称为“序列 _listing_13542-016-228.txt”的序列表，其创建于2016年3月14日，大小 375kb。
1.技术领域
4.本文提供了涉及抗体的组合物、方法和用途，所述抗体免疫特异性结 合muc16(一种拴粘蛋白(tethered mucin protein))并调节muc16的表达和/ 或活性用于管理、治疗或预防疾病，例如癌症。
5.2.背景
6.粘蛋白是用于细胞稳态和保护上皮表面的重要生物分子。卵巢癌中粘 蛋白表达的变化可能被用于诊断，预后和治疗(singh ap等，lancet oncol2008；9(11)：1076-85)。muc16是一种在大多数卵巢癌中过表达的粘蛋白， 是用于卵巢癌检测和进展的已知替代血清标志物(ca-125)(badgwell d等， dis markers 2007；23(5-6)：397410；bast rc，jr等，int j gynecol cancer2005；15suppl 3：274-81；fritsche ha等，clin chem 1998；44(7)：1379-80 和krivak tc等，gynecol oncol 2009；115(1)：81-5)。muc16是由大的 切割和释放结构域组成的高度糖基化的粘蛋白，称为ca-125，由多个重复 序列和一个保留结构域(muc-cd)组成，后者包括残留的非重复细胞外片 段、跨膜结构域和细胞质尾(o'brien tj等，tumor biol 2001；22(6)：348-66)。 由于抗原只能在子宫、子宫内膜、输卵管、卵巢和腹腔和胸腔的浆膜中以 低水平表达，因此muc16是基于免疫的治疗的潜在吸引力的靶标。
7.然而，muc16的大多数细胞外结构域被切割和分泌的事实限制了 muc16作为靶向抗原在卵巢癌中的应用。事实上，迄今为止，大多数报 道的muc16单克隆抗体结合存在于糖蛋白的大分泌型ca-125部分上的表 位，没有已知与抗原的保留的细胞外部分(muc-cd)结合(bellone s，amj obstet gynecol 2009；200(1)：75 el-10，berek js，expert opin biol ther2004；4(7)：1159-65；o'brien tj等，int j biol markers 1998；13(4)：188-95)。 因此，诊断和治疗方法需要产生针对muc16的非脱落区域的新抗体。
8.3.概述
9.本文提供了抗体及其抗原结合片段和包括该抗体或抗原结合片段的多 肽，例如融合蛋白、缀合物、和/或嵌合抗原受体，以及表达其的细胞。抗 体和抗原结合片段中是那些特异性结合muc16蛋白表位的。该抗体在本文 中称为“muc16糖基化抗体”。该表位典型的是位于或基本位于muc16分 子胞外部分之内的表位，在一些实施方案中，表位不在muc16串联重复区 域和/或分泌形式的muc16之内，或抗体或片段不结合muc16串联重复区 域和/或分泌形式的muc16。在一些实施方案中，表位位于muc16c114之 内或包括muc16c114之内的残基并典型的包括其中的一个或多个糖基化 残基或糖基化位点。在一些实施方案中，表位
no:108)，其 中x6是g或s且其中x7是h或y；x
13
lex
14
pl(seq id no:114)，其中 x
13
是g或s且其中x
14
是h或y；mqsleyplt(seq id no:120)，选 自下述的序列：seq id nos：8，28，48，68和88；选自下述的序列：seqid nos：14，34，54，74和94和选自下述的序列：seq id nos：20，4， 60，80和100。
14.在一些实施方案中，包括任一前述实施方案，提供的抗体或抗原结合 片段包括，例如，进一步包括，具有对应本文提供的轻链序列之一的lcdr1 的序列的轻链cdr1(lcdr1)，例如命名为18c6的抗体、命名为10c6的 抗体、命名为19c11的抗体和/或命名为7b12的抗体的轻链序列。在一些 方面，lcdr1具有选自下述的序列：rsskslx4x5sngntyly(seq idno:106)；skslx
11
x
12
sngnty(seq id no:112)，其中x
11
是l或r且其 中x
12
是h或k；kslx
19
x
20
sngnty(seq id no:118)，其中x
19
是v或 l且其中x
20
是h或k；选自下述的序列：seq id nos：6，26，46，66 和86；选自下述的序列：seq id nos：12，32，52，72和92和选自下述 的序列：seq id nos：18，38，58，78和98。
15.在一些实施方案中，包括任一前述实施方案，提供的抗体或抗原结合 片段包括，例如，进一步包括，具有对应本文提供的轻链序列之一的lcdr2 的序列的轻链cdr2(lcdr2)，例如命名为18c6的抗体、命名为10c6的 抗体、命名为19c11的抗体和/或命名为7b12的抗体的轻链序列。在一些 方面，lcdr2具有选自下述的序列：ymsnlas(seq id no:107)；yms (seq id no:113)和seq id nos：7，27，47，67，87，13，33，53，73， 93，19，39，59，79，99，119任一所示的序列。
16.在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：(a)vh互补 决定区(cdr)1，包含氨基酸序列tx1gmgvg(seq id no:103)，其中x1是l或v；(b)vh cdr2，包含氨基酸序列hiwwddx2dkyyx3palks (seq id no:104)，其中x2是e或不存在且x3是y或n；和(c)vh cdr3， 包含氨基酸序列igtaqatdaldy(seq id no:105)。
17.在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：(a)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx8tx9gm(seq id no:109)，其中x8是n或 s且其中x9是l或v；(b)vh cdr2，包含氨基酸序列wddx
10
(seq idno:110)，其中x
10
是e或不存在；和(c)vh cdr3，包含氨基酸序列 gtaqatdald(seq id no:111)。
18.在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：(a)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx
15
tx
16
gmg(seq id no:115)，其中x
15
是 n或s且x
16
是v或l；(b)vh cdr2，包含氨基酸序列iwwddx
17
dk(seqid no:116)，其中x
17
是e或不存在；和(c)vh cdr3，包含氨基酸序列 x
18
rigtaqatdaldy(seq id no:117)，其中x
18
是t，a或s。
19.在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：vh cdr1， 包含seq id no:3的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:4的氨基酸 序列；和vh cdr3，包含seq id no:5的氨基酸序列；vh cdr1，包含 seq id no:9的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:10的氨基酸序 列；和vh cdr3，包含seq id no:11的氨基酸序列；vh cdr1，包含 seq id no:15的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:16的氨基酸序 列；和vh cdr3，包含seq id no:17的氨基酸序列；vh cdr1，包含 seq id no:23的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:24的氨基酸序 列；和vh cdr3，包含seq id no:25的氨基酸序列；vh cdr1，包含 seq id no:29的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:30的氨基酸序 列；和vh cdr3，包含seq id no:31的氨基酸序列；包含下述的vh： vh cdr1，包含seq id no:35的氨基酸序列；vh cdr2，
cdr1， 包含seq id no:98的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq id no:99的氨基 酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:100的氨基酸序列；或vlcdr1，包含seq id no:6的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq id no:7 的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:8的氨基酸序列；或vlcdr1，包含seq id no:12的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq idno:13的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:14的氨基酸序列； 或vl cdr1，包含seq id no:18的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq idno:19的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:20的氨基酸序列； 或vl cdr1，包含seq id no:66的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq idno:67的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:68的氨基酸序列； 或vl cdr1，包含seq id no:72的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq idno:73的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:74的氨基酸序列； 或vl cdr1，包含seq id no:78的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq idno:79的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:80的氨基酸序列。
24.在任意实施方案中的抗体和抗原结合片段是那些具有：(a)(i)包含下 述的vh：vh cdr1，包含氨基酸序列tx1gmgvg(seq id no:103)，其 中x1是l或v，vh cdr2，包含氨基酸序列hiwwddx2dkyyx3palks (seq id no:104)，其中x2是e或不存在且x3是y或n，和vh cdr3， 包含氨基酸序列igtaqatdaldy(seq id no:105)；和(ii)包含下述的 vl：vl cdr1，包含氨基酸序列rsskslx4x5sngntyly(seq idno:106)，其中x4是r或l且x5是k或h，vl cdr2，包含氨基酸序列 ymsnlas(seq id no:107)和vl cdr3，包含氨基酸序列 mqx6lex7plt(seq id no:108)，其中x6是g或s且x7是h或y；或(b) (i)包含下述的vh：vh cdr1，包含氨基酸序列gfslx8tx9gm(seq idno:109)，其中x8是n或s且其中x9是l或v，vh cdr2，包含氨基酸 序列wddx
10
(seq id no:110)，其中x
10
是e或不存在和vh cdr3，包 含氨基酸序列gtaqatdald(seq id no:111)；和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含氨基酸序列kslx
11
x
12
sngnty(seq id no:112)，其中x
11
是l或r且x
12
是h或k，vl cdr2，包含氨基酸序列yms(seq idno:113)和vl cdr3，包含氨基酸序列x
13
lex
14
pl(seq id no:114)，其 中x
13
是g或s且x
14
是h或y；或(c)(i)vh cdr1，包含氨基酸序列 gfslx
15
tx
16
gmg(seq id no:115)，其中x
15
是n或s且x
16
是v或l， vh cdr2，包含氨基酸序列iwwddx
17
dk(seq id no:116)，其中x
17
是 e或不存在和vh cdr3，包含氨基酸序列x
18
rigtaqatdaldy(seq idno:117)，其中x
18
是t，a或s；和(ii)包含下述的vl：vl cdr1，包含 氨基酸序列kslx
19
x
20
sngnty(seq id no:118)，其中x
19
是v或l且 x
20
是h或k，vl cdr2，包含氨基酸序列yms(seq id no:119)和vlcdr3，包含氨基酸序列mqsleyplt(seq id no:120)；或(d)(i)包含下述 的vh：vh cdr1，包含seq id no:23的氨基酸序列；vh cdr2，包含 seq id no:24的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:25的氨基酸 序列；和(ii)包含下述的vl：vl cdr1，包含seq id no:26的氨基酸序 列，vl cdr2，包含seq id no:27的氨基酸序列，和vl cdr3，包含 seq id no:28的氨基酸序列；或(e)(i)包含下述的vh：vh cdr1，包含 seq id no:29的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:30的氨基酸序 列；和vh cdr3，包含seq id no:31的氨基酸序列；和(ii)包含下述的 vl：vl cdr1，包含seq id no:32的氨基酸序列，vl cdr2，包含seqid no:33的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:34的氨基酸序列； 或(f)(i)包含下述的vh：vh cdr1，包含seq id no:35的氨基酸序列； vh cdr2，包含seq id no:36的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq idno:37的氨基酸序列；和(ii)包含下述的vl：vl cdr1，包含seq idno:38的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq id no:39的氨基酸序列，和 vl cdr3，包含seq id no:40的氨基酸序列；或(g)(i)包含
下述的vh： vh cdr1，包含seq id no:43的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:44的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:45的氨基酸序列； 和(ii)包含下述的vl：vl cdr1，包含seq id no:46的氨基酸序列，vlcdr2，包含seq id no:47的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq idno:48的氨基酸序列；或(h)(i)包含下述的vh：vh cdr1，包含seq idno:49的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:50的氨基酸序列；和 vh cdr3，包含seq id no:51的氨基酸序列；和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:52的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq idno:53的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:54的氨基酸序列； 或(i)(i)包含下述的vh：vh cdr1，包含seq id no:55的氨基酸序列； vh cdr2，包含seq id no:56的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq idno:57的氨基酸序列；和(ii)包含下述的vl：vl cdr1，包含seq idno:58的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq id no:59的氨基酸序列，和 vl cdr3，包含seq id no:60的氨基酸序列；或(j)(i)包含下述的vh： vh cdr1，包含seq id no:83的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:84的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:85的氨基酸序列； 和(ii)包含下述的vl：vl cdr1，包含seq id no:86的氨基酸序列，vlcdr2，包含seq id no:87的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq idno:88的氨基酸序列；或(k)(i)包含下述的vh：vh cdr1，包含seq idno:89的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:90的氨基酸序列；和 vh cdr3，包含seq id no:91的氨基酸序列；和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:92的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq idno:93的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:94的氨基酸序列； 或(l)(i)包含下述的vh：vh cdr1，包含seq id no:95的氨基酸序列； vh cdr2，包含seq id no:96的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq idno:97的氨基酸序列；和(ii)包含下述的vl：vl cdr1，包含seq idno:98的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq id no:99的氨基酸序列，和 vl cdr3，包含seq id no:100的氨基酸序列；或(m)(i)包含下述的vh： vh cdr1，包含seq id no:3的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:4的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:5的氨基酸序列；和(ii)包含下述的vl：vl cdr1，包含seq id no:6的氨基酸序列，vlcdr2，包含seq id no:7的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq idno:8的氨基酸序列；或(n)(i)包含下述的vh：vh cdr1，包含seq idno:9的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:10的氨基酸序列；和 vh cdr3，包含seq id no:11的氨基酸序列；和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:12的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq idno:13的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:14的氨基酸序列； 或(o)(i)包含下述的vh：vh cdr1，包含seq id no:15的氨基酸序列； vh cdr2，包含seq id no:16的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq idno:17的氨基酸序列；和(ii)包含下述的vl：vl cdr1，包含seq idno:18的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq id no:19的氨基酸序列，和 vl cdr3，包含seq id no:20的氨基酸序列；或(p)(i)包含下述的vh： vh cdr1，包含seq id no:63的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:64的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:65的氨基酸序列； 和(ii)包含下述的vl：vl cdr1，包含seq id no:66的氨基酸序列，vlcdr2，包含seq id no:67的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq idno:68的氨基酸序列；或(q)(i)包含下述的vh：vh cdr1，包含seq idno:69的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:70的氨基酸序列；和 vh cdr3，包含seq id no:71的氨基酸序列；和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:72的氨基酸序列，vl cdr2，包含seq idno:73的氨基酸序列，和vl cdr3，包含seq id no:74的氨基酸序列； 或(r)(i)包含下述的vh：vh cdr1，包含seq id no:75的氨基酸序
id no:17的氨基酸序列。
41.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:23的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:24的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:25的氨基酸序列。
42.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:29的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:30的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:31的氨基酸序列。
43.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:35的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:36的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:37的氨基酸序列。
44.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:43的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:44的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:45的氨基酸序列。
45.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:49的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:50的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:51的氨基酸序列。
46.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:55的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:56的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:57的氨基酸序列。
47.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:63的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:64的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:65的氨基酸序列。
48.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:69的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:70的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:71的氨基酸序列。
49.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:75的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:76的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:77的氨基酸序列。
50.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含vh cdr1，包含seqid no:83的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:84的氨基酸序列； 和vh cdr3，包含seq id no:85的氨基酸序列。
51.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:89的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:90的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:91的氨基酸序列。
52.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:95的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:96的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:97的氨基酸序列。
53.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含下述氨 基酸序列： qvx
21
lkesgpgx
22
lqpsqtlsltcsfsgfslx
23
tx
24
gmgvgwx
25
rqx
26
s gkglewlahiwwddx
27
dkyyx
28
pa
id no:52的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:53的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:54的氨基酸序列。
67.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:58的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:59的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:60的氨基酸序列。
68.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:86的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:87的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:88的氨基酸序列。
69.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:92的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:93的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:94的氨基酸序列。
70.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:98的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:99的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:100的氨基酸序列。
71.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:6的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq id no:7 的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:8的氨基酸序列。
72.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:12的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:13的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:14的氨基酸序列。
73.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:18的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:19的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:20的氨基酸序列。
74.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:66的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:67的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:68的氨基酸序列。
75.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:72的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:73的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:74的氨基酸序列。
76.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:78的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:79的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:80的氨基酸序列。
77.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含下述氨基 酸序列：
78.divmtqaapsx
36
x
37
vtpgesvsiscrsskslx
38
x
39
sngntylywfl qrpgqspqrliyymsnlasgvpdrfsgrgsgtdftlx
40
isrveax
41
dvg vyycmqx
42
lex
43
pltfgggtkleik(seq id no:102)，其中x
36
是i或 v，x
37
是p或s，x
38
是r或l，x
39
是k或h，x
40
是r或k，x
41
是e或 g，x
42
是s或g且x
43
是y或h。
79.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含seq idno:22的氨基酸序列。
80.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含seq idno:42的氨基酸序列。
81.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含seq idno:82的氨基酸序列。
82.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含seq idno:2的氨基酸序列。
83.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含seq idno:62的氨基酸序列。
84.在某些实施方案中，抗体包含人源的重链和轻链恒定区。在某些实施 方案中，重链恒定区具有选自γ1，γ2，γ3和γ4的同种型。在某些实施方案 中，轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。
85.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的。在某些实施 方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的形式的啮齿类抗体。
86.在某些实施方案中，抗体是包含两条相同重链和两条相同轻链的免疫 球蛋白。在某些实施方案中，免疫球蛋白是igg。
87.本文还提供了包含缀合至试剂的本文提供的抗体或其抗原结合片段的 抗体缀合物。在某些实施方案中，试剂是显影剂或细胞毒性剂。
88.在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。在某些 实施方案中，双特异性抗体免疫特异性结合cd3。在某些实施方案中，双 特异性抗体包含免疫特异性结合muc16的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的 轻链通过肽接头缀合至免疫特异性结合cd3的单链可变区片段(scfv)。本 文还提供了包含缀合至试剂的本文提供的双特异性抗体的双特异性抗体缀 合物。在某些实施方案中，试剂是显影剂或细胞毒性剂。
89.在某些实施方案中，其抗原结合片段是单链可变区片段(scfv)。本文还 提供了包含缀合至试剂的本文提供的scfv的scfv缀合物。在某些实施方案 中，试剂是显影剂或细胞毒性剂。
90.本文还提供了包含抗体和抗原结合片段的融合蛋白、嵌合分子和缀合 物。本文提供了包括一个或多个任一提供的抗体或其抗原结合片段的嵌合 抗原受体(car)，例如包含任一本文提供的scfv或本文提供的scfv缀合 物的car，和/或包含与之竞争结合muc16的抗原结合域的car。
91.本文还提供了抗体重链或其抗原结合部分。在提供的抗体及其抗原结 合片段中包括具有重链和/或其抗原结合部分(例如其vh区)的抗体及其抗 原结合片段，本文还提供了该重链及其抗原结合部分。在一些实施方案中， 重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh：(a)vh cdr1，包含氨基酸序 列tx1gmgvg(seq id no:103)，其中x1是l或v；(b)vh cdr2，包含 氨基酸序列hiwwddx2dkyyx3palks(seq id no:104)，其中x2是e 或不存在且x3是y或n；和(c)vh cdr3，包含氨基酸序列 igtaqatdaldy(seq id no:105)；其中，可选的，包含抗体重链或其抗 原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式 的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列 是seq id no:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16 的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式
的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
92.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh：(a) vh cdr1，包含氨基酸序列gfslx8tx9gm(seq id no:109)，其中x8是 n或s且x9是l或v；(b)vh cdr2，包含氨基酸序列wddx
10
(seq idno:110)，其中x
10
是e或不存在；和(c)vh cdr3，包含氨基酸序列 gtaqatdald(seq id no:111)；其中，可选的，包含抗体重链或其抗 原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式 的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序 列是seq id no:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的 muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序 列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞 的体外基质胶侵袭。
93.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh：(a) vh cdr1，包含氨基酸序列gfslx
15
tx
16
gmg(seq id no:115)，其中 x
15
是n或s且x
16
是v或l；(b)vh cdr2，包含氨基酸序列 iwwddx
17
dk(seq id no:116)，其中x
17
是e或不存在；和(c)vhcdr3，包含氨基酸序列x
18
rigtaqatdaldy(seq id no:117)，其中 x
18
是t，a或s；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体 或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细 胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
94.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:3的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:4 的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:5的氨基酸序列；其中，可 选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特 异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的， 且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫特异性结 合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其 中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达所述第一 形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
95.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:9的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:10 的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:11的氨基酸序列；其中， 可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫 特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化 的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫特异 性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的， 且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达所述 第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
96.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh： vh cdr1，包含seq id no:15的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:16的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:17的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
97.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:23的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:24的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:25的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
98.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:29的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:30的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:31的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
99.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:35的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:36的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:37的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
100.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:43的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:44的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:45的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
101.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:49的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:50的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:51的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
102.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分具有包含下述的vh：vhcdr1，包含seq id no:55的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:56的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:57的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化
id no:95的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:96的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:97的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
109.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含vh，其包含下述氨 基酸序列： qvx
21
lkesgpgx
22
lqpsqtlsltcsfsgfslx
23
tx
24
gmgvgwx
25
rqx
26
s gkglewlahiwwddx
27
dkyyx
28
palksrltisx
29
x
30
x
31
sknqvflkix 32
nvx
33
tadx
34
atyycx
35
rigtaqatdaldywgqgtsvtvss(seq idno:101)，其中x
21
是t或n，x
22
是i或k，x
23
是n或s，x
24
是v或l， x
25
是s或i，x
26
是p或s，x
27
是e或不存在，x
28
是n或y，x
29
是k或 r，x
30
是a或d，x
31
是t或s，x
32
是v或a，x
33
是g或d，x
34
是t， i或s且x
35
是t，s或a；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部 分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16 的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
110.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含vh，其包含seq idno:1的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗 体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细 胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
111.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含vh，其包含seq idno:21的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的 抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的 细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
112.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含vh，其包含seq idno:41的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的 抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的 细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
113.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含vh，其包含seq idno:61的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的 抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的 细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)
抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
114.在一些实施方案中，重链或其抗原结合部分包含vh，其包含seq idno:81的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的 抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的 细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
115.在某些实施方案中，抗体重链或其抗原结合部分包含人源的重链恒定 区。在某些实施方案中，重链恒定区具有选自γ1，γ2，γ3和γ4的同种型。 在某些实施方案中，抗体重链是人源化的。在某些实施方案中，抗体重链 是人源化的形式的啮齿类重链。
116.本文还提供了包含本文提供的抗体重链的抗体重链缀合物，其中所述 抗体重链缀合试剂。在某些实施方案中，试剂是显影剂或细胞毒性剂。
117.在提供的抗体及其抗原结合片段中包括具有轻链和/或其部分例如其 vl区的抗体及其抗原结合片段，本文还提供了该轻链及其抗原结合部分。 在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：(a)vlcdr1，包含氨基酸序列rsskslx4x5sngntyly(seq id no:106)，其中 x4是r或l且x5是k或h；(b)vl cdr2，包含氨基酸序列ymsnlas(seqid no:107)；和(c)vl cdr3，包含氨基酸序列mqx6lex7plt(seq idno:108)，其中x6是g或s且x7是h或y；其中，可选的，包含抗体轻 链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达 第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨 基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的 muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列 是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的 体外基质胶侵袭。
118.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：(a) vl cdr1，包含氨基酸序列kslx
11
x
12
sngnty(seq id no:112)，其中 x
11
是l或r且x
12
是h或k；(b)vl cdr2，包含氨基酸序列yms(seq idno:113)；和(c)vl cdr3，包含氨基酸序列x
13
lex
14
pl(seq idno:114)，其中x
13
是g或s且x
14
是h或y；其中，可选的，包含抗体轻 链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达 第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的 氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形 式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基 酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的 细胞的体外基质胶侵袭。
119.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：(a) vl cdr1，包含氨基酸序列kslx
19
x
20
sngnty(seq id no:118)，其中 x
19
是v或l且x
20
是h或k；(b)vl cdr2，包含氨基酸序列yms(seq idno:119)；和(c)vl cdr3，包含氨基酸序列mqsleyplt(seq idno:120)；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗 原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第 一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii) 不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是 未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制 重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
120.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:6的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq id no:7 的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:8的氨基酸序列；其中，可 选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特 异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的， 且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫特异性结 合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其 中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达所述第一 形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
121.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:12的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:13的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:14的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
122.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:18的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:19的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:20的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
123.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:26的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:27的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:28的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
124.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:32的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:33的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:34的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
125.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:38的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:39的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:40的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，
id no:78的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:79的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:80的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
132.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:86的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:87的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:88的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
133.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:92的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:93的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:94的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
134.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分具有包含下述的vl：vlcdr1，包含seq id no:98的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:99的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:100的氨基酸序列； 其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段 (i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖 基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫 特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化 的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139；并(iii)抑制重组表达 所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
135.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含vl，其包含下述氨 基酸序列： divmtqaapsx
36
x
37
vtpgesvsiscrsskslx
38
x
39
sngntylywflqrp gqspqrliyymsnlasgvpdrfsgrgsgtdftlx
40
isrveax
41
dvgvyy cmqx
42
lex
43
pltfgggtkleik(seq id no:102)，其中x
36
是i或v，x
37
是p或s，x
38
是r或l，x
39
是k或h，x
40
是r或k，x
41
是e或g，x
42
是s或g且x
43
是y或h；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部 分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16 的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
136.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含vl，其包含seq idno:2的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗 体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细 胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的
氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
137.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含vl，其包含seq idno:22的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的 抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的 细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
138.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含vl，其包含seq idno:42的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的 抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的 细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
139.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含vl，其包含seq idno:62的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的 抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的 细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
140.在一些实施方案中，轻链或其抗原结合部分包含vl，其包含seq idno:82的氨基酸序列；其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的 抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的 细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭。
141.在某些实施方案中，抗体轻链或其抗原结合部分包含人源的轻链恒定 区。在某些实施方案中，轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在某些实 施方案中，抗体轻链是人源化的。在某些实施方案中，抗体轻链是人源化 的形式的啮齿类抗体。
142.本文还提供了包含缀合至试剂的本文提供的抗体轻链的抗体轻链缀合 物。在某些实施方案中，试剂是显影剂或细胞毒性剂。
143.本文还提供了融合蛋白，包含通过肽接头缀合至scfv的本文提供的抗 体轻链缀合物。在某些实施方案中，scfv结合cd3。
144.本文还提供了细胞，例如免疫细胞，例如t细胞，其重组表达一个或 多个本文提供的分子，例如本文提供的car。
145.本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的scfv的核酸序列。 本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的scfv或其缀合物的核 酸序列。本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的car的核酸 序列。本文还提供了一种多核苷酸，其包含
编码本文提供的抗体重链或其 抗原结合部分的核酸序列。本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文 提供的抗体重链缀合物的核酸序列。本文还提供了一种多核苷酸，其包含 编码本文提供的抗体轻链或其抗原结合部分的核酸序列。本文还提供了一 种多核苷酸，其包含编码本文提供的抗体轻链缀合物的核酸序列。本文还 提供了一种多核苷酸，其包含编码本文提供的融合蛋白的核酸序列。一种 多核苷酸，其包含编码下述的核酸序列：(a)本文提供的抗体重链或其抗 原结合部分或本文提供的抗体重链缀合物；和(b)本文提供的抗体轻链或其 抗原结合部分，本文提供的抗体轻链缀合物或本文提供的融合蛋白。
146.本文还提供了包含可操作地连接启动子的本文提供的多核苷酸的载 体。本文还提供了载体，其包含(a)可操作地连接第一启动子的本文提供的 第一多核苷酸和(b)可操作地连接第二启动子的本文提供的第二多核苷酸。
147.本文还提供了包含可操作地连接启动子的本文提供的多核苷酸的离体 细胞。本文还提供了包含可操作地连接启动子的本文提供的多核苷酸的离 体细胞。本文还提供了包含本文提供的载体的离体细胞。本文还提供了包 含可操作地连接启动子的一种或多种编码本文提供的抗体或其抗原结合片 段的多核苷酸的离体细胞。
148.本文还提供了产生抗体重链或其抗原结合部分的方法，包括在细胞表 达多核苷酸的条件下培养本文提供的细胞以产生多核苷酸编码的抗体重链 或其抗原结合部分或抗体重链缀合物。
149.本文还提供了产生抗体轻链或其抗原结合部分的方法，包括在细胞表 达多核苷酸的条件下培养本文提供的细胞以产生抗体轻链或其抗原结合部 分，抗体轻链缀合物或融合蛋白多核苷酸编码的。
150.本文还提供了产生抗体或其抗原结合片段的方法，包括在细胞表达可 操作地连接第一启动子的多核苷酸和可操作地连接第二启动子的多核苷酸 的条件下离体培养本文提供的细胞以产生(i)多核苷酸编码的抗体重链或 抗体重链缀合物和(ii)多核苷酸编码的抗体轻链、抗体轻链缀合物或融合蛋 白。
151.本文还提供了药物组合物，包含：治疗有效量的本文提供的抗体或其 抗原结合片段，本文提供的抗体缀合物，本文提供的双特异性抗体，本文 提供的双特异性抗体缀合物，本文提供的scfv，scfv缀合物，本文提供的 car，本文提供的抗体重链或其抗原结合部分，本文提供的抗体重链缀合 物，本文提供的抗体轻链或其抗原结合部分，本文提供的抗体轻链缀合物， 本文提供的融合蛋白或本文提供的t细胞和药学上可接受的载体。
152.本文还提供了在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括对所述患者给 药本文提供的药物组合物。在某些实施方案中，癌症是肺癌，胰腺癌，乳 腺癌，子宫癌，输卵管癌或原发性腹膜癌。在某些实施方案中，癌症是卵 巢癌。在某些实施方案中，患者是人患者。在具体的实施方案中，该方法 是联合治疗方法，进一步包括对患者给药治疗有效量的另一治疗剂。
153.在联合治疗方法的一个具体实施方案中，药物组合物包含治疗有效量 的本文描述的抗体或其抗原结合片段的第一抗体，其中抗体或其抗原结合 片段识别muc16中的表位，所述表位包含n-糖基化的seq id no:150的 asn1806，但不包含n-糖基化的seq id no:150的asn1800，其中另外的 治疗剂是第二抗体或其抗原结合片段，其中第二抗体或其抗原结合片段识 别muc16中的表位，所述表位包含n-糖基化的seq id no:150的 asn1806，也包
含n-糖基化的seq id no:150的asn1800。在具体实施方 案中，第一抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性 结合重组表达第一形式的muc16的细胞的能力，其第一形式的muc16是 糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)其不能 免疫特异性结合重组表达第三形式的muc16的细胞，该第三形式是糖基 化的，其中第三形式的氨基酸序列是seq id no:139；和(iii)其免疫特异 性结合重组表达第四形式的muc16的细胞的能力，其第四形式是糖基化 的，且其中第四形式的氨基酸序列是seq id no:152；且其中重组表达第 一形式的muc16的细胞、重组表达第三形式的muc16的细胞和重组表达 第四形式的muc16的细胞是相同细胞类型；且其中第二抗体或其抗原结合 片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的 muc16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基 酸序列是seq id no:133；和(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第五形式 的muc16的细胞，其第五形式是糖基化的，且其中第五形式的氨基酸序 列是seq id no:172，其中重组表达第一形式的muc16的细胞与重组表达 第五形式的muc16的细胞是相同细胞类型。
154.在联合治疗方法的一个具体实施方案中，药物组合物包含治疗有效量 的第一抗体或其抗原结合片段，其是本文描述的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合片段识别muc16中的表位，所述表位包含n
‑ꢀ
糖基化的seq id no:150的asn1806但不包含n-糖基化的seq id no:150 的asn1800，其中另外的治疗剂是治疗有效量的第二抗体或其抗原结合片 段，其中第二抗体或其抗原结合片段识别muc16中的表位，所述表位包 含n-糖基化的seq id no:150的asn1800但不包含n-糖基化的seq idno:150的asn1806。在具体实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段通过 下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞 的能力，其第一形式的muc16是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序 列是seq id no:133；(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第三形式的 muc16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列 是seq id no:139；和(iii)其免疫特异性结合重组表达第四形式的muc16 的细胞的能力，其第四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是 seq id no:152，其中重组表达第一形式的muc16的细胞、重组表达第三 形式的muc16的细胞和重组表达第四形式的muc16的细胞是相同细胞类 型；且其中第二抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特 异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞的能力，其第一形式是糖基 化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)其免疫特异 性结合重组表达第三形式的muc16的细胞的能力，该第三形式的muc16 是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是seq id no:139；和(iii)其 不能免疫特异性结合重组表达第四形式的muc16的细胞，其中第四形式 的氨基酸序列是seq id no:152，且，其中重组表达第一形式的muc16的 细胞、重组表达第三形式的muc16的细胞和重组表达第四形式的muc16 的细胞是相同类型的细胞。
155.本文还提供了包括一个或多个糖基化位点的免疫原性糖肽，其中(i)免 疫原性糖肽是10-60个氨基酸残基、10-30个氨基酸残基、15-25个氨基酸 残基、15-20个氨基酸残基或15-18个氨基酸残基长和(ii)该一个或多个糖基 化位点的至少一个连接碳水化合物。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包 含1、2或3个糖基化位点。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含连接碳 水化合物的糖基化位点。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含两个分别 连接碳水化合物的糖基化位点。在某些实施方案中，碳水化合物是n-或o 连接的碳水化合
物。在某些实施方案中，碳水化合物是单糖、二糖、三糖、 四糖或五糖。在某些实施方案中，碳水化合物是二糖。在某些实施方案中， 二糖是壳二糖。
156.在某些实施方案中，免疫原性糖肽的n端是乙酰化的。在某些实施方 案中，糖肽的c端是n-甲基甲酰胺衍生物的形式。在某些实施方案中，免 疫原性糖肽缀合免疫原性载体蛋白。在某些实施方案中，免疫原性载体蛋 白是钥孔戚血蓝素。
157.在某些实施方案中，免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基长。在某些实 施方案中，免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。在某些实施方案 中，免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
158.在某些实施方案中，免疫原性糖肽是18个氨基酸残基长。在某些实施 方案中，免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
159.在某些实施方案中，免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长。在某些实施 方案中，免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。
160.在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含seq id no:150的氨基酸序列 的至少10个氨基酸部分，其中该一个或多个糖基化位点的至少一个位于所 述氨基酸序列部分之内。
161.在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含seq id no:129的氨基酸序 列。
162.在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于seq id no:129第30个残 基(asn)的糖基化位点，其连接壳二糖。
163.在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于seq id no:129第30个残 基(asn)的糖基化位点，其连接man3glcnac2部分。
164.在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含seq id no:130的氨基酸序 列。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于seq id no:130第4个残 基(asn)和第10个残基(asn)的两个糖基化位点，其分别连接壳二糖。
165.在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含seq id no:131的氨基酸序 列。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于seq id no:131第7个残 基(asn)的糖基化位点，其连接壳二糖。
166.本文还提供了产生特异性结合糖蛋白的抗体或其抗原结合片段的方 法，包括用包含一个或多个糖基化位点的免疫原性糖肽来免疫对象，其中(i) 免疫原性糖肽是10-60个氨基酸残基、10-30个氨基酸残基、15-25个氨基 酸残基、15-20个氨基酸残基或15-18个氨基酸残基长，(ii)免疫原性糖肽包 含糖蛋白氨基酸序列的至少10个氨基酸的部分，(iii)该一个或多个糖基化 位点的至少一个连接碳水化合物，和(iv)该一个或多个糖基化位点的至少一 个位于所述氨基酸序列部分之内。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合 片段不能特异性结合非糖基化形式的糖蛋白。在某些实施方案中，对象是 山羊、绵羊、驴、鸡、豚鼠、大鼠、兔或小鼠。在某些实施方案中，对象 是大鼠、兔或小鼠。在某些实施方案中，对象是小鼠。在某些实施方案中， 免疫原性糖肽包含1、2或3个糖基化位点。权利要求190-195任一项的方 法，其中免疫原性糖肽包含连接碳水化合物的糖基化位点。在某些实施方 案中，免疫原性糖肽包含两个分别连接碳水化合物的糖基化位点。在某些 实施方案中，碳水化合物是n-或o连接的碳水化合物。在某些实施方案中， 碳水化合物是单糖、二糖、三糖、四糖或五糖。在某些实施方案中，碳水 化合物是二糖。在某些实施方案中，二糖是壳二糖。在某些实施方案中， 免疫原性糖肽的n端是乙酰化的。在某些实施方案中，糖肽的c端是n
‑ꢀ
甲基甲酰胺衍生物的形式。在某些实施方案中，免疫原性糖肽缀合免疫原 性载体蛋白。在某些实施方案中，免疫原性载体蛋白是钥孔戚血蓝素。在 某些实施方案中，免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基长。在某些实施方案 中，免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。在某些实施方案中，免 疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。在某些实施方案中， 免疫原性糖肽是18个氨基酸残基长。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包 含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。在某些实施方案中，免疫原性糖肽 是15个氨基酸残基长。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含连接壳二糖 的糖基化位点。在某些实施方案中，糖蛋白包含seq id no:150的氨基酸 序列。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含seq id no:129的氨基酸序 列。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于seq id no:129第30个残 基(asn)的糖基化位点，其连接壳二糖。在某些实施方案中，免疫原性糖肽 包含位于seq id no:129第30个残基(asn)的糖基化位点，其连接 man3glcnac2部分。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含seq id no:130 的氨基酸序列。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于seq id no:130 第4个残基(asn)和第10个残基(asn)的两个糖基化位点，其分别连接壳二 糖。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含seq id no:131的氨基酸序列。 在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含位于seq id no:131第7个残基(asn) 的糖基化位点，其连接壳二糖。
167.本文还提供了抗体及其抗原结合片段，其免疫特异性结合muc16且其 具有本文描述的抗体(例如，10c6、7b12、19c11、16c5或18c6)的vh，vl，vh cdr，和/或vl cdr序列，及其缀合物(例如，缀合显影剂或细胞 毒性剂试剂)。
168.4.附图简述
169.图1a-图1i。muc16构建体。图1a：muc16的示意图。图1b：顶 部：muc16
c344
的示意图。底部：截短的muc16
c344
构建体的线性表示。第 一串联重复的n端氨基酸序列如seq id no:155所示。第一串联重复的c 端氨基酸序列如seq id no:156所示。胞外域n端的氨基酸序列如seq idno:157所示。胞外域c端的氨基酸序列如seq id no:158所示。图1c： 顶部：muc16
c114
的示意图。底部：muc16
c114
的线性表示。胞外域的氨基 酸序列如seq id no:161所示。跨膜域的氨基酸序列如seq id no:159所 示。胞质尾区的氨基酸序列如seq id no:160所示。图1d：顶部：muc16
c80
的示意图。底部：muc16
c80
的线性表示。胞外域的氨基酸序列如seq idno:162所示。跨膜域的氨基酸序列如seq id no:159所示。胞质尾区的氨 基酸序列如seq id no:159所示。图1e：顶部：muc16
c86
的示意图。底 部：muc16
c86
的线性表示。胞外域的氨基酸序列如seq id no:163所示。 跨膜域的氨基酸序列如seq no：164所示。胞浆区的氨基酸序列是seq idno:165。图1f：muc16
c114-n123
的线性表示。3(n
→
a)突变的胞外域58aa 的氨基酸序列如seq id no:166所示。跨膜域的氨基酸序列如seq idno:159所示。胞浆区的氨基酸序列如seq id no:160所示。图1g，图1h 和图1i描述了通过4h11由facs分析检测的细胞百分比，其中细胞系表 达指出的muc16构建体。
170.图2a-图2c。muc16转染子的体外生长曲线。图2a描述了与3t3细 胞中的对照细胞系(phrgfp)相比较的muc16
c114
和muc16
c344
细胞系的体外 生长曲线。图2b描述了与a2780细胞中的对照细胞系(phrgfp)相比较的 muc16
c114
和muc16
c344
细胞系的体外生长曲线。图2c描述了与3t3细胞 中的对照细胞系(phrgfp)相比较的muc16
c114
，muc16
c80
和muc16
c86
细胞 系的体外生长曲线。
171.图3a-图3e。muc16在3t3细胞中的作用。图3a描绘了在60mm培 养皿中3t3转染子的软琼脂生长。14天后，对菌落进行计数和绘制。表中 所示的数据表示与表达phrgfp对照载体的细胞的软琼脂生长相比的三个 相似实验中的一个(***p《0.0001)。图3b描述了用phrgfp对照载体或用 muc16
c114
或muc16
c344
羧基末端构建体稳定转染后3t3细胞系的基质胶侵 袭测定。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。与侵袭表 达phrgfp载体对照的细胞相比，muc16
c114
和muc16
c344
细胞系的侵袭性 明显更高(***p《0.0001)，muc16
c344
细胞系的结果与muc16
c114
细胞系显 著不同((#p＝0.0354)。图3c描述了muc16
c114
和muc16
c344
表达诱导的转 移和侵袭基因的表达。针对muc16构建体阳性和仅载体细胞系检测了80 个侵袭/转移基因转录物的超阵列。在3t3muc16
c114
或3t3-muc16
c344
细胞 系中测量选定的趋化性，粘附和侵袭转录物的表达(三个平行分别测试两次， 并与通过卡方检验的phr仅载体对照比较)。表中显示了经调整适于重复检 测的每个转录物的p值。包括了p《0.05或更低水平变化的所有基因。图3d： 检测了转染的3t3细胞erk/akt信号通路的激活与仅载体对照的比较。 与phr载体的表达相比，muc16
c114
和muc16
c344
构建体表达后，erk1/2 (pt202/y204)和akt(s473)的磷酸化增加。在每个细胞系中都观察到两种 途径的活化。β-肌动蛋白归一化光密度测定值如下图所示每个western印迹 显示。图3e描绘了无胸腺裸鼠中muc16构建体阳性的肿瘤生长。将两百 万个肿瘤细胞引入15只nu/nu小鼠的侧腹，观察小鼠的肿瘤形成。每周两 次由卡尺测量肿瘤。携带muc16构建体阳性肿瘤的小鼠平均肿瘤体积的差 异显著更大(与表达phrgfp对照载体的细胞相比，两个细胞系的p《0.0001)。
172.图4a-图4c.muc16片段的致癌性质。图4a描述了转染phrgfp对照 载体或muc16羧基末端表达载体muc16
c114
或muc16
c344
的a2780细胞系 的基质胶侵袭测定。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。 将结果与表达phrgfp对照载体或muc16
c114
的细胞的基质胶侵袭进行比 较。muc16
c114
或muc16
c34
细胞系相对于phrgfp载体对照显示出显著的 基质胶侵袭，muc16
c344
细胞系的结果与muc16
c114
细胞系的结果显著不同 (##p＝0.0018)。图4b描述了muc16表达对erk/akt信号传导的影响。 检测了a2780细胞的erk/akt信号通路的激活。每个muc16表达构建体 的表达后，erk1/2(pt202/y204)和akt(s473)的磷酸化增加。在每个细胞 系中激活两种途径。β-肌动蛋白归一化光密度测定值如下图所示每个 western印迹显示。图4c描绘了无胸腺裸鼠中muc16-构建体阳性的肿瘤 生长。将两百万个肿瘤细胞引入15只nu/nu小鼠的侧腹，观察小鼠的肿瘤 形成。每周两次由卡尺测量肿瘤。如图所示，在第28天，携带任何muc16
c114
‑ꢀ
或muc16
c344-阳性肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积的差异显著更大。
173.图5a-图5d：截短的muc16
c114
变体的影响。图5a：软琼脂生长。将 表达muc16
c114
的内部或外部域部分的3t3转染子铺在软琼脂上，如6.1.2 节所述。对菌落进行计数和绘制。显示的数据代表三个实验之一。muc16
c80
和muc16
c86
的软琼脂生长速率与muc16
c114
的生长速度显着不同(分别为# p＝0.0111和##p＝0.0258)，而与muc16
86
转染子的生长速率相比，muc16
80
转染子的生长速率更高(###p《0.0001)。图5b描述了转染phrgfp对照载体 或用muc16羧基末端构建体转染的3t3细胞系的基质胶侵袭测定。每次测 定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。与muc16
c114
细胞系侵袭 相比，侵袭muc16
c80
转染细胞是显著的(#p＝0.0172)。图5c描述了muc16 表达对erk/akt信号传导的影响。检测了转染的3t3细胞的erk/akt信 号通路的激活。muc16
c114
后erk1/2(pt202/y204)和akt(s473)的磷酸化 增加，
然而，在用muc16
c80
或muc16
c86
构建体转染的细胞中信号较低。β
‑ꢀ
肌动蛋白归一化光密度测定值如下图所示每个western印迹显示。图5d描 绘了无胸腺裸鼠中muc16构建阳性的肿瘤生长。将两百万个肿瘤细胞导入 20只nu/nu小鼠的侧腹，观察小鼠的肿瘤形成。每周两次由卡尺测量肿瘤。 携带muc16+肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积的差异显著更大。3t3muc16
c114
和3t3muc16
c86
转染子与muc16
c80
转染子相比有显著差异(###p 《0.0001)。
174.图6a-图6b。muc16
c114
(氨基酸残基1777-1890(seq id no:133)，图 6a)和muc16
c344
(氨基酸残基1547-1890(seq id no:132)，图6b)的氨基 酸序列。n-和o-糖基化位点高亮显示，跨膜域(氨基酸残基1835-1859)带 有下划线并标明“跨膜域”。氨基酸残基1857-1884表示muc16
c86
构建体中 存在的28个氨基酸的内域缺失(参见，图1)。氨基酸残基1798-1831表示 muc16
c80
构建体中存在的34个氨基酸的胞外域缺失(参见，图1)。
175.图7a-图7h。n-糖基化对muc16转化的影响。图7a描述了转染 phrgfp对照载体或muc16
c114
或muc16
c114-n123
和muc16
c114
并用0.1 μg/ml衣霉素处理的3t3细胞系的基质胶侵袭分析。muc16
c114
细胞系的结 果与phrgfp载体对照细胞系的结果显著不同(###p《0.0001)。 muc16
c114-n123
细胞系的结果与phrgfp载体对照细胞系的结果显著不同 (**p＝0.007)。用n-糖基化抑制剂衣霉素处理与未处理的muc16
c114
相比 显著抑制基质胶侵袭(p＝0.004)。图7b描述了与phrgfp对照载体相比的的 3t3转染的细胞系基质胶侵袭分析。用muc16
c114
转染的3t3细胞使用单 独的培养基处理或用5μg/ml的对照pfuse higg1-fc2融合蛋白或用5 μg/ml的muc16
c57-c114-pfuse higg1-fc2融合蛋白或用5μg/ml的 117-244
lgals3-pfuse higg1-fc2融合蛋白处理，如图8详述。muc16
c114
细胞系比表达phrgfp载体对照的对照3t3细胞的侵袭性更强(*** p《0.0001)，且其不受暴露于仅pfuse载体蛋白的影响。相反，用 muc16
c57-c114-pfuse higg1-fc2融合蛋白或
117-244
lgals3-pfusehigg1-fc2融合蛋白处理的muc16
c114
细胞系与muc16
c114
对照细胞相比显 示了显著的基质胶侵袭抑制。图7c描述了muc16表达对erk/akt信号 传导的影响。还检测了转染的3t3细胞对erk/akt信号通路的激活。用muc16
c114
转染的3t3中erk1/2(pt202/y204)和akt(s473)的磷酸化增 强，然而，在用muc16
c114-n123
载体转染的3t3细胞中该作用消失 (“muc16
c114-n123”和“muc16
3(n
‑‑
》a)c114”在本文中可交换使用)。虽然将3个天 冬酰胺突变为丙氨酸突变，用抗muc16抗体(4h11 mab)进行western印迹 显示了比phrgfp载体对照或原始muc16
c114-转染细胞更强的信号，表明转 染的3t3细胞中表达高水平的muc16
3(n
‑‑
》a)c114
蛋白。如本文使用的，
ꢀ“
4h11”表示rao等，appl.immunohistochem mol morphol，2010， 18(5):462-72和国际专利申请公开号wo 2011/119979中的4h11单克隆抗 muc16抗体。图7d描述了无胸腺裸鼠中muc16-构建体-阳性的肿瘤生长。 将两百万个肿瘤细胞导入20只nu/nu小鼠侧腹并观察小鼠的肿瘤形成。每 种两次用卡尺测量肿瘤。携带muc16
c114
肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积差异 显著(p《0.0001)。3t3-muc16
c114
转染子的结果与phrgfp对照载体细胞系的 结果相比而言高度显著(***p《0.0001)。然而，muc16
c114-n123 3t3转染子 未显示相对phrgfp载体对照3t3细胞的任何显著性，显示n-糖基化的突 变显著降低肿瘤生长和侵袭。图7e描述了muc16
c57-114-pfuse-人-igg1-fc2 构建体的线性表示。胞外域的氨基酸序列如seq id no:161所示。图7f描 述了由指示的抗体测定的蛋白水平的muc16
c57-114-pfuse-人-igg1-fc2构 建体。图7g描述了
117-244
lgals3-pfuse-人-igg1-fc2构建体的线性表示。 糖结合域的氨基酸序列如seq id no:167所示。图7h描述了由指示的抗 体测定的蛋白水平的
17-244
lgals3-pfuse-人-igg1-fc2构
建体。
176.图8.插入pfuse-higg1-fc2载体以构建作为假(sham)受体的 muc16
c57-c114
pfuse的胞外域-muc16
c57-》c114
(seq id no:161，muc16氨 基酸残基1777-1834)的氨基酸序列和插入pfuse-higg1-fc2获得作为受体 的
117-244
lgals3pfuse载体的
117-244
lgals3氨基酸序列(seq id no:167) 的顺序。
177.图9a-图9e.muc16
c354
转基因小鼠。图9a描述了muc16c354条件构 建的策略。使用cmv早期增强子加上鸡β肌动蛋白启动子(cag)来驱动两 个loxp和下游muc16
c354
序列之间的hrgfp的转录。图9b：southern印迹 显示在显微注射程序后99只动物中有12名候选的muc16
c354
阳性建立者 (founder)。图9c：使用抗muc16抗体4h11的western印迹来鉴定muc16
c354
小鼠集落发育的建立者9(拷贝)和36(拷贝)；a5是来自稳定转染 muc16
c354
的skov3的阳性对照。图9d：来自双muc16
c354
:p53+/-转基因 小鼠的肿瘤的组织学分析。在双muc16
c354
:p53+/-转基因小鼠中鉴定了多个 肉瘤和淋巴瘤。切片用苏木精和伊红(h&e)染色。肿瘤包括子宫(i，比例尺：100μm)、肝脏(ii，比例尺：50μm)、卵巢(iii，比例尺：50μm)和骨髓(iv， 比例尺：50μm)中的组织细胞肉瘤以及卵巢(v，比例尺：50μm)、肾脏(vi， 比例尺：50μm)和肺(vii，比例尺：50μm)中的淋巴瘤与肺癌(viii，比例尺： 50μm)。图9e：转基因小鼠癌特异性kaplan-meier存活曲线：muc16
c354
小鼠在前18个月没有显示出与野生型(wt)类似的自发性肿瘤发展。然而， 当muc16
c354
小鼠与p53+/-小鼠交叉时，与p53+/-小鼠(p《0.014)或 muc16c354小鼠相比，双重转基因muc16c354：p53+/-小鼠由于自发性肿 瘤发展而显示出显著更差的总生存期。
178.图10。12个月大的雄性和雌性muc16
c354
转基因小鼠的代表性组织学 结果。组织切片用苏木精和伊红染色(h&e，比例尺：50μm)。观察到子 宫内膜增生，两种基因型具有相似的发病率和严重程度(此处仅显示于转基 因动物中)。转基因动物的卵巢、肺、结肠和肝脏(tg)与亲本系(野生型， wt)相似。
179.图11a-图11c。muc16对人卵巢癌的影响。图11a描述了muc16 转录本数。图11b：与kaplan-meier分析中与muc16表达较低的患者相比， 具有最高muc16表达的患者的五分之一与18例确定的muc16突变的患 者具有显著更差(p＝0.02117)的生存期。图11c描述了muc16遗传改变与 卵巢癌中pi3k突变事件的关系。
180.图12a-图12c。muc16基质胶侵袭的糖基化需求。图12a描述了 skov3转染的细胞系的基质胶侵袭分析。phrgfp表示表达对照载体的 skov3细胞。muc16
c114
表示表达muc16
c114
的skov3细胞。n3表示表 达muc16
c114-n3
的skov3细胞。n1-2表示表达muc16
c114-n12
的skov3 细胞。n1-2-3表示表达muc16
c114-n123
的skov3细胞。muc16
c114-shcontrol 表示表达muc16
c114
和对照shrna的skov-3细胞。phrgfp shrna mgat 群#4表示表达对照载体和针对mgat5的shrna的skov3细胞。phrgfpshrna lgals3群#15表示表达对照载体和针对lgals3的shrna的 skov3细胞。muc16
c114-shmgat5表示表达muc16
c114
和针对mgat5 的shrna的skov3细胞。muc16
c114-shlgals3表示表达muc16
c114
和针 对lgals3的shrna的skov3细胞。图12b描述了表达对照载体、phrgfp 或指示的muc16
c114
构建体的3t3细胞的基质胶侵袭分析。图12c描述了 移植有表达指示的构建体的skov3细胞的无胸腺裸鼠中按照肿瘤体积测 定的肿瘤生长。
181.图13a-图13d。muc16糖基化模式和肽。图13a描述了表达 muc16
c114-n12
的skov3细胞的n连接的谱。三角形表示岩藻糖。方块代 表n-乙酰氨基葡萄糖。灰色圆圈表示甘露糖。白
色圆圈表示半乳糖。菱形 表示n-乙酰基甲酰胺酸。图13b描述了55-mer(seq id no:129)的抗原。 图13c描述了15-mer(seq id no:131)的抗原。图13d描述了18-mer(seqid no:130)的抗原。
182.图14提供了包含用糖基化和未糖基化抗原的muc16糖基化抗体的生 物反应性上清液的相对反应性的详细elisa分析，其中使用15mer和18 mer作为免疫原和筛选抗原靶标。
183.图15a-图15b。muc16糖基化抗体抑制基质胶侵袭。图15a描述了 在存在或不存在来自产生muc16糖基化抗体的生物反应性上清液下表达 phrgfp对照载体或muc16
c114
的skov3细胞的基质胶侵袭。该细胞系是 相对数200的参照系。图15b描述了在存在或不存在纯化的muc16糖基 化抗体下表达phrgfp对照载体或muc16
c114
的skov3细胞的基质胶侵袭。 该细胞系是相对数90的参照系。
184.图16a-图16e。muc16糖基化抗体抑制基质胶侵袭。图16a描述了 表达phrgfp对照载体或指示的muc16
c114
构建体的skov3细胞的基质胶 侵袭，其中存在：(i)对照抗体，(ii)4h11或(iii)muc16糖基化抗体克隆 10c6.e4。图16b描述了使用4h11进行第三轮facs分选后稳定表达phrgfp 对照载体或指示的muc16
c344
构建体的skov3细胞的基质胶侵袭，其中存 在：(i)对照抗体，(ii)4h11或(iii)muc16糖基化抗体克隆10c6.e4。图16c 描述了表达phrgfp对照载体或指示的muc16
c114
构建体的3t3细胞的基质 胶侵袭，其中存在：(i)对照抗体，(ii)4h11或(iii)muc16糖基化抗体克隆 10c6.e4。图16d描述了移植有表达muc16
c344
和用模拟物(muc16
c344
)处理 的或用muc16糖基化抗体10c6.e4(muc16
c344
+10c6.e4)处理的skov3 细胞的无胸腺裸鼠中如肿瘤体积所示的肿瘤生长。箭头指示给药100μg的 muc16糖基化抗体的天数。图16e描述了用指示的抗体染色的人卵巢肿瘤 样品。
185.图17描述了在指示的温度和时间点下内化标记的muc16糖基化抗体 的细胞的百分比。
186.图18a描述了muc16转染子的体外生长曲线。在96孔平底板中用 phrgfp载体对照、表达muc16
c114
(seq id no:133)的phrgfp载体或表达 muc16
c344
(seq id no:132)的phrgfp载体培养1000skov3细胞/孔，并 在37℃下5％co2中孵育5天。每天用alamar blue染色一块板，并在37℃ 下5％co2中孵育4小时。在cytofluor fluorescent读板器中读板。曲线中 未发现统计差异。图18b描述了skov3 phrgfp细胞、 skov3muc16
c114-gfp细胞或skov3-muc16
c344-gfp细胞的基质胶侵袭 分析。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。结果表达为 侵袭细胞的相对数。c114和c344与phrgfp相比统计学上显著。图18c描 述了无胸腺雌性裸鼠中skov3转染子的肿瘤生长。将两百万个肿瘤细胞引 入10只nu/nu小鼠侧腹并观察小鼠的肿瘤形成。每周两次用卡尺测量肿瘤。 与phrgfp肿瘤相比，携带muc16
c344
肿瘤(p《0.0001)和muc16
c114
肿瘤 (p＝0.002)的小鼠的平均肿瘤体积差异在统计学上显著较大。图18a-fig.18c 的缩写：“skov3 phrgfp”和“phrgfp”表示表达对照phrgfp载体的skov3 细胞，“skov3muc16
c114-gfp”和“c114”表示表达muc16
c114
(seq idno:133)的skov3细胞，“skov3muc16
c344-gfp”和“c344”表示表达 muc16
c344
(seq id no:132)的skov3细胞。
187.图19a-图19f描述了muc16表达对skov3卵巢癌细胞的影响。图 19a描绘了用或不用以下处理的表达对照phrgfp对照载体(“phrgfp”)或表 达muc16
c114
(seq id no:133；“c114”)的phrgfp载体的skov3细胞的基 质胶侵袭分析：(1)5μg/ml衣霉素；(2)5μg/ml的对照pfuse蛋白；(3)5 μg/ml的muc16
c57-114-pfuse融合蛋白；或(4)5μg/ml的 117-244
lgals3-pfuse融合蛋白。结果表达为治疗后48小时的侵袭细胞数。 c114细胞比phrgfp细胞侵袭性更强(p《0.0001)。c114细胞的侵袭性不受 使用仅pfuse载体蛋白处理的影响。用衣霉素(n-糖基化抑制剂)处理降低 了c114细胞的侵袭性。用muc16
c57-114-pfuse融合蛋白或 117-244
lgals3-pfuse处理降低了c114细胞的侵袭性(p《0.0001)。图19b描 绘了在存在或不存在薄层(lamelli)对照shrna、mgat5特异性shrna或 lgals3特异性shrna的情况下用phrgfp载体对照(“phrgfp”)或表达 muc16
c114
(seq id no:133)(“c114”)的phrgfp载体转染的skov3细胞的基 质胶侵袭分析。与用shrna处理的phrgfp细胞相比，用mgat5特异性 shrna或lgals3特异性shrna处理的c114细胞侵袭减少。对照shrna 对c114细胞侵袭无影响。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工 计数。图19c描述了skov3-muc16
c114
基质胶侵袭的糖基化依赖性。用 phrgfp对照载体或表达以下muc16突变体的phrgfp载体转染skov3细 胞：c114(seq id no:133)，n1 mut c114(seq id no:151)，n24muc c114 (seq id no:152)，n30 mut c114(seq id no:139)，n1-n24 mut c114(seqid no:153)，n1-n24-n30 mut c114(seq id no:154)。与对照phrgfp细胞 相比，表达c114的细胞显示增加的侵袭。表达c114的细胞的增加的侵袭性 依赖于muc16
c114
(seq id no:133)的氨基酸位点24和30处天冬酰胺的n
‑ꢀ
糖基化。虽然n24和n30都是重要的，但对该作用而言n30位点似乎比 n24位点更为重要。每次测定采用三个平行进行两次或多次，并人工计数。 结果表示为与phrgfp载体对照相比的％。图19d描述了skov3-muc16
c344
基质胶侵袭的糖基化依赖性。用phrgfp对照载体或表达以下muc16突变 体的phrgfp载体转染skov3细胞：c344(seq id no:132)，n24 mut c344 (seq id no:173)，n30 mut c344(seq id no:174)或n24-n30 mut c344 (seq id no:175)。与对照的phrgfp细胞相比，表达c344的细胞显示增加 的侵袭。表达c344的细胞的增加的侵袭性依赖于对应于muc16
c114
(seq idno:133)的氨基酸位点24和30的天冬酰胺的n-糖基化。每次测定采用三个 平行进行两次或多次，并人工计数。图19e描述了muc16表达对所选信 号通路的影响。用或不用对照shrna(“sh薄层”)或针对mgat5(“shmgat5”) 或lgals3(“shlgalls3”)的shrna处理muc16
c114
(seq id no:133)转染 的skov3细胞，并与转染phrgfp载体对照(“phrgfp”)或表达 muc16
c114-n30mut
(seq id no:139)(“n30 mut”)的phrgfp载体的skov3细 胞进行对比，并检测细胞的pakt，perk1/2，psrc和pegf受体(pegfr) 信号通路的活化。muc16
c114
细胞中akt(s473)和erk1/2(pt202/y204)的 磷酸化增加。敲低mgat5(shmgat5)，敲低半乳糖凝集素-3(shlgalls3) 和n30a突变均降低了muc16
c114
诱导的skov3细胞系中的癌基因激活。 图19f描绘了无胸腺雌性裸鼠中的skov3转染肿瘤生长。对于每种情况， 将200万个肿瘤(如下所述)细胞引入10只nu/nu小鼠的侧翼，观察小鼠肿 瘤形成。每周两次用卡尺测量肿瘤。与phrgfp肿瘤细胞相比，c114肿瘤细 胞的体内生长更具侵略性(p《0.0001)。与phrgfp诱导细胞相比， n1-n24-n30-mut c114，c114-sh-mgat5和c114-sh-lgals3肿瘤细胞不显 示生长增强。肿瘤细胞的描述：“phrgfp”表示用phrgfp载体对照转染的 skov3细胞，“c114”表示用表达muc16
c114
(seq id no:133)的phrgfp载 体转染的skov3细胞，“n1-n24-n30-mut c114”表示用表达 muc16
c114-n1-n24-n30-mut
(seq id no:154)的phrgfp载体转染的skov3细胞，
ꢀ“
c114-sh-mgat5”表示用表达muc16
c114
(seq id no:133)的phrgfp载体 转染并用针对mgat5的shrna处理的skov3细胞，“c114-sh-lgals3
”ꢀ
表示用
表达muc16
c114
(seq id no:133)的phrgfp载体转染并用针对 lgals3的shrna处理的skov3细胞。
188.图20a描述了muc16表达对egfr表面表达的影响。在存在或不存 在放线菌酮(chx)处理下24小时检测skov3-phrgfp和skov3-muc16
c114
转染子。显示了基底和chx处理后水平下egfr和muc16表达的几何平 均荧光。skov3-phrgfp样品中的egfr在用chx处理24小时后降低至 未处理水平的58％。在这些细胞中没有显著的muc16表达。相比之下，在 skov3-muc16
c114
细胞中，egfr几何平均荧光增加约25％、降低至chx 暴露后对照的83％。muc16
c114
平均荧光没有被chx显著降低。图20b描 绘了来自总细胞egfr的western印迹的egfr/β-肌动蛋白比例的光密度测 定，说明在用chx处理的skov3-phrgfp细胞中egfr随时间变化的稳定 损失。相比之下，skov3-muc16
c114
细胞中egfr的总水平得以保持，显 示与muc16(
–
)对照细胞系(“phrgfp(-)”)相比egfr更稳定。图20c描述 了用phrgfp对照载体(“稳定phrgfp”)转染的skov3细胞、 skov3-muc16
c114
和skov3-muc16
c114(tet)
四环素诱导型细胞系的基质胶 侵袭分析，其表达为对照细胞侵袭的分数。skov3-muc16
c114(tet)
细胞的四 环素诱导导致与稳定的skov3-muc16
c114
(skov3
c114
)相似的侵袭性表型， 而未诱导的细胞与muc16-phrgfp对照细胞匹配。这种muc16诱导的基 质胶侵袭的增加完全依赖于egfr。当在skov3细胞中引入egfr(shegfr) 发夹rna敲低时，四环素诱导muc16(蛋白质印迹中的4h11阳性蛋白)的 表达，但不增加基质胶侵袭。每个测定进行三个平行，并手工计数。图20d： muc16
c114
(+)和muc16
c114
(
–
)细胞细胞中的egfr稳定性。用chx处理24 小时并探测总细胞egfr的未诱导或四环素诱导的skov3-muc16
c114(tet)
细 胞系的细胞提取物表示为光密度比，并用β-肌动蛋白标准化。四环素诱导 的skov3-muc16
c114
细胞的egfr下降斜率与muc16
c114
(
–
)相比，复制了 muc16
c114
表达的egfr稳定作用。其结果类似于上述图20b所示的稳定 转染的效果。
189.图21描述了用放线菌酮处理24小时的未诱导或四环素诱导的 skov3
c114
细胞系(分别为“未诱导的muc16
c114”和“tet诱导的muc16
c114”) 的细胞提取物的印迹分析的光密度测定。对蛋白质印迹探测了pegfr，并 将蛋白质水平标准化为β-肌动蛋白水平。与未诱导的skov3
c114
细胞系相 比，四环素诱导的skov3
c114 pegfr信号的斜率显示出稳定的pegfr。
190.图22a-图22c描述了muc16胞外域n-糖基化种类的鉴定和化学合成。 图22a：用表达n1-n24突变的muc16
c114
(seq id no:seq id no:153)的 phrgfp转染的skov3细胞的n-聚糖谱图。在佐治亚大学复合碳水化合物 研究中心(complex carbohydrate research center,university of georgia)，通 过总离子作图检测和鉴定了聚糖。三角形：岩藻糖；方块：n-乙酰葡萄糖 胺；圆圈，深色填充：甘露糖；圆圈，浅色填充：半乳糖；菱形：n-乙酰 神经氨酸。图22b描述了在n30位点具有单壳二糖(glcnac2)聚糖的 55-mermuc16抗原的示意结构。该n-糖肽抗原用于免疫小鼠以产生抗体。 氨基酸序列如seq id no：129所示。方块代表n-乙酰葡糖胺；圆圈表示 甘露糖。图22c分别描绘了在n30位点用壳二糖单糖基化的klh-缀合的 15-mermuc16抗原和在n24和n30位点用两个壳二糖单元双糖基化的 klh-缀合的18-mermuc16抗原的示意结构。随后将这些n-糖肽-klh构 建体用于免疫小鼠以产生针对muc16胞外域内的glcnac
2-肽表位的单克 隆抗体。还包括了muc16无关糖肽和非糖基化的muc16肽2以得到4h11 单克隆抗体的序列。klh-15-mer(壳二糖)[c-g25-v38]的氨基酸序列如seqid no：131所示。klh-18-mer(壳二糖)2[c-t22-v38]的氨基酸序列如seq idno：130所示。muc16非糖基化肽2的氨基酸序列如seq id no：168所 示。muc16无关肽18mer和muc16
id no:132，“skov3
c344”)的phrgfp或用表达 muc16
c114
(seq id no:133，“skov3
c114”)的phrgfp转染的skov3细胞的 免疫荧光染色，egfr-a647和4h11-pe用于muc16或两种试剂 egfr-a647和4h11-pe组合用于muc16。显微图像(50μm比例尺)表明所 有三种细胞系中egfr和muc16
c114
的共定位(参见箭头)。图24c描述了 三种糖基化的蛋白(整联蛋白β1myc-ddk，muc16
c57-114-pfuse和 lgals3myc-ddk)的免疫印迹(ib)和免疫沉淀(ip)。使用与图24a中大致 相同的方法。免疫印迹的western印迹分析和所有免疫沉淀的样品在10％ sds-page凝胶上运行，转移至硝酸纤维膜上并用抗4c5-ddk检测整联蛋 白β1或用抗4h11-hrp或抗4c5-ddk检测lgals3抗体。对于egfr， 需要所有三种蛋白来共沉淀整联蛋白β1蛋白。muc16糖基化抗体18c6也 阻断muc16、lgals3和整联蛋白β1的组合，如三条右侧的泳道所示。 图24d描述了muc16和整联蛋白β1蛋白的共定位。野生型ovcar3细 胞或用表达muc16
c344
(seq id no:132，“skov3
c344”)的phrgfp或用表达 muc16
c114
(seq id no:133，“skov3
c114”)的phrgfp转染的skov3细胞的 免疫荧光染色，整联蛋白β1-a647或4h11-pe用于muc16或两种试剂整 联蛋白β1-a647或4h11-pe的组合用于muc16。显微图像(50μm比例尺) 表明ovcar3，skov3
c344
和skov3
c114
细胞中整联蛋白β1和muc16的 共定位(参见箭头)。
[0193]
图25a描述了野生型ovcar3细胞或用表达muc16
c344
(seq idno:132，“skov3
c344”)的phrgfp或表达muc16
c114
(seq id no:133，
ꢀ“
skov3
c114”)的phrgfp转染的skov3细胞或skov3
c344
或skov3
c114
细 胞系的免疫荧光染色，egfr-a647或4h11-pe或两种试剂的组合用于 muc16。显微图像(比例尺100μm)清晰表明了egfr和muc16的共定位 (参见箭头)。图25b：野生型ovcar3或skov3
c344
或具有整联蛋白β1-a647 或4h11-pe用于muc16的细胞系或两种试剂的组合的免疫荧光染色。显 微图像(比例尺100μm)清晰表明了整联蛋白β1和muc16的共定位(参见 箭头)。
[0194]
图26a-图26d描述了muc16肿瘤促进的模型。图26a描述了 egfr-lgals3-muc16和lgals3-整联蛋白β1-muc16的关系图。通过 egfr的src/erk/akt信号传导或通过整联蛋白β1的src/fak信号传 导依赖于muc16和与lgals3五聚体的信号-分子相互作用。图26b描述 了糖基化缺失的模型：在shmgat5-转染的细胞系中，muc16，egfr和 整联蛋白β1上的位点的n-糖基化由于四触角(tetra-antennary)结构的缺失而 降低，导致不结合lgals3。图26c描述了半乳糖凝集素-3缺失的模型： 在shlgals3转染的细胞系中，虽然muc16上存在n-糖基化位点，但是 与lgals3结合的缺失导致不能muc16/egfr或muc16/整联蛋白β1关 联，并减少了由内向外的信号。图26d描述了muc16/lgals3相互作用 的潜在抑制剂的模型。暴露于muc16糖基化抗体或“假的”模拟受体(抗 muc16
c57-114
pfuse或
117-244
lgals3-pfuse)的muc16(+)细胞不能结合 lgals3凝胶，并随之不能结合egfr或整联蛋白β1。
[0195]
图27a描述了侧链保护的n-乙酰化的55-mer肽酰胺(seq idno:129)。图27b描述了糖肽p55-mer[n1-s55]来自uplc分析的esi-ms 和uv示踪(trace)。计算值c
486h760n84o111
s8，9812.25(平均同位素) [m+5h]
5+
m/z 1963.45，测试值(found)1963.20，[m+6h]
6+
m/z 1636.38，测 试值1636.24，[m+7h]
7+
m/z 1402.75，测试值1402.74。beh c4柱，梯度： 80-99％乙腈/水超过6分钟，流速0.3ml/min。
[0196]
图28a描述了携带壳二糖的55-mer糖肽：“55-mer(壳二糖)[n1-s55]
”ꢀ
(glcnac
2-55-mer)(seq id no:129)。图28b描述了糖肽“55mer(壳二糖) [n1-s55]”(glcnac
2-55-mer)来自uplc分析的esi-ms和uv示踪。计算 值c
291h463n87o97
s，6764.38(平均同位素)[m+
4h]
4+
m/z 1692.10，测试值 1692.01，[m+5h]
5+
m/z 1353.88，测试值1353.86，[m+6h]
6+
m/z 1128.40， 测试值1128.41，[m+7h]
7+
m/z 967.34，测试值967.45，[m+8h]
8+
m/z 846.55， 测试值846.27。beh c4柱，梯度：20-40％乙腈/水超过6分钟，流速0.3 ml/min。
[0197]
图29a描述了携man3glcnac2的55-mer糖肽：
ꢀ“
55-mer(man3glcnac2)[n1-s55]”(man3glcnac
2-55-mer)(seq id no:129)。 图29b描述了糖肽“55mer(man3glcnac2)[n1-s55]”(man3glcnac
2-55-mer) 来自分析级hplc分析的esi-ms和uv示踪。计算值c
309h493n87o112
s， 7250.80(平均同位素)[m+4h]
4+
m/z 1813.70，测试值1813.52，[m+5h]
5+
m/z 1451.16，测试值1451.02，[m+6h]
6+
m/z 1209.47，测试值1209.33，[m+7h]
7+ m/z 1036.83，测试值1036.74。waters x-bridge c18柱，梯度：25-35％乙腈 /水超过30分钟，流速0.2ml/min。
[0198]
图30a描述了侧链保护的15-mer肽(p15-mer[c-g25-v38])(seq idno:131)。图30b描述了壳二糖-单糖基化的15-mer糖肽：15-mer(壳二 糖)[c-g25-v38](glcnac
2-15-mer)(seq id no:132)。图30c描述了糖肽“15 mer(壳二糖)[c-g25-v38]”(glcnac
2-15-mer)来自分析级hplc分析的的 esi-ms和uv示踪。计算值c
87h142n24o35
s，2116.26(平均同位素) [2m+3h]
3+
m/z 1411.84，测试值1412.02，[m+2h]
2+
m/z 1059.13，测试值 1059.15，[m+3h]
3+
m/z 706.42，测试值706.46。varian microsorb 300-5 c18 柱，梯度：15-30％乙腈/水超过30分钟，流速0.2ml/min。
[0199]
图31a描述了侧链保护的18-mer肽(p18-mer[c-g22-v38])(af-i-165) (seq id no:130)。图31b描述了壳二糖-双糖基化的18-mer糖肽：“18-mer(壳 二糖)2[c-t22-v38]”[(glcnac2)
2-18-mer](seq id no:130)。图31c描述了 来自糖肽“18mer(壳二糖)2[c-t22-v38]”[(glcnac2)
2-18-mer]的分析级 hplc分析的esi-ms和uv示踪。计算值c
117h193n33o50
s，2894.04(平均 同位素)[2m+3h]
3+
m/z 1930.36，测试值1930.22，[m+2h]
2+
m/z 1448.02， 测试值1447.65，[m+3h]
3+
m/z 965.68，测试值965.25。varian microsorb 300-5 c8柱，梯度：15-30％乙腈/水over 30minute，流速0.2ml/min。
[0200]
图32a描述了糖肽“15-mer(壳二糖)[c-g25-v38]”，缀合至klh(seq idno:131)。图32b描述了糖肽“18-mer(壳二糖)2[c-t22-v38]”，缀合至klh (seq id no:130)。
[0201]
5.发明详述
[0202]
本文提供了抗体及其抗原结合片段和包括该抗体或片段的多肽，例如 融合蛋白，缀合物，和/或嵌合抗原受体，以及表达其的细胞。抗体和片段 中是那些特异性结合muc16蛋白表位的。该抗体在本文中称为“muc16糖 基化抗体”。该表位通常是位于表位muc16分子胞外部分或基本位于其胞 外部分之内的，通常为非脱落(shed)形式的muc16，在一些实施方案中， 表位不位于muc16的串联重复区域和/或分泌形式的muc16之内，或抗体 或片段不结合muc16的串联重复区域和/或分泌形式的muc16。在一些实 施方案中，表位位于muc16c114之内或包括muc16c114之内的残基，并 典型的包括其中的一个或多个糖基化的残基或糖基化位点。在一些实施方 案中，表位包括一个或多个糖基化位点，例如用于n-糖基化的位点。在一 些方面，该表位包括对应如seq id no:150所示的muc16序列(和/或其糖 基化形式)的asn1806或asn1800的天冬酰胺残基；在一些方面，在一些方 面，表位包括对应seq id no:150的asn1806天冬酰胺残基，但不包括对 应seq id no:150的asn1800天冬酰胺残基，在一些方面，表位包括对应 seq id no:150的asn1800天冬酰胺残基，但不包括对
应seq id no:150 的asn1806天冬酰胺残基。在一些该实施方案的任何一个，该一个或多个 天冬酰胺是糖基化的，例如n-糖基化的。在一些实施方案中，抗体或片段 结合seq id no:131之内的表位或包括seq id no:131之内的残基的表位， 结合seq id no:130之内的表位或包括seq id no:130之内的残基的表位， 或其组合，在一些实施方案中，抗体或片段不免疫特异性结合对应seq idno:168的muc16区域内或seq id no:168的残基2-19内。
[0203]
在一个方面，本文提供了抗体(例如，单克隆抗体)和其抗原结合片 段，其(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形 式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不 能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未 糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139和(iii)抑制重 组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。在另一方面， 本文提供了抗体(例如，单克隆抗体)和其抗原结合片段，其(i)免疫特异性 结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其 中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)不能免疫特异性结合重 组表达第三形式的muc16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三 形式的氨基酸序列是seq id no:139和(iii)抑制重组表达所述第一形式的 muc16的细胞的体外基质胶侵袭。在一个优选实施方案中，本文描述的 muc16糖基化抗体及其抗原结合片段免疫特异性结合包含seq id no:150 的氨基酸残基1806(asn1806)的表位，其中asn1806是n-糖基化的(本文中 称为“asn1806糖基化”)。如本文第6节的实施例所示，asn1806糖基化对 于muc16介导的侵袭和肿瘤细胞生长是必须的。从而，本文描述的muc16 糖基化抗体及其抗原结合片段能够结合封闭该侵袭和肿瘤细胞生长。
[0204]
在一个实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段除了n-糖基 化的asn1806外还需要n-糖基化的asn1800以结合muc16(即，两种n
‑ꢀ
糖基化位点都是muc16糖基化抗体或其抗原结合片段所识别的表位的一 部分)。“asn1800”表示seq id no:150的氨基酸残基1800。该muc16糖 基化抗体或其抗原结合片段可通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重 组表达第一形式的muc16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中 第一形式的氨基酸序列是seq id no:133和(ii)其不能免疫特异性结合重 组表达第五形式的muc16的细胞，其第五形式是糖基化的，且其中第五形 式的氨基酸序列是seq id no:172，其中重组表达第一形式的muc16的细 胞与重组表达第五形式的muc16的细胞是相同细胞类型。
[0205]
在一个实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段需要n-糖基 化的asn1806但不需要n-糖基化的asn1800以结合muc16(即，n-糖基 化的asn1806是muc16糖基化抗体或其抗原结合片段所识别表位的一部 分，但n-糖基化的asn1800不是muc16糖基化抗体或其抗原结合片段所 识别表位的一部分)。该muc16糖基化抗体或其抗原结合片段可通过下述 进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞的能 力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第三形式的muc16的细胞， 该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是seq id no:139； 和(iii)其免疫特异性结合重组表达第四形式的muc16的细胞的能力，其第 四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是seq id no:152和(iii) 其中重组表达第一形式的muc16的细胞、重组表达第三形式的muc16的 细胞和重组表达第四形式的muc16的细胞是相同细胞类型。
[0206]
由seq id no:133的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为 muc16
c114
，其由成熟muc16的c端114个氨基酸残基(seq id no:150为 成熟muc16的序列)组成。muc16
c114
能够在seq id no:133的天冬酰胺 氨基酸残基位点1，24和30被n-糖基化(对应于氨基酸位点seq id no:150 的asn1777，asn1800和asn1806)。
[0207]
由seq id no:139的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为 muc16
c114-n3
。muc16
c114-n3
由成熟muc16的c端114个氨基酸残基(seqid no:150为成熟muc16的序列)组成，除了氨基酸位点30的天冬酰胺 (对应seq id no:150的氨基酸位点1806)被突变为丙氨酸。从而，muc16
c114-n3
不能在seq id no:139的氨基酸位点30被n-糖基化(对应氨 基酸位点seq id no:150的asn1806)。
[0208]
由seq id no:152的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为 muc16
c114-n2
。muc16
c114-n2
由成熟muc16的c端114个氨基酸残基(seqid no:150为成熟muc16的序列)组成，除了氨基酸位点24的天冬酰胺 (对应氨基酸位点seq id no:150的asn1800)被突变为丙氨酸。从而， muc16
c114-n2
不能在seq id no:152的氨基酸位点24被n-糖基化(对应氨 基酸位点seq id no:150的asn1800)。
[0209]
由seq id no:172的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为 muc16
c114-n23
。muc16
c114-n23
由成熟muc16的c端114个氨基酸残基(seqid no:150为成熟muc16的序列)组成，除了氨基酸位点24和30的天冬酰 胺(对应于seq id no:150的氨基酸位点asn1800和asn1806)被突变为丙 氨酸。从而，muc16
c114-n23
不能在seq id no:157的氨基酸位点24和30 被n-糖基化(对应于seq id no:150的氨基酸位点asn1800和asn1806)。
[0210]
本文还提供了重链和轻链，其中包含所述重链和轻链的muc16糖基化 抗体或其抗原结合片段：(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的 细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其 第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139； 并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。本 文还提供了包含核酸序列(例如，互补dna(cdna))的多核苷酸(例如，分 离的多核苷酸)，其编码该抗体及其抗原结合片段，重链或轻链。进一步的， 本文提供了载体(例如，表达载体)和细胞(例如，分离的细胞或离体细胞) 包含含有核酸序列(例如，互补dna(cdna))的多核苷酸(例如，分离的多 核苷酸)，所述核酸序列编码该抗体及其抗原结合片段，重链或轻链。本文 还提供了制备该抗体，其抗原结合片段，重链，轻链，载体和细胞的方法。 在其它方面，本文提供了用于muc16活性和/或muc16-驱动的肿瘤生长 或治疗或管理某些本文描述的病况或疾病的方法和用途，例如治疗和管理 癌症。还提供了相关组合物(例如，药物组合物)，试剂盒和诊断方法。
[0211]
如本文使用的术语“muc16”或“muc16多肽”或“muc16肽”表示yinbw和lloyd ko，2001，j biol chem.276(29):27371-5中所述的muc16拴 粘蛋白。genbank
tm
登录号nm_024690.2(seq id no:137)提供了示例性 的人muc16核酸序列。genbank
tm
登录号np_078966.2(seq id no:136) 提供了示例性的人muc16氨基酸序列。原始muc16包含胞内域，跨膜域， 邻近推测的裂解位点的胞外域和大的、高度糖基化的12-20重复区，每区156个氨基酸长(图1a)。“不成熟的”muc16指seq id no:136，其包含 muc16信号序列(seq id no:136的氨基酸残基1-60)。“成熟muc16”表示 如细胞表面上表达的原始muc16，即，其中信号
序列已被细胞加工所去除， 例如，seq id no:150，其中seq id no:136的前60个氨基酸残基被去除 (即，seq id no:136是“不成熟”形式的muc16)。
[0212]
对于抗体命名，(i)18c6和18c6.d12可交换使用，(ii)10c6和10c6.e4 可交换使用，(iii)19c11和19c11.h6可交换使用，(iv)7b12和7b12.b3可 交换使用。抗体亚克隆(即，18c6.d12，10c6.e4，19c11.h6和7b12.b3)被 用于第6节中描述的实验。
[0213]
5.1抗体
[0214]
muc16糖基化抗体或其抗原结合片段可以包括，例如，单克隆抗体、 多克隆抗体、重组产生的抗体、特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性 抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两 个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗 体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链抗体重链对、体内抗体、单结 构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链可变片段(scfv)、骆驼化抗体、亲和 体和二硫键连接的fv(dsfv)或其片段。这样的抗体可以通过本领域已知的 方法制备。
[0215]
多特异性抗体或其片段是指可以同时结合至少两个不同结构的靶的抗 体或其片段，例如两个不同的抗原，相同抗原或半抗原和抗原或表位上的 两个不同的表位。一种特异性可以是例如b细胞、t细胞、骨髓样细胞、 血浆样细胞或肥大细胞抗原或表位，例如cd3。另一特异性可以是相同或 不同细胞类型上的不同抗原，例如muc16。多特异性多价抗体是具有多 于一个结合位点的构建体，并且结合位点具有不同的特异性，例如双特异 性双抗体，其中一个结合位点与一个抗原反应，另一个与另一个抗原反应。
[0216]
双特异性抗体是可以同时结合两个具有不同结构的靶的抗体。双特异 性抗体(bsab)和双特异性抗体片段(bsfab)具有至少一个免疫特异性结合至 第一靶标的臂，例如muc16，以及至少一个其他免疫特异性结合第二靶标 的其它臂，例如cd3。可以使用分子工程生产各种双特异性融合蛋白。在 一种形式中，双特异性融合蛋白是二价的，由例如(i)具有一个抗原的单一 结合位点的scfv和(ii)具有针对第二抗原的单个结合位点的抗体或fab片段 组成。在另一种形式中，双特异性融合蛋白是四价的，由例如具有两个针 对一个抗原的结合位点和两个针对第二抗原的相同scfv的igg组成。参见 例如国际公开号wo 2011/1160119，其全部内容通过引用并入本文。
[0217]
最近用于产生双特异性单克隆抗体的方法包括使用工程重组单克隆抗 体，其具有额外的半胱氨酸残基，使得它们比更常见的免疫球蛋白同种型 交联更强。参见例如fitzgerald等人，protein eng.10(10):1221-1225，1997。 另一种方法是设计连接具有所需双重特异性的两种或多种不同单链抗体或 抗体片段区段(segment)的重组融合蛋白。参见例如coloma等，naturebiotech.15:159-163，1997。可以使用分子工程生产各种双特异性融合蛋白。
[0218]
连接两个或多个不同单链抗体或抗体片段的双特异性融合蛋白可以以 相似的方式制备。重组方法可用于产生多种融合蛋白。在某些方面，柔性 接头将scfv(例如靶向cd3的scfv)连接到单克隆抗体(例如，本文所述的 muc16糖基化抗体，参见5.1)的轻链恒定区。通过pcr反应将重链fc与 scfv的框内连接所需的合适的接头序列引入vl和vκ域。然后将编码scfv 的dna片段连接到含有编码chi结构域的dna序列的分段(staging)载体 中。将所得构建体切下并连接到含有编码抗体(例如，muc16糖基化抗 体)vh区的dna序列的载体中。所得到的载体可用于转染合适的宿主细胞， 例如用于表达双特异性融合蛋白的哺乳动物细
胞。
[0219]
在某些实施方案中，本文所述的muc16糖基化抗体(见第5.1节)及其 片段也可用于制备也称为双抗体的功能性双特异性单链抗体(bscab)，并且 可以使用重组方法在哺乳动物细胞中产生。参见，例如，mack等人，proc. natl.acad.sci.，92：7021-7025，1995，通过引用并入本文。例如，可以通 过使用重组方法通过甘氨酸-丝氨酸接头连接两个单链fv片段来产生 bscab。使用本领域已知的标准pcr方法分离两种感兴趣的抗体的vl和 vh结构域。双特异性单链抗体和双特异性融合蛋白包括在本发明的范围 内。
[0220]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 表示scfv。scfv是本领域公认的术语。scfv包含免疫球蛋白重链可变区(vh) 和轻链可变区(vl)的融合蛋白，其中该融合蛋白保留与完整免疫球蛋白相 同的抗原特异性。vh通过肽接头融合到vl。在某些实施方案中，肽接头 为5-25、5-15、10-20、10-15或15-25个氨基酸残基长。在某些实施方案中， scfv肽接头显示适合作为本领域技术人员已知的肽接头的一个或多个特 征。在某些实施方案中，scfv肽接头包含允许scfv肽接头可溶性的氨基酸， 例如，例如，丝氨酸和苏氨酸。在某些实施方案中，scfv肽接头包含允许 scfv肽接头柔性的氨基酸，例如，例如，甘氨酸。在某些实施方案中，scfv 肽接头将vh的n端连接至的vl c端。在某些实施方案中，scfv肽接头 可以将vh的c端连接至vl的n端。
[0221]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 表示嵌合抗原受体(car)。car是本领域公认的术语。car可以靶向肿瘤 相关抗原(例如，muc16)。本文提供的car通常包含来源于muc16糖基 化抗体的scfv；跨膜域，其在一些实施方案中为t细胞共刺激分子来源的 跨膜域(例如来源于cd28、cd8、cd38、ox-40或4-1bb的跨膜域)；和 初级信号域，例如t细胞受体(tcr)ζ链胞质信号域。在一些实施方案中， car还包括一个或多个另外的区域或结构域，例如一个或多个间隔区 (spacer)或接头，包括细胞外间隔区，例如来源于抗体或其它细胞表面分子 的间隔区，例如包含一个或多个抗体ch2、ch3和/或铰链区的间隔区，或 来源于cd28分子或cd8分子的间隔区或其它间隔区。本文还提供了细胞， 例如工程化以表达该car的t细胞，例如重组表达该car的t细胞。表 达car的t细胞在识别表达muc16的肿瘤时，优选诱导这种肿瘤的细胞 的t细胞活化、增殖和/或裂解。
[0222]
muc16糖基化抗体可以是任何类型(type)(例如，igg、ige、igm、 igd、iga或igy)、任何类别(class)(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1或iga2)或任何亚类(subclass)(例如，igg
2a
或igg
2b
)的免疫球蛋白分子。在 某些实施方案中，本文描述的抗体是igg抗体或其一个类别或亚类。在某 些实施方案中，本文描述的抗体是igg1抗体。在某些实施方案中，本文描 述的抗体是igg2抗体。在某些实施方案中，本文描述的抗体是igg
2a
抗体。 在某些实施方案中，本文描述的抗体是igg
2b
抗体。在某些实施方案中，本 文描述的抗体是igg
2a
和igg
2b
抗体的混合物。在具体实施方案中，抗体是 人源化形式的啮齿类单克隆抗体。
[0223]
在具体实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段所结合的 抗原是一种形式的糖基化muc16，例如，其中该形式的muc16的氨基酸 序列是seq id no:133。由seq id no:133的氨基酸序列编码的蛋白在本 文中也称为muc16
c114
，其由成熟muc16 c末端114个氨基酸残基组成。 muc16
c114
能够在seq id no:133的位点1、24和30的天冬酰胺氨基酸(对 应于seq id no:150的氨基酸位点asn1777，asn1800和asn1806)处n-糖 基化。成熟muc16(seq id no:150)表示全长muc16，其中信号序列被去 除且其中信号序列由seq id no:136
的前60个氨基酸残基组成(即，seqid no:136是“不成熟的”形式的muc16)。
[0224]
muc16糖基化抗体的抗原结合片段可以是fab片段、f(ab’)2片段或 muc16糖基化抗体的一部分，其包含赋予muc16糖基化抗体其抗原特异 性的氨基酸残基(例如，互补决定区(cdr))。muc16糖基化抗体可来自任 何动物品种，例如啮齿类(例如，小鼠，大鼠或仓鼠)和人。
[0225]
如本文使用的，术语“可变区”或“可变域”可交换使用，并是本领域常规 的。可变区通常表示抗体的一部分，一般为轻链或重链的一部分，通常是 成熟重链氨基末端约110-120个氨基酸和成熟轻链氨基末端约90-100个氨 基酸，其序列在不同抗体中显著不同，并被用于特定抗体针对其特定抗原 的结合和特异性。序列中的变化在称为互补决定区(cdr)的那些区域内集 中，可变区中更为高度保守的区域称为框架区(fr)。cdr的两侧是fr。一 般，cdr和fr的n末端到c末端方向的空间定位如下： fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。不希望受任何特定机理或理论的约 束，我们相信轻链和重链cdr主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。 在某些实施方案中，可变区是啮齿类(例如，小鼠或大鼠)可变区。在某些 实施方案中，可变区是人可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿类(例 如，小鼠或大鼠)cdr和人框架区(fr)。在具体实施方案中，可变区是灵长 类(例如，非人灵长类)可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿类或鼠 类cdr和灵长类(例如，非人灵长类)框架区(fr)。
[0226]
cdr在本领域以多种方式定义，包括kabat、chothia和imgt和示例 定义。kabat定义基于序列可变性(kabat，elvin a.等，sequences of proteinsof immunological interest.bethesda:national institutes of health,1983)。对于 kabat编号系统，(i)vh cdr1通常位于重链氨基酸位点31-35，其可选的 可包括氨基酸位点35之后一个或两个另外的氨基酸(在kabat编号方案中指 35a和35b)，(ii)vh cdr2通常位于重链氨基酸位点50-65，(iii)vh cdr2 通常位于重链氨基酸位点95-102(kabat，elvin a.等，sequences of proteinsof immunological interest.bethesda:national institutes of health,1983)。对于 kabat编号系统，(i)vl cdr1通常位于轻链氨基酸位点24-34，(ii)vlcdr2通常位于轻链氨基酸位点50-56，(iii)vl cdr3通常位于轻链氨基酸 位点89-97(kabat，elvin a.等，sequences of proteins of immunologicalinterest.bethesda:national institutes of health,1983)。如本领域技术人员熟 知的，使用kabat编号系统，由于fr和/或cdr的缩短和延长，抗体可变 区的实际线性氨基酸序列可以包含更少或额外的氨基酸，从而，氨基酸的 kabat编号不必与其线性氨基酸编号相同。
[0227]
chothia定义是基于结构性环区域的位置(chothia等，(1987)j molbiol 196：901-917和美国专利号7,709,226)。术语“chothia cdr”和相似术 语是本领域认可的，表示根据chothia和lesk，1987，j.mol.biol.， 196:901-917的方法确定的抗体cdr序列，其在本文中称为“chothiacdr”(也参见，例如，美国专利号7,709,226和kontermann和d
ü
bel编写 的antibody engineering，第31章，pp.422-439，springer-verlag，berlin(2001) 中的martin，a.，“protein sequence and structure analysis of antibodyvariable domains”。对于chothia编号系统，使用对vh区氨基酸残基进行 编号的kabat编号系统，(i)vh cdr1通常位于重链氨基酸位点26-32，(ii) vh cdr2通常位于重链氨基酸位点53-55，(iii)vh cdr3通常位于重链氨 基酸位点96-101。在具体实施方案中，对于chothia编号系
统，使用对vh 区氨基酸残基进行编号的kabat编号系统，(i)vh cdr1通常位于重链氨 基酸位点26-32或34，(ii)vh cdr2通常位于重链氨基酸位点52-56(在一 个实施方案中，cdr2位于位点52a-56，其中52a在位点52后)，(iii)vhcdr3通常位于重链氨基酸位点95-102(在一个实施方案中，位点编号 96-100处没有氨基酸)。对于chothia编号系统，使用对vl区氨基酸残基 进行编号的kabat编号系统，(i)vl cdr1通常位于轻链氨基酸位点26-33， (ii)vl cdr2通常位于轻链氨基酸位点50-52，(iii)vl cdr3通常位于轻链 氨基酸位点91-96。在具体实施方案中，对于chothia编号系统，使用对vl 区氨基酸残基进行编号的kabat编号系统，(i)vl cdr1通常位于轻链氨 基酸位点24-34，(ii)vl cdr2通常位于轻链氨基酸位点50-56和(iii)vlcdr3通常位于轻链氨基酸位点89-97(在一个实施方案中，位点编号96-100 处没有氨基酸)。这些chothia cdr位点可根据抗体不同发生变化，并可根 据本领域已知的方法确定。
[0228]
imgt定义来自于imgt("国际immunogenetics网址imgt.org，建立者和主管：marie-paule lefranc，montpellier，france， 参见，例如，lefranc，m.-p.，1999，the immunologist，7:132-136和 lefranc，m.-p.等，1999，nucleic res.，27:209-212，其均在此全文引入作 为参考)。对于imgt编号系统，(i)vh cdr1通常位于重链氨基酸位点 25-35，(ii)vh cdr2通常位于重链氨基酸位点51-57，(iii)vh cdr2通常 位于重链氨基酸位点93-102。对于imgt编号系统，(i)vl cdr1通常位于 轻链氨基酸位点27-32，(ii)vl cdr2通常位于轻链氨基酸位点50-52，(iii) vl cdr3通常位于轻链氨基酸位点89-97。
[0229]
5.1.1序列和结构
[0230]
在某些实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段，其包含本文提供的muc16糖基化抗体的任何vh cdr，例如，如表 1、3和5所示。在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段包含muc16糖基化抗体vh cdr1，如表1、3或5所示。在 某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含 muc16糖基化抗体vh cdr2，如表1、3或5所示。在某些实施方案中， 本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含muc16糖基化抗体 vh cdr3，如表1、3或5所示。在某些实施方案中，本文提供的muc16 糖基化抗体或其抗原结合片段包含1个、2个或全部3个的muc16糖基化 抗体vh cdr，如表1、3或5所示(例如，表1第2行的vl cdr，例如， 抗体10c6的所有vh cdr)。
[0231]
在某些实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段，其包含本文提供的抗muc16抗体的任何vl cdr，例如，如表2、4 和6所示。在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结 合片段包含muc16糖基化抗体vh cdr1，如表2、4或6所示。在某些实 施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含muc16 糖基化抗体vh cdr2，如表2、4或6所示。在某些实施方案中，本文提 供的抗muc16抗体或其抗原结合片段包含muc16糖基化抗体vh cdr3， 如表2、4或6所示。在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段包含表2、4或6中1个、2个或全部3个的muc16糖 基化抗体vl cdr(例如，表2第2行的vl cdr，例如，抗体10c6的所 有vh cdr)。
[0232]
表1.vh cdr氨基酸序列(kabat).
[0233][0234]
表2.vl cdr氨基酸序列(kabat).
[0235][0236][0237]
表3.vh cdr氨基酸序列(chothia).
[0238][0239]
表4.vl cdr氨基酸序列(chothia).
[0240][0241][0242]
表5.vh cdr氨基酸序列(imgt).
[0243][0244]
表6.vlcdr氨基酸序列(imgt).
[0245][0246]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：
[0247]
(a)vhcdr1，包含氨基酸序列tx1gmgvg(seqidno:103)，其中x1是l或v，
[0248]
(b)vhcdr2，包含氨基酸序列hiwwddx2dkyyx3palks
[0249]
(seqidno:104)，其中x2是e或不存在且x3是y或n，和
[0250]
(c)vhcdr3，包含氨基酸序列igtaqatdaldy(seqidno:105)。
[0251]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：
[0252]
(d)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx8tx9gm(seqidno:109)，其中x8是n或s且x9是l或v，
[0253]
(e)vhcdr2，包含氨基酸序列wddx
10
(seqidno:110)，其中x
10
是e或不存在，和
[0254]
(f)vhcdr3，包含氨基酸序列gtaqatdald(seqidno:111)。
[0255]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：
[0256]
(g)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx
15
tx
16
gmg(seqidno:115)，其中x
15
是n或s且x
16
是v或l，
[0257]
(h)vhcdr2，包含氨基酸序列iwwddx
17
dk(seqidno:116)，其中x
17
是e或不存在，和
[0258]
(i)vhcdr3，包含氨基酸序列x
18
rigtaqatdaldy(seqidno:117)，其中x
18
是t，a或s。
[0259]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:3的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:4的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:5的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:9的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:10的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:11的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:15的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:16的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:17的氨基酸序列。
[0260]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:23的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:24的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:25的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:29的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:30的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:31的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:35的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:36的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:37的氨基酸序列。
[0261]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:43的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:44的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:45的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:49的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:50的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:51的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:55的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:56的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:57的氨基酸序列。
[0262]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:63的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:64的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:65的氨基酸序列。在具体实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:69的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:70的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:71的氨基酸序列。在具体实施
方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:75的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:76的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:77的氨基酸序列。
[0263]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:83的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:84的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:85的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:89的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:90的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:91的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:95的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:96的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:97的氨基酸序列。
[0264]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：
[0265]
(j)vlcdr1，包含氨基酸序列rsskslx4x5sngntyly(seqidno:106)，其中x4是r或l且x5是k或h，
[0266]
(k)vlcdr2，包含氨基酸序列ymsnlas(seqidno:107)，和
[0267]
(l)vlcdr3，包含氨基酸序列mqx6lex7plt(seqidno:108)，其中x6是g或s且x7是h或y。
[0268]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：
[0269]
(m)vlcdr1，包含氨基酸序列kslx
11
x
12
sngnty(seqidno:112)，其中x
11
是l或r且x
12
是h或k，
[0270]
(n)vlcdr2，包含氨基酸序列yms(seqidno:113)，和
[0271]
(o)vlcdr3，包含氨基酸序列x
13
lex
14
pl(seqidno:114)，
[0272]
其中x
13
是g或s且x
14
是h或y。
[0273]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：
[0274]
(p)vl互补决定区(cdr)1，包含氨基酸序列
[0275]
kslx
19
x
20
sngnty(seqidno:118)，其中x
19
是v或l且x
20
是h或k，
[0276]
(q)vlcdr2，包含氨基酸序列yms(seqidno:119)，和
[0277]
(r)vlcdr3，包含氨基酸序列mqsleyplt(seqidno:120)。
[0278]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:6的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:7的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:8的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：vlcdr1，包含seqidno:12的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:13的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:14的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：vlcdr1，包含seqidno:18的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:19的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:20的氨基酸序列。
[0279]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:26的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:27的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:28的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:32的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:33的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:34的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：vlcdr1，包含seqidno:38的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:39的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:40的氨基酸序列。
[0280]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:46的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:47的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:48的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:52的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:53的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:54的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:58的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:59的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:60的氨基酸序列。
[0281]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:66的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:67的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:68的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:72的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:73的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:74的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:78的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:79的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:80的氨基酸序列。
[0282]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:86的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:87的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:88的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:92的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:93的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:94的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:98的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:99的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:100的氨基酸序列。
[0283]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：
[0284]
(i)vh，其包含：
[0285]
(a)vhcdr1，包含氨基酸序列tx1gmgvg(seqidno:103)，其中x1是l或v，
[0286]
(b)vhcdr2，包含氨基酸序列hiwwddx2dkyyx3palks(seqidno:104)，其中x2是e或不存在且其中x3是y或n，和
[0287]
(c)vhcdr3，包含氨基酸序列igtaqatdaldy(seqidno:105)，和(ii)vl，其包含：
[0288]
(d)vlcdr1，包含氨基酸序列rsskslx4x5sngntyly(seqidno:106)，其中x4是r或l且其中x5是k或h，
[0289]
(e)vlcdr2，包含氨基酸序列ymsnlas(seqidno:107)，和
[0290]
(f)vlcdr3，包含氨基酸序列mqx6lex7plt(seqidno:108)，其中x6是g或s且其中x7是h或y。
[0291]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含
[0292]
(i)vh，其包含：
[0293]
(g)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx8tx9gm(seqidno:109)，其中x8是n或s且其中x9是l或v，
[0294]
(h)vhcdr2，包含氨基酸序列wddx
10
(seqidno:110)，其中x
10
是e或不存在，和
[0295]
(i)vhcdr3，包含氨基酸序列gtaqatdald(seqidno:111)和
[0296]
(ii)vl，其包含：
[0297]
(j)vlcdr1，包含氨基酸序列kslx
11
x
12
sngnty(seqidno:112)，其中x
11
是l或r且其中x
12
是h或k，
[0298]
(k)vlcdr2，包含氨基酸序列yms(seqidno:113)，和
[0299]
(l)vlcdr3，包含氨基酸序列x
13
lex
14
pl(seqidno:114)，
[0300]
其中x
13
是g或s且其中x
14
是h或y。
[0301]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含
[0302]
(i)vh，其包含：
[0303]
(m)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx
15
tx
16
gmg(seqidno:115)，其中x
15
是n或s且其中x
16
是v或l，
[0304]
(n)vhcdr2，包含氨基酸序列iwwddx
17
dk(seqidno:116)，其中x
17
是e或不存在，和
[0305]
(o)vhcdr3，包含氨基酸序列x
18
rigtaqatdaldy(seqidno:117)，其中x
18
是t，a或s，和
[0306]
(ii)vl，其包含：
[0307]
(p)vlcdr1，包含氨基酸序列kslx
19
x
20
sngnty(seqidno:118)，其中x
19
是v或l且其中x
20
是h或k，
[0308]
(q)vlcdr2，包含氨基酸序列yms(seqidno:119)，和
[0309]
(r)vlcdr3，包含氨基酸序列mqsleyplt(seqidno:120)。
[0310]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：
[0311]
(i)vh，其包含：
[0312]
(s)vhcdr1，包含氨基酸序列tx1gmgvg(seqidno:103)，其中x1是l或v，
[0313]
(t)vhcdr2，包含氨基酸序列hiwwddx2dkyyx3palks(seqidno:104)，其中x2是e或不存在且其中x3是y或n，和
[0314]
(u)vhcdr3，包含氨基酸序列igtaqatdaldy(seqidno:105)，和
[0315]
(ii)vl，其包含：
[0316]
(v)vlcdr1，包含seqidno:6的氨基酸序列，
[0317]
(w)vlcdr2，包含seqidno:7的氨基酸序列，和
[0318]
(x)vlcdr3，包含seqidno:8的氨基酸序列。
[0319]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含
[0320]
(i)vh，其包含：
[0321]
(y)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx8tx9gm(seqidno:109)，其中x8是n或s且其中x9是l或v，
[0322]
(z)vhcdr2，包含氨基酸序列wddx
10
(seqidno:110)，其中x
10
是e或不存在，和
[0323]
(aa)vhcdr3，包含氨基酸序列gtaqatdald(seqidno:111)和
[0324]
(ii)vl，其包含：
[0325]
(bb)vlcdr1，包含seqidno:12的氨基酸序列，
[0326]
(cc)vlcdr2，包含seqidno:13的氨基酸序列，和
[0327]
(dd)vlcdr3，包含seqidno:14的氨基酸序列。
[0328]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：
[0329]
(ee)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx
15
tx
16
gmg(seqidno:115)，其中x
15
是n或s且其中x
16
是v或l，
[0330]
(ff)vhcdr2，包含氨基酸序列iwwddx
17
dk(seqidno:116)，其中x
17
是e或不存在，和
[0331]
(gg)vhcdr3，包含氨基酸序列x
18
rigtaqatdaldy(seqidno:117)，其中x
18
是t，a或s和
[0332]
(ii)vl，其包含：
[0333]
(hh)vlcdr1，包含seqidno:18的氨基酸序列，
[0334]
(ii)vlcdr2，包含seqidno:19的氨基酸序列，和
[0335]
(jj)vlcdr3，包含seqidno:20的氨基酸序列。
[0336]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含
[0337]
(i)vh，其包含：
[0338]
(kk)vhcdr1，包含氨基酸序列tx1gmgvg(seqidno:103)，其中x1是l或v，
[0339]
(ll)vhcdr2，包含氨基酸序列hiwwddx2dkyyx3palks(seqidno:104)，其中x2是e或不存在且其中x3是y或n，和(mm)vhcdr3，包含氨基酸序列igtaqatdaldy(seqidno:105)，和
[0340]
(ii)vl，其包含：
[0341]
(nn)vlcdr1，包含seqidno:26的氨基酸序列，
[0342]
(oo)vlcdr2，包含seqidno:27的氨基酸序列，和
[0343]
(pp)vlcdr3，包含seqidno:28的氨基酸序列。
[0344]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：
[0345]
(i)vh，其包含：
[0346]
(qq)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx8tx9gm(seqidno:109)，其中x8是n或s且其中x9是l或v，
[0347]
(rr)vhcdr2，包含氨基酸序列wddx
10
(seqidno:110)，其中x
10
是e或不存在，和
[0348]
(ss)vhcdr3，包含氨基酸序列gtaqatdald(seqidno:111)，和
[0349]
(ii)vl，其包含：
[0350]
(tt)vlcdr1，包含seqidno:32的氨基酸序列，
[0351]
(uu)vlcdr2，包含seqidno:33的氨基酸序列，和
[0352]
(vv)vlcdr3，包含seqidno:34的氨基酸序列。
[0353]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：
[0354]
(i)vh，其包含：
[0355]
(ww)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx
15
tx
16
gmg(seqidno:115)，其中x
15
是n或s且其中x
16
是v或l，
[0356]
(xx)vhcdr2，包含氨基酸序列iwwddx
17
dk(seqidno:116)，其中x
17
是e或不存在，和
[0357]
(yy)vhcdr3，包含氨基酸序列x
18
rigtaqatdaldy(seqidno:117)，其中x
18
是t，a或s，和
[0358]
(ii)vl，其包含：
[0359]
(zz)vlcdr1，包含seqidno:38的氨基酸序列，
[0360]
(aaa)vlcdr2，包含seqidno:39的氨基酸序列，和
[0361]
(bbb)vlcdr3，包含seqidno:40的氨基酸序列。
[0362]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:3的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:4的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:5的氨基酸序列；和(b)vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:6的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:7的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:8的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:9的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:10的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:11的氨基酸序列；和(b)vlcdr1，包含seqidno:12的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:13的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:14的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:15的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:16的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:17的氨基酸序列；和(b)vlcdr1，包含seqidno:18的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:19的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:20的氨基酸序列。
[0363]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:23的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:24的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:25的氨基酸序列；和(b)vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:26的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:27的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:28的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:29的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:30的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:31的氨基酸序列；和(b)vl，其包含：vlcdr1，包含seqidno:32的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:33的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:34的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含：vhcdr1，包含seqidno:35的氨基酸序列；
vh cdr2，包含seq id no:36的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seq id no:37的氨基酸序列；和(b)vl cdr1，包含seq idno:38的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq id no:39的氨基酸序列；和 vl cdr3，包含seq id no:40的氨基酸序列。
[0364]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段包含：(a)vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:43的氨基酸序 列；vh cdr2，包含seq id no:44的氨基酸序列；和vh cdr3，包含 seq id no:45的氨基酸序列；和(b)vl，其包含：vl cdr1，包含seqid no:46的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq id no:47的氨基酸序列； 和vl cdr3，包含seq id no:48的氨基酸序列。在具体实施方案中，本 文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含： vh cdr1，包含seq id no:49的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:50的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:51的氨基酸序列； 和(b)vl，其包含：vl cdr1，包含seq id no:52的氨基酸序列；vlcdr2，包含seq id no:53的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq idno:54的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:55 的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:56的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seq id no:57的氨基酸序列；和(b)vl，其包含：vlcdr1，包含seq id no:58的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:59的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:60的氨基酸序列。
[0365]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段包含：(a)vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:63的氨基酸序 列；vh cdr2，包含seq id no:64的氨基酸序列；和vh cdr3，包含 seq id no:65的氨基酸序列；和(b)vl，其包含：vl cdr1，包含seqid no:66的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq id no:67的氨基酸序列； 和vl cdr3，包含seq id no:68的氨基酸序列。在具体实施方案中，本 文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含： vh cdr1，包含seq id no:69的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:70的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:71的氨基酸序列； 和(b)vl，其包含：vl cdr1，包含seq id no:72的氨基酸序列；vlcdr2，包含seq id no:73的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq idno:74的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:75 的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:76的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seq id no:77的氨基酸序列；和(b)vl，其包含：vlcdr1，包含seq id no:78的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:79的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:80的氨基酸序列。
[0366]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段包含：(a)vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:83的氨基酸序 列；vh cdr2，包含seq id no:84的氨基酸序列；和vh cdr3，包含 seq id no:85的氨基酸序列；和(b)vl，其包含：vl cdr1，包含seqid no:86的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq id no:87的氨基酸序列； 和vl cdr3，包含seq id no:88的氨基酸序列。在具体实施方案中，本 文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含： vh cdr1，包含seq id no:89的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:90的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:91的氨基酸序列； 和(b)vl，其包含：vl cdr1，包含seq id no:92的氨基酸序列；vlcdr2，包含seq id no:93的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq idno:94的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:95 的氨基酸序列；
vh cdr2，包含seq id no:96的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seq id no:97的氨基酸序列；和(b)vl，其包含：vlcdr1，包含seq id no:98的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:99的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:100的氨基酸序列。
[0367]
表7.vh区氨基酸序列
[0368][0369]
表8.vl区氨基酸序列
[0370]
[0371][0372]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 包含vh区，其包含：
[0373]
qvx
21
lkesgpgx
22
lqpsqtlsltcsfsgfslx
23
tx
24
gmgvgwx
25
r qx
26
sgkglewlahiwwddx
27
dkyyx
28
palksrltisx
29
x
30
x
31
sknqvf lkix
32
nvx
33
tadx
34
atyycx
35
rigtaqatdaldywgqgtsvtvss (seq id no:101)，其中x
21
是t或n，x
22
是i或k，x
23
是n或s，x
24
是 v或l，x
25
是s或i，x
26
是p或s，x
27
是e或不存在，x
28
是n或y， x
29
是k或r，x
30
是a或d，x
31
是t或s，x
32
是v或a，x
33
是g或d， x
34
是t，i或s且x
35
是t，s或a。
[0374]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 包含vl区，其包含：
[0375]
divmtqaapsx
36
x
37
vtpgesvsiscrsskslx
38
x
39
sngntylywfl qrpgqspqrliyymsnlasgvpdrfsgrgsgtdftlx
40
isrveax
41
dvg vyycmqx
42
lex
43
pltfgggtkleik(seq id no:102)，其中x
36
是i或 v，x
37
是p或s，x
38
是r或l，x
39
是k或h，x
40
是r或k，x
41
是e或 g，x
42
是s或g且x
43
是y或h。
[0376]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 包含
[0377]
(ccc)vh区，其包含
[0378]
qvx
21
lkesgpgx
22
lqpsqtlsltcsfsgfslx
23
tx
24
gmgvgwx 25
rqx
26
sgkglewlahiwwddx
27
dkyyx
28
palksrltisx
29
x
30 x
31
sknqvflkix
32
nvx
33
tadx
34
atyycx
35
rigtaqatdaldy wgqgtsvtvss(seq id no:101)，其中x
21
是t或n，x
22
是i 或k，x
23
是n或s，x
24
是v或l，x
25
是s或i，x
26
是p或s， x
27
是e或不存在，x
28
是n或y，x
29
是k或r，x
30
是a或d， x
31
是t或s，x
32
是v或a，x
33
是g或d，x
34
是t，i或s且 x
35
是t，s或a，和
[0379]
(ddd)vl区，其包含
[0380]
divmtqaapsx
36
x
37
vtpgesvsiscrsskslx
38
x
39
sngntyly wflqrpgqspqrliyymsnlasgvpdrfsgrgsgtdftlx
40
isr veax
41
dvgvyycmqx
42
lex
43
pltfgggtkleik(seq idno:102)，其中x
36
是i或v，x
37
是p或s，x
38
是r或l，x
39
是k或h，x
40
是r或k，x
41
是e或g，x
42
是s或g且x
43
是y或 h。
[0381]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 包含
[0382]
(eee)vh区，其包含
[0383]
qvx
21
lkesgpgx
22
lqpsqtlsltcsfsgfslx
23
tx
24
gmgvgwx 25
rqx
26
sgkglewlahiwwddx
27
dkyyx
28
palksrltisx
29
x
30 x
31
sknqvflkix
32
nvx
33
tadx
34
atyycx
35
rigtaqatdaldy wgqgtsvtvss(seq id no:101)，其中x
21
是t或n，x
22
是i 或k，x
23
是n或s，x
24
是v或l，x
25
是s或i，x
26
是p或s， x
27
是e或不存在，x
28
是n或y，x
29
是k或r，x
30
是a或d， x
31
是t或s，x
32
是v或a，x
33
是g或d，x
34
是t，i或s且 x
35
是t，s或a，和
[0384]
(fff)vl区，其包含seq id no:2的氨基酸序列。
[0385]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 包含
[0386]
(ggg)vh区，其包含
[0387]
qvx
21
lkesgpgx
22
lqpsqtlsltcsfsgfslx
23
tx
24
gmgvgwx 25
rqx
26
sgkglewlahiwwddx
27
dkyyx
28
palksrltisx
29
x
30 x
31
sknqvflkix
32
nvx
33
tadx
34
atyycx
35
rigtaqatdaldy wgqgtsvtvss(seq id no:101)，其中x
21
是t或n，x
22
是i 或k，x
23
是n或s，x
24
是v或l，x
25
是s或i，x
26
是p或s， x
27
是e或不存在，x
28
是n或y，x
29
是k或r，x
30
是a或d， x
31
是t或s，x
32
是v或a，x
33
是g或d，x
34
是t，i或s且 x
35
是t，s或a，和
[0388]
(hhh)vl区，其包含seq id no:62的氨基酸序列。
[0389]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含如表7所示的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述 的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链可变区序列，其包含seqid no:1的氨基酸序列(表7)(例如，抗体10c6的vh)。在具体实施方案中， 本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链可变区序列，其 包含seq id no:21的氨基酸序列(表7)(例如，抗体7b12的vh)。在具体 实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链可 变区序列，其包含seq id no:41的氨基酸序列(表7)(例如，抗体19c11 的vh)。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段包含重链可变区序列，其包含seq id no:61的氨基酸序列(表7)(例如， 抗体16c5的vh)。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或 其抗原结合片段包含重链可变区序列，其包含seq id no:81的氨基酸序列 (表7)(例如，抗体18c6的vh)。
[0390]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 包含vl，其包含如表8所示的氨基酸序列。在具体实施方案中，本文描述 的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区序列，其包含seqid no:2的氨基酸序列(表8)(例如，抗体10c6的vl)。在具体实施方案中， 本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区序列，其 包含seq id no:22的氨基酸序列(表8)(例如，抗体7b12的vl)。在具体 实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含轻链可 变区序列，其包含seq id no:42的氨基酸序列(表8)(例如，抗体19c11 的vl)。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段包含轻链可变区序列，其包含seq id no:62的氨基酸序列(表8)(例如， 抗体16c5的vl)。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段包含轻链可变区序列，其包含seq id no:82的氨基酸序 列(表8)(例如，抗体18c6的vl)。
[0391]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段包含(a)包含如表7所示氨基酸序列的vh；和(b)包含如表8所示氨基酸 序列的vl。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原 结合片段包含(a)重链可变区序列，其包含seq id no:1的氨基酸序列(表 7)(例如，抗体10c6的vh)和(b)轻链可变区序列，其包含seq id no:2的 氨基酸序列(表8)(例如，抗体10c6的vl)。在具体实施方案中，本文描述 的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含(a)重链可变区序列，其包含 seq id no:21的氨基酸序列(表7)(例如，抗体7b12的vh)和(b)轻链可变 区序列，其包含seq id no:22的氨基酸序列(表8)(例如，抗体7b12的 vl)。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段包含(a)重链可变区序列，其包含seq id no:41的氨基酸序列(表7)(例 如，抗体19c11的vh)和(b)轻链可变区序列，其包含seq id no:42的氨 基酸序列(表8)(例如，抗体19c11的vl)。在具体实施方案中，本文描述 的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含(a)
重链可变区序列，其包含 seq id no:61的氨基酸序列(表7)(例如，抗体16c5的vh)和(b)轻链可变 区序列，其包含seq id no:62的氨基酸序列(表8)(例如，抗体16c5的 vl)。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段包含(a)重链可变区序列，其包含seq id no:81的氨基酸序列(表7)(例 如，抗体18c6的vh)和(b)轻链可变区序列，其包含seq id no:82的氨基 酸序列(表8)(例如，抗体18c6的vl)。
[0392]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段包含：具有如表7所示氨基酸序列的vh的vh cdr(例如，如表1、3 或5所示)，和具有如表8所示氨基酸序列的vl的vl cdr(例如，如表2， 4或6所示)。
[0393]
在某些实施方案中，本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 可以通过其vh结构域单独或其vl域单独或其三个vh cdr单独或其三 个vl cdr单独描述。参见例如rader c等人(1998)pnas 95：8910-8915， 其通过引用整体并入本文，其描述了通过分别从人轻链或重链文库鉴定互 补轻链或重链来对小鼠抗αvβ3抗体进行人源化，得到具有相当或高于原始 抗体亲和力的亲和力的人源化抗体变体。还参见clackson t等(1991)nature352：624-628，其全部内容通过引用并入本文，描述了通过使用特异性vh 区(或vl区)产生结合特异性抗原的抗体，并针对互补可变区进行筛选的方 法。另见kim sj&hong hj，(2007)j microbiol 45：572-577，其全部内容通 过引用并入本文，描述了通过使用特异性vh区和筛选文库(例如，人vl 文库)中的互补vl区来产生结合特异性抗原的抗体的方法；选择的vl结 构域可继而用于指导另外的互补(例如，人)vh区的选择。
[0394]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 可以是人源化抗体，例如，人源化形式的啮齿类抗体。人源化抗体可使用 本领域已知的多种技术进行生产，包括但不限于，cdr-移植(欧洲专利号 ep 239,400，国际公开号wo 91/09967和美国专利号5,225,539，5,530,101 和5,585,089)、链更替(美国专利号5,565,332)、嵌合(veneering)或重修饰 (resurfacing)(欧洲专利号ep 592,106和ep 519,596，padlan，1991，molecularimmunology 28(4/5):489-498，studnicka等，1994，protein engineering 7(6):805-814和roguska等，1994，pnas 91:969-973)，以及下述文件中描 述的技术，例如，美国专利号6,407,213，美国专利号5,766,886，wo 9317105， sandhu js，gene 150(2):409-10(1994)，pedersen等，j.mol.biol. 235(3):959-73(1994)，couto等，cancer res.55(8):1717-22(1995)， roguska等，protein eng.9(10):895 904(1996)，baca等，j.biol.chem. 272(16):10678-84(1997)，couto等，cancer res.55(23supp):5973s-5977s (1995)，caldas等，protein eng.13(5):353-60(2000)，morea等，methods20(3):267 79(2000)和tan等，j.immunol.169:1119 25(2002)。还参见美国 专利公开号us 2005/0042664 a1(2005年2月24日)，其分别全文引入作为 参考。
[0395]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 可以是复合人抗体。复合人抗体可以通过下述方式产生，例如，以避开t 细胞表位的方式从多个人抗体可变区序列片段设计可变区序列，从而最小 化得到的抗体的免疫原性(参见，例如，baker等，2010，self nonself.， 1(4):314-322，bryson等，2010，biodrugs，24(1):1-8和jones等，2009， methods mol biol.，525:405-23)。该抗体可包含人恒定区序列，例如，人轻 链和/或重链恒定区。
[0396]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段可以是去免
疫化(deimmunized)抗体。去免疫化抗体是其中t细胞表位已 被去除的抗体。制备去免疫化抗体的方法已有描述。参见，例如，jones 等，methods mol biol.2009；525:405-23，xiv和de groot等，cell. immunol.244:148-153(2006))。
[0397]
在具体的实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段是人源化的免疫球蛋白，其包含表1，表2和表3和表4，表5和表6 各自中的任何抗体的3个vh cdr和3个vl cdr(即，vh cdr1、vhcdr2，vh cdr3，vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3)，人源的框架区和 人源的恒定区。非限制性示例的人框架区在本领域已有描述，例如，参见 kabat等(1991)sequences of proteins of immunological interest，第5版，美 国卫生及公共服务部，nih出版号91-3242)。在某些实施方案中，本文描 述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含人框架区或源自人框架区 的框架区(例如，vl区和/或vh区的框架区)。在某些实施方案中，本文描 述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含灵长类(例如，非人灵长类) 框架区或源自灵长类(例如，非人灵长类)框架区的框架区(例如，vl区和/ 或vh区的框架区)。例如，抗原特异性非人抗体的cdr，通常为啮齿类来 源的(例如，小鼠或大鼠)，被植入同源的人或非人灵长类(例如，旧大陆猿(oldworld apes)，例如黑猩猩(pan troglodytes)，倭黑猩猩(pan paniscus)或大猩猩 (gorilla gorilla)，黑猩猩(pan troglodytes)，旧大陆猴(old world monkeys)， 例如来自猕猴属(macaca)或食蟹猴猕猴属(cynomolgus monkey macacacynomolgus)。非人灵长类框架序列描述于美国专利申请公开号us2005/0208625。
[0398]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段的vh cdr1、vh cdr2，和/或vh cdr3在vh区中的位置和/或vlcdr1、vl cdr2，和/或vl cdr2在vl区中的位置可以变化1、2、3、 4、5、6或更多个氨基酸位点，只要(i)保持免疫特异性结合重组表达第一 形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基 酸序列是seq id no:133；(ii)保持不能免疫特异性结合重组表达第二形式 的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸 序列是seq id no:139；和(iii)保持抑制重组表达所述第一形式的muc16 的细胞的体外基质胶侵袭(例如，基本保持，例如，至少50％、至少 60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在另一实施方案中， 本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的vh cdr1、vhcdr2，和/或vh cdr3在vh区中的长度和/或vl cdr1、vl cdr2，和/ 或vl cdr2在vl区中的长度可以变化(例如，更短或更长)1、2、3、4、 5、6或更多个氨基酸，只要(i)保持免疫特异性结合重组表达第一形式的 muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列 是seq id no:133；(ii)保持不能免疫特异性结合重组表达第二形式的 muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序 列是seq id no:139，和(iii)保持抑制重组表达所述第一形式的muc16的 细胞的体外基质胶侵袭(例如，基本保持，例如，至少50％、至少60％、至 少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在另一实施方案中，与一个或 多个本文描述的cdr相比，本文描述的vh cdr1、vh cdr2、vhcdr3、vl cdr1、vl cdr2、和/或vl cdr3的氨基端和/或羧基端可延 伸或截短1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸，只要(i)保持免疫特异性结 合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中 第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)保持不能免疫特异性结合重 组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第 二形式的氨基酸序列是seq id no:139；和(iii)保持抑制重组表达所述第 一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭(例如，基本保持，例如，至少 50％、至少60％、至
少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。如本文使 用的，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异 性识别”在抗体的语境下是类似术语，表示抗体及其抗原结合片段通过如本 领域技术人员所理解的抗原结合位点结合抗原(例如，表位或免疫复合物)， 且不排除抗体或抗原结合片段与其它抗原的交叉反应性。本领域已知的任 何方法都可用于确认是否：(i)保持免疫特异性结合重组表达第一形式的 muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是 seq id no:133；(ii)保持不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16 的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；和(iii)保持抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外 基质胶侵袭，例如，elisa结合分析或facs分析，如下第6节所述。
[0399]
在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 包含抗体重链和/或轻链，例如，单独的重链，单独的轻链或重链和轻链。 对于重链，在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结 合片段的重链可以是α、δ、ε、γ或μ重链。在另一具体实施方案中，所述 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的重链可以包含人α、δ、ε、γ或μ 重链。
[0400]
在具体实施方案中，(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16 的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq idno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞， 其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq idno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶 侵袭的本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重 链可变区的氨基酸序列包含vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，其分别具 有氨基酸序列seq id no:103、seq id no:104和seq id no:105；分别具 有氨基酸序列seq id no:109、seq id no:110和seq id no:111；或分别 具有氨基酸序列seq id no:115、seq id no:116和seq id no:117；且其 中重链恒定区是人α、δ、ε、γ或μ重链恒定区。如本文使用的术语“恒定 区”或“恒定域”是可互相替换的，具有其在本领域的常规含义。恒定区是抗 体的部分，例如，轻链和/或重链的羧端部分，其不直接涉及抗体与抗原的 结合，但能够表现出多种效应物功能，例如与fc受体的相互作用。免疫球 蛋白分子的恒定区一般具有相对免疫球蛋白可变区而言更为保守的氨基酸 序列。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含抗体10c6、7b12、19c11、 16c5或18c6(即，列于表1、表3或表5的抗体)的vh cdr1、vh cdr2 和vh cdr3，且其中重链恒定区是人α、δ、ε、γ或μ重链恒定区。
[0401]
在另一具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化的抗体或其抗原结 合片段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含seq id no:101的氨 基酸序列，且其中重链恒定区是人α、δ、ε、γ或μ重链恒定区。在另一具 体实施方案中，本文描述的muc16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含重 链，其中重链可变区的氨基酸序列包含seq id no:1、seq id no:21、seqid no:41、seq id no:61或seq id no:81的氨基酸序列，且其中重链恒 定区是人α、δ、ε、γ或μ重链恒定区。
[0402]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化的抗体或其抗原结合 片段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含vh cdr1、vh cdr2 和vh cdr3，其分别具有氨基酸序列seq id no:103、seq id no:104和seq id no:105；或分别具有氨基酸序列seq id no:
109、seq id no:110 或seq id no:111；或分别具有氨基酸序列seq id no:115、seq idno:116或seq id no:117，且其中重链恒定区是人重链恒定区。在具体实 施方案中，本文描述的muc16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含重链， 其中重链可变区的氨基酸序列包含抗体10c6、7b12、19c11、16c5或 18c6vh cdr(即，列于表1、表3和表5的那些)的任何vh cdr1、vh cdr2 和vh cdr3，且其中重链恒定区是人重链恒定区。在具体实施方案中，本 文描述的muc16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链可变 区的氨基酸序列包含seq id no:101的氨基酸序列，且其中重链恒定区是 人重链恒定区。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化的抗体或其 抗原结合片段包含重链，其中重链可变区的氨基酸序列包含抗体10c6、 7b12、19c11、16c5或18c6的vh cdr(即，列于表7的那些)的任一的氨 基酸序列，且其中重链恒定区是人重链恒定区。非限制性示例的人恒定区 序列在本领域已有描述，例如，参见kabat ea等，(1991)，同上。
[0403]
对于轻链，在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段的轻链是κ轻链。在另一具体实施方案中，本文描述的muc16 糖基化抗体或其抗原结合片段的轻链是λ轻链。在又一具体实施方案中， 本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的轻链是人κ轻链或人λ 轻链。
[0404]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含vl cdr1、vl cdr2和vlcdr3，其分别具有抗体氨基酸序列seq id no:106、seq id no:107和 seq id no:108，或分别具有seq id no:112、seq id no:113和seq idno:114，或分别具有seq id no:118、seq id no:119和seq idno:120，且其中轻链恒定区是κ或λ轻链恒定区。在具体实施方案中，本 文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区 氨基酸序列包含抗体10c6、7b12、19c11、16c5或18c6(即，列于表2、 表4或表6的那些)的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，且其中轻链恒 定区是κ或λ轻链恒定区。
[0405]
在另一具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化的抗体或其抗原结 合片段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含seq id no:102的氨基 酸序列，且其中轻链恒定区是κ或λ轻链恒定区。在另一具体实施方案中， 本文描述的muc16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链可 变区氨基酸序列包含seq id no:2、seq id no:22、seq id no:42、seq idno:62或seq id no:82的氨基酸序列，且其中轻链恒定区是κ或λ轻链恒 定区。
[0406]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化的抗体或其抗原结合 片段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含vl cdr1、vl cdr2和 vl cdr3，其分别具有氨基酸序列seq id no:106、seq id no:107和 seq id no:108，或分别具有seq id no:112、seq id no:113和seq idno:114，或分别具有seq id no:118、seq id no:119和seq idno:120，且其中轻链恒定区包含人轻链恒定区的氨基酸。在具体实施方案 中，本文描述的muc16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻 链可变区氨基酸序列包含具有抗体10c6、7b12、19c11、16c5或18c6的 vl cdr(即，列于表2、表4和表6的那些)任一的氨基酸序列的vl cdr1、 vl cdr2和vl cdr3，且其中轻链恒定区是人轻链恒定区。在具体实施方 案中，本文描述的muc16糖基化的抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中 轻链可变区氨基酸序列包含seq id no:102的氨基酸序列，且其中轻链恒 定区是人轻链恒定区。在具体实施方案中，本
文描述的muc16糖基化的抗 体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序列包含抗体10c6、 7b12、19c11、16c5或18c6的vl cdr(即，列于表8的那些)任一的氨基 酸序列，且其中轻链恒定区是人轻链恒定区。非限制性示例的人恒定区序 列在本领域已有描述，例如，参见kabat ea等，(1991)，同上。
[0407]
在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 包含如本文描述的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，且其中恒定区是 igg、ige、igm、igd、iga或igy免疫球蛋白分子或人igg、ige、igm、 igd、iga或igy免疫球蛋白分子中的类型。在另一具体实施方案中，本文 描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh和vl，其包含本文 描述的任何氨基酸序列，且其中恒定区是igg、ige、igm、igd、iga或igy 免疫球蛋白分子，任何类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2) 或任何亚类(例如，igg
2a
和igg
2b
)of免疫球蛋白分子中的类型。在具体实施 方案中，恒定区是人igg、ige、igm、igd、iga或igy免疫球蛋白分子， 免疫球蛋白分子任何类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或 任何亚类(例如，igg
2a
和igg
2b
)中的类型。
[0408]
在另一具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结 合片段包含重链和/或轻链，其中(i)重链包含(a)可变区，包含vh cdr1、 vh cdr2和vh cdr3，其分别具有氨基酸序列seq id no:103、seq idno:104和seq id no:105；分别具有氨基酸序列seq id no:109、seq idno:110和seq id no:111；或分别具有seq id no:115、seq id no:116 和seq id no:117，且(b)包含重链恒定区，其是人igg重链恒定区，和/或 (ii)轻链包含(a)可变区，包含vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3，其分别 具有氨基酸序列seq id no:106、seq id no:107和seq id no:108，或分 别具有seq id no:112、seq id no:113和seq id no:114，或分别具有 seq id no:118、seq id no:119和seq id no:120；和(b)轻链恒定区， 其是人igg恒定区。在另一具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗 体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链，其中(i)重链包含(a)可变区，包 含具有抗体10c6、7b12、19c11、16c5或18c6的vh cdr(即，列于表 1、表3和表5的那些)任一的氨基酸序列的vh cdr1、vh cdr2和vhcdr3且(b)包含重链恒定区，其是人igg重链恒定区，和/或(ii)轻链包含(a) 可变区，包含具有抗体10c6、7b12、19c11、16c5或18c6的vl cdr (即，列于表2、表4和表6的那些)任一氨基酸序列的vl cdr1、vl cdr2 和vl cdr3，和(b)轻链恒定区，其是人igg的恒定区。
[0409]
在另一具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结 合片段包含重链和/或轻链，其中(i)重链包含(a)可变区，包含seq idno:101的氨基酸序列；和(b)重链恒定区，其是人igg恒定区，和/或(ii) 轻链包含(a)可变区，包含seq id no:102的氨基酸序列；和(b)轻链恒定 区，其是人κ轻链恒定区。在另一具体实施方案中，本文描述的muc16 糖基化抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链，其中(i)重链包含(a)可变 区，包含下述：抗体10c6、7b12、19c11、16c5或18c6(即，列于表7的 那些)任一的vh的氨基酸序列和(b)重链恒定区，其是人igg恒定区，和 /或(ii)轻链包含(a)可变区，包含下述氨基酸序列：抗体10c6、7b12、19c11、 16c5或18c6(即，列于表8的那些)任一的vl，和(b)轻链恒定区，其是 人κ轻链恒定区。
[0410]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 或其抗原结合片段包含相对于任何的seq id nos:1-100具有下述百分比同 一性的氨基酸序列。数学算法可用于确定两条序列(例如，氨基酸序列或核 酸序列)之间的同一性百分比。用于比较
两个序列的数学算法的优选的非限 制性示例是karlin和altschul，1990，proc.natl.acad.sci.u.s.a.87:22642268，于karlin和altschul，1993，proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:5873 5877 中优化。该算法被并入altschul等，1990，j.mol.biol.215:403的nblast 和xblast程序中。可以使用nblast核苷酸程序参数设置进行blast 核苷酸检索，例如，设定score＝100，wordlength＝12，以获得与本文所述 的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用xblast程序参数设置进行 blast蛋白质检索，例如设定score 50，wordlength＝3以获得与本文所述 的蛋白质分子同源的氨基酸序列。可以按照altschul等人，1997，nucleicacids res.25：3389 3402中的描述进行缺口blast，以获得用于比较目的 的缺口比对。可选的，可以通过psi blast(id.)来执行检测分子之间远缘关 系的迭代检索。当使用blast，gapped blast和psi blast程序时，可以 使用相应程序(例如，xblast和nblast)的缺省参数(例如，参见例如， 国家生物技术信息中心(ncbi)，万维网ncbi.nlm.nih.gov)。用于比较序列的 数学算法的另一个优选的非限制性实例是myers和miller，1988，cabios 4:11 17的算法。这样的算法被并入align程序(版本2.0)中，其是gcg序 列比对软件包的一部分。当使用align程序比较氨基酸序列时，可以使用 pam120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。此外，可以使 用与上述类似的技术来确定两个序列之间的百分比同一性，允许或不允许 缺口。通常，计算百分比同一性时，只计算完全匹配。
[0411]
在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含具有 与seq id no:101的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少 95％或至少98％序列同一性的vh。在某些实施方案中，muc16糖基化抗 体或其抗原结合片段包含具有与抗体10c6、7b12、19c11、16c5或1b5 (即，列于表7的那些)的任一vh的氨基酸序列至少80％、至少85％、至 少90％、至少95％或至少98％序列同一性的vh。在某些实施方案中， muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vh区，其具有与seq idno:101的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少 98％序列同一性，其中抗体或抗原结合片段包含与表1、表2、表3、表4、 表5或表6中所示cdr(例如，vh cdr和/或vl cdr)相同的cdr(例如， vh cdr和/或vl cdr)。在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段包含vh区，其具有与抗体10c6、7b12、19c11、16c5或 18c6(即，列于表7的那些)的任一vh的氨基酸序列至少80％、至少 85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性，其中抗体或抗原结合 片段包含与表1、表2、表3、表4、表5或表6中所示cdr(例如，vhcdr和/或vl cdr)相同的cdr(例如，vh cdr和/或vl cdr)。
[0412]
在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含具有 与seq id no:102的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少 95％或至少98％序列同一性的vl。在某些实施方案中，muc16糖基化抗 体或其抗原结合片段包含具有与任一抗体10c6、7b12、19c11、16c5或 1b5(即，列于表8的那些)的vl氨基酸序列至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％或至少98％序列同一性的vl。在某些实施方案中， muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含vl区，其具有与seq idno:102的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少 98％序列同一性，其中抗体或抗原结合片段包含与表1、表2、表3、表4、 表5或表6中所示cdr(例如，vh cdr和/或vl cdr)相同的cdr(例如， vh cdr和/或vl cdr)。在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段包含vl区，其具有与任一抗体10c6、
7b12、19c11、16c5或 18c6(即，列于表7的那些)的vl氨基酸序列至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％或至少98％序列同一性，其中抗体或抗原结合片段包含与 表1、表2、表3、表4、表5或表6中所示cdr(例如，vh cdr和/或vlcdr)相同的cdr(例如，vh cdr和/或vl cdr)。
[0413]
在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(i) vh区，其具有与seq id no:101的氨基酸序列至少80％、至少85％、至 少90％、至少95％或至少98％序列同一性和(ii)vl区，其具有与seq idno:102的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少 98％序列同一性。在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段分别包含：(i)vh区，其具有与任一抗体10c6、7b12、19c11、16c5或 18c6的vh氨基酸序列(即，列于表8的那些)至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％或至少98％序列同一性和(ii)vl区，其具有与任一抗体 10c6、7b12、19c11、16c5或18c6的vl氨基酸序列(即，列于表7的那 些)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性。 在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段包含：(i)vh 区，其具有与seq id no:101的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％或至少98％序列同一性和(ii)vl区，其具有与seq idno:102的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少 98％序列同一性，其中抗体或抗原结合片段包含与表1、表2、表3、表4、 表5或表6中所示cdr(例如，vh cdr和/或vl cdr)相同的cdr(例如， vh cdr和/或vl cdr)。在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段分别包含：(i)vh区，其具有与任一抗体10c6、7b12、 19c11、16c5或18c6的vh氨基酸序列(即，列于表8的那些)至少80％、 至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性和(ii)vl区，其具 有与任一抗体10c6、7b12、19c11、16c5或18c6的vl氨基酸序列(即， 列于表7的那些)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序 列同一性，其中抗体或抗原结合片段包含与表1、表2、表3、表4、表5 或表6中所示cdr(例如，vh cdr和/或vl cdr)相同的cdr(例如，vhcdr和/或vl cdr)。
[0414]
在另一方面，本文提供了结合本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原 结合片段(例如，10c6、7b12、19c11、16c5和/或16c5)的相同或重叠表位 的抗体。如本文所用，“表位”是本领域中的术语，并且可以指抗体可以免疫 特异性结合的抗原局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连 续表位)，或表位可以例如一起来自一种多肽或多种多肽的两个或多个非连 续区域(构象、非线性、不连续或非连续表位)。在某些实施方案中，抗体的 表位可以通过例如nmr谱、x射线衍射晶体学研究、elisa测定、与质谱 联用的氢/氘反应(例如，maldi质谱)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变 作图(例如，定点诱变作图)进行确定。对于x射线晶体学，可以使用本领域 中任何已知方法(例如，gieg
é
r等，(1994)acta crystallogr d biol crystallogr 50(pt 4)：339-350，mcpherson a(1990)eur j biochem 189：1-23，chayen ne (1997)structure 5：1269-1274，mcpherson a(1976)j biol chem 251： 6300-6303)。抗体：抗原晶体可使用熟知的x射线衍射技术进行研究，并可 使用计算机软件拟合(refine)，例如x-plor(yale university，1992，由 molecular simulations，inc.分配，参见例如meth enzymol(1985)第114&115 卷，wyckoff hw等编，美国专利申请号2004/0014194)和buster(bricogneg(1993)acta crystallogr d biol crystallogr 49(pt 1)：37-60，bricogne g(1997) meth enzymol 276a：361-423，carter cw，roversi p等编，(2000)actacrystallogr d biol crystallogr 56(pt 10)：1316-1323)。可以使用本领域技术人 员已知的任何方法进行诱变作图。参见，例如，champe m等，
(1995)和 cunningham bc&wells ja(1989)对于诱变技术的描述，包括丙氨酸扫描 诱变技术。此外，可以使用常规技术例如免疫测定来鉴定识别和结合相同 或重叠的表位的抗体，例如通过显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原的 结合的能力，即竞争性结合测定。竞争结合测定法也可用于确定两种抗体 是否对表位具有相似的结合特异性。可以在其中被测免疫球蛋白抑制参考 抗体与共同抗原的免疫特异性结合的测定中确定竞争性结合。许多类型的 竞争结合测定法是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(ria)，固 相直接或间接酶免疫测定(eia)，三明治竞争测定(参见stahli c等，(1983) methods enzymol 9：242-253)，固相直接生物素-亲和素eia(参见kirklandtn等，(1986)j immunol 137：3614-9)，固相直接标记分析，固相直接标记 夹心分析(参见harlow e&lane d，(1988)antibodies:a laboratorymanual，cold spring harbor press)，使用i-125标记的固相直接标记ria(参 见morel ga等，(1988)mol immunol 25(1)：7-15)，固相直接生物素-亲和 素eia(cheung rc等，(1990)virology 176：546-52)和直接标记ria (moldenhauer g等，(1990)scand j immunol 32：77-82)。通常，这种测定涉 及使用与固体表面结合的纯化抗原或携带其任一的细胞，未标记的测试免 疫球蛋白和标记的参比免疫球蛋白。可以通过测定在测试免疫球蛋白存在 下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。通常测试的免 疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，其将至少50-55％、 55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或者更多地抑制参比抗体与共同抗原的 免疫特异性结合。竞争结合测定可以使用标记的抗原或标记的抗体以大量 不同的形式进行设计。在该测定的通用形式中，将抗原固定在96孔板上。 然后使用放射性或酶标记测量未标记抗体阻断标记抗体与抗原结合的能 力。更详细的内容参见，例如，wagener c等，(1983)j immunol 130： 2308-2315，wagener c等，(1984)j immunol methods 68：269-274，kurokim等，(1990)cancer res 50：4872-4879，kuroki m等，(1992)immunol invest 21：523-538，kuroki m等，(1992)hybridoma 11：391-407和antibodies:alaboratory manual，harlow e&lane d编，同上，pp.386-389。
[0415]
在某些方面，竞争结合测定法可用于确定在竞争结合测定法(例如竞争 性elisa测定)中，当两种抗体识别相同或空间重叠的表位时，一种抗体是 否以例如剂量依赖的方式被另一种抗体(例如，作为参比抗体，其基本上结 合相同的表位或重叠的表位的抗体)竞争性阻断，所述测定法可以使用标记 的抗原或标记的抗体配置为不同形式的所有数量。在具体实施方案中，抗 体可以在本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的竞争结合测 定中进行测试(例如，含有10c6、7b12、19c11、16c5或16c5可变区的鼠 igg抗体)。
[0416]
在另一方面，本文提供了使用本领域技术人员已知的或本文描述的测 定法(例如，elisa)确定的能够与本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原 结合片段(例如，含有10c6、7b12、19c11、16c5或16c5可变区的鼠igg 抗体)竞争(例如，以剂量依赖的形式)结合muc16的抗体。在另一方面，本 文提供了使用本领域技术人员已知的或本文描述的测定法(例如，elisa) 确定的能够竞争性抑制(例如，以剂量依赖的形式)本文描述的muc16糖基 化抗体或其抗原结合片段(例如，含有10c6、7b12、19c11、16c5或16c5 可变区的鼠igg抗体)与muc16的结合的抗体。
[0417]
在某些实施方案中，本文提供了与本文描述的抗体竞争性结合muc16 的抗体，所述抗体以与本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段自 我竞争结合muc16相同的程
度结合muc16。在某些实施方案中，本文提 供了第一抗体，其与本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争 结合muc16，其中该竞争表现为将第一抗体与表位的结合降低超过80％ (例如，85％、90％、95％或98％或80％-85％、80％-90％、85％-90％或85％-95％)。
[0418]
在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量 依赖的形式)免疫特异性结合muc16：vh，其包含具有表1、表3或表5 所示氨基酸序列的vh cdr1、vh cdr2，和/或vh cdr3。在具体实施方 案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含10c6 的vh cdr的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量 依赖的形式)免疫特异性结合muc16(参见，表1、表3和表5)。在具体实 施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含 7b12的vh cdr的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以 剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16(参见，表1、表3和表5)。在具 体实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包 含19c11的vh cdr的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如， 以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16(参见，表1、表3和表5)。在 具体实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与 包含16c5的vh cdr的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例 如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16(参见，表1、表3和表5)。 在具体实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 与包含18c6的vh cdr的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例 如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16(参见，表1、表3和表5)。
[0419]
在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量 依赖的形式)免疫特异性结合muc16：vl，包含具有表2、表4或表6所 示氨基酸序列的vl cdr1、vl cdr2，和/或vl cdr3。在具体实施方案 中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含10c6的 vl cdr(参见，表2、表4和表6)的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16。在具体实施方 案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含7b12 的vl cdr(参见，表2、表4和表6)的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16。在具体实施 方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含19c11 的vl cdr(参见，表2、表4和表6)的muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16。在具体实 施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含 16c5的vl cdr(参见，表2、表4和表6)的muc16糖基化抗体或其抗原 结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16。在具 体实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包 含18c6的vl cdr(参见，表2、表4和表6)的muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16。
[0420]
在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段， 其与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂 量依赖的形式)免疫特异性结合muc16：(a)包含下述的vh：具有表1、表 3或表5所示氨基酸序列的vh cdr1、vh cdr2，和/或vh cdr3；和(b) 包含下述的vl：具有表2、表4或表6所示氨基酸序列的vl cdr1、vlcdr2，
和/或vl cdr3。在具体实施方案中，本文提供了muc16糖基化 抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16：(a)10c6 的vh cdr(参见，表1、表3和表5)和(b)10c6的vl cdr(参见，表2、 表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原 结合片段，其与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例 如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16：(a)7b12的vh cdr(参 见，表1、表3和表5)和(b)7b12的vl cdr(参见，表2、表4和表6)。 在具体实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量 依赖的形式)免疫特异性结合muc16：(a)19c11的vh cdr(参见，表1、 表3和表5)和(b)19c11的vl cdr(参见，表2、表4和表6)。在具体实施 方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下 的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式) 免疫特异性结合muc16：(a)16c5的vh cdr(参见，表1、表3和表5) 和(b)16c5的vl cdr(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本 文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其与包含以下的muc16 糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性 结合muc16：(a)18c6的vh cdr(参见，表1、表3和表5)和(b)18c6的 vl cdr(参见，表2、表4和表6)。
[0421]
在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量 依赖的形式)免疫特异性结合muc16：vh区，其具有表7所示的氨基酸序 列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量 依赖的形式)免疫特异性结合muc16：vh区，其具有seq id no:1的氨基 酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段， 其与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂 量依赖的形式)免疫特异性结合muc16：vh区，其具有seq id no:21的 氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段，其与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如， 以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16：vh区，其具有seq id no:41 的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结 合片段，其与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例 如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16：vh区，其具有seq idno:61的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段，其与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争 性(例如，以剂量依赖的形式)免疫特异性结合muc16：vh区，其具有seqid no:81的氨基酸序列。
[0422]
在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量 依赖的形式)免疫特异性结合muc16：vl区，其具有表8所示的氨基酸序 列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂量 依赖的形式)免疫特异性结合muc16：vl区，其具有seq id no:2的氨基 酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段， 其与包含以下的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段竞争性(例如，以剂 量依赖的形式)免疫特异性结合muc16：vl区，其具有seq id no:22的 氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原
cdr2，和/或vl cdr3。在具体实 施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体 的相同或重叠表位，后一抗体包含10c6的vl cdr(参见，表2、表4和表 6)。在具体实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段， 其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含7b12的vl cdr(参见，表2、 表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原 结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含19c11的vl cdr (参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了muc16糖基 化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含 16c5的vl cdr(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案中，本文提供 了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位， 后一抗体包含18c6的vl cdr(参见，表2、表4和表6)。
[0426]
在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段， 其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)vh，其包含具有表1、表 3或表5所示氨基酸序列的vh cdr1、vh cdr2，和/或vh cdr3和(b) vl，其包含具有表2、表4或表6所示氨基酸序列的vl cdr1、vl cdr2， 和/或vl cdr3。在具体实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)10c6的 vh cdr(参见，表1、表3和表5)和(b)10c6的vl cdr(参见，表2、表 4和表6)。在具体实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结 合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)7b12的vh cdr (参见，表1、表3和表5)和(b)7b12的vl cdr(参见，表2、表4和表6)。 在具体实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)19c11的vh cdr(参见，表 1、表3和表5)和(b)19c11的vl cdr(参见，表2、表4和表6)。在具体 实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗 体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)16c5的vh cdr(参见，表1、表3 和表5)和(b)16c5的vl cdr(参见，表2、表4和表6)。在具体实施方案 中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同 或重叠表位，后一抗体包含(a)18c6的vh cdr(参见，表1、表3和表5) 和(b)18c6的vl cdr(参见，表2、表4和表6)。
[0427]
在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含vh区，其具有表7所示的氨 基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含vh区，其具有seq idno:1的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含vh区，其 具有seq id no:21的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖 基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包 含vh区，其具有seq id no:41的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供 了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位， 后一抗体包含vh区，其具有seq id no:61的氨基酸序列。在具体的方面， 本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重 叠表位，后一抗体包含vh区，其具有seq id no:81的氨基酸序列。
[0428]
在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含vl区，其具有表8所示的氨基 酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段， 其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含vl区，其具有seq id no:2 的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体
或其抗原结 合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含vl区，其具有seqid no:22的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含vl区， 其具有seq id no:42的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16 糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体 包含vl区，其具有seq id no:62的氨基酸序列。在具体的方面，本文提 供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表 位，后一抗体包含vl区，其具有seq id no:82的氨基酸序列。
[0429]
在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其 结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)vh区，其具有表7所示的 氨基酸序列和(b)vl区，其具有表8所示的氨基酸序列。在具体的方面， 本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重 叠表位，后一抗体包含(a)vh区，其具有seq id no:1的氨基酸序列和(b) vl区，其具有seq id no:2的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后 一抗体包含(a)vh区，其具有seq id no:21的氨基酸序列和(b)vl区，其 具有seq id no:22的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖 基化抗体或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包 含(a)vh区，其具有seq id no:41的氨基酸序列和(b)vl区，其具有seqid no:42的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)vh 区，其具有seq id no:61的氨基酸序列和(b)vl区，其具有seq id no:62 的氨基酸序列。在具体的方面，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结 合片段，其结合抗体的相同或重叠表位，后一抗体包含(a)vh区，其具有 seq id no:81的氨基酸序列和(b)vl区，其具有seq id no:82的氨基酸 序列。
[0430]
可以使用本领域技术人员已知的或本文描述的测定法(例如，x-射线晶 体学，elisa分析等)确定两种抗体是否结合相同表位。可以使用多种本领 域已知方式测量和/或表达亲和力，包括但不限于平衡解离常数(kd)和平衡 缔合常数(ka)。可以通过本领域技术人员已知的技术测定kd，例如生物层 干涉法。
[0431]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 的表位被用作免疫原来产生抗体。参见，例如，第5.3节和第6.2节的产生 抗体的方法。
[0432]
5.1.2功能特征
[0433]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段以低于0.5x10-3
/s、1x10-3
/s、1.5x10-3
/s、2x10-3
/s、2.5x10-3
/s、3x10-3
/s、 4x10-3
/s、5x10-3
/s、6x10-3
/s、7x10-3
/s、8x10-3
/s、9x10-3
/s、1x10-4
/s、 2x10-4
/s、3x10-4
/s、4x10-4
/s、5x10-4
/s、6x10-4
/s、7x10-4
/s或8x10-4
/s的kd结 合muc16。在一些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原 结合片段以约0.5x10-3
/s、1x10-3
/s、1.5x10-3
/s、2x10-3
/s、2.5x10-3
/s、 3x10-3
/s、4x10-3
/s、5x10-3
/s、6x10-3
/s、7x10-3
/s、8x10-3
/s、9x10-3
/s、 1x10-4
/s、2x10-4
/s、3x10-4
/s、4x10-4
/s、5x10-4
/s、6x10-4
/s、7x10-4
/s或 8x10-4
/s的kd结合muc16。在一些实施方案中，本文描述的muc16糖基 化抗体或其抗原结合片段以约0.5x10-3
/s-8x10-4
/s的kd结合muc16。在具体 实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段以约1x10-3
/s 的kd结合muc16。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或 其抗原结合片段以约1.5x10-3
/s的kd结合muc16。在具体实施方案中，本 文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结
合片段以约2x10-3
/s的kd结合 muc16。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结 合片段以约2x10-4
/s的kd结合muc16。在具体实施方案中，本文描述的 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段以约7x10-4
/s的kd结合muc16。
[0434]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段以至少2.5x104/s、3x104/s、3.5x104/s、4x104/s、4.5x104/s、5x104/s、 5.5x104/s、6x104/s、6.5x104/s、7x104/s、7.5x104/s、8x104/s、9x104/s或 9x105/s的ka结合muc16。在一些实施方案中，本文描述的muc16糖基化 抗体或其抗原结合片段以约2.5x104/s、3x104/s、3.5x104/s、4x104/s、 4.5x104/s、5x104/s、5.5x104/s、6x104/s、6.5x104/s、7x104/s、7.5x104/s、 8x104/s、9x104/s或9x105/s的ka结合muc16。在一些实施方案中，本文描 述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段以约4x104/s的ka结合muc16。 在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段以约 6x104/s的ka结合muc16。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化 抗体或其抗原结合片段以约7.5x104/s的ka结合muc16。
[0435]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段以低于1000nm、500nm、100nm、50nm、25nm、20nm、15nm、 10nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.1nm或0.05nm的 kd结合muc16。在一些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段以约1000nm、500nm、100nm、50nm、25nm、20nm、 15nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.1nm或 0.05nm的kd结合muc16。在一些实施方案中，本文描述的muc16糖基 化抗体或其抗原结合片段以约500nm-1000nm的kd结合muc16。在一些 实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段以约5 nm-75nm的kd结合muc16。在具体实施方案中，本文描述的muc16糖 基化抗体或其抗原结合片段以约7nm的kd结合muc16。在另一具体实施 方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段以约10pm的 kd结合muc16。在另一具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段以约15pm的kd结合muc16。在另一具体实施方案中， 本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段以约20pm的kd结合 muc16。在另一具体实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段以约25pm的kd结合muc16。在另一具体实施方案中，本文 描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段以约65pm的kd结合 muc16。如本文使用的，当用于修饰数值或数值范围时，术语“约”表示数 值或数值范围的5％-10％以上和5％-10％以下偏差保留在引用数值或范围的 所期望的含义内。
[0436]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中 第一形式的氨基酸序列是seq id no:133。在某些实施方案中，细胞是癌 细胞(例如，卵巢癌细胞，肺癌细胞，胰腺癌细胞，乳腺癌细胞，输卵管癌 细胞，子宫(例如，子宫内膜)癌细胞或原发性腹膜癌细胞)。在某些实施方 案中，细胞是卵巢癌细胞。在某些实施方案中，细胞是肺癌细胞。在某些 实施方案中，细胞是胰腺癌细胞。在某些实施方案中，细胞是乳腺癌细胞。 在某些实施方案中，细胞是子宫(例如，子宫内膜)癌细胞。在某些实施方 案中，细胞是输卵管癌细胞。在某些实施方案中，细胞是原发性腹膜癌细 胞。在某些实施方案中，细胞是skov3细胞。在某些实施方案中，本文提 供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第一形式的 muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是 seq id no:133，其结合至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、 250、500或1000倍高于同种型对照抗体结合细胞。同
种型对照抗体是本领 域公认的术语。在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化 的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133，其结合约10、20、 30、40、50、60、70、80、90、100、250、500或1000倍高于同种型对照 抗体结合细胞。在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化 的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133，其结合10-50、50-100、 100-250、250-500或500-1000倍高于同种型对照抗体结合细胞。
[0437]
由seq id no:133的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为 muc16
c114
，其由成熟muc16的c端114个氨基酸残基(seq id no:150为 成熟muc16的序列)组成。muc16
c114
能够在seq id no:133位点1、24 和30的天冬酰胺氨基酸处n-糖基化(对应于seq id no:150的氨基酸位点 asn1777，asn1800和asn1806)。
[0438]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未 糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139。在某些实施 方案中，细胞是卵巢癌细胞。在某些实施方案中，细胞是肺癌细胞。在某 些实施方案中，细胞是胰腺癌细胞。在某些实施方案中，细胞是乳腺癌细 胞。在某些实施方案中，细胞是子宫(例如，子宫内膜)癌细胞。在某些实 施方案中，细胞是输卵管癌细胞。在某些实施方案中，细胞是原发性腹膜 癌细胞。在某些实施方案中，细胞是skov3细胞。在某些实施方案中， 第二形式的muc16融合至可检测蛋白，例如，如，绿色荧光蛋白或红色荧 光蛋白。在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的， 且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139，其结合至多1.1、1.2、1.3、 1.4、1.5、2、3、4或5倍高于同种型对照抗体结合细胞。在某些实施方案 中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第二形 式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸 序列是seq id no:139，其结合约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4或5 倍高于同种型对照抗体结合细胞。在某些实施方案中，本文提供的muc16 糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其 第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139， 其结合0-1.1，1.1-1.5，1.5-3或3-5倍高于同种型对照抗体结合细胞。
[0439]
由seq id no:139的氨基酸序列编码的蛋白在本文中也称为 muc16
c114-n3
。muc16
c114-n3
由成熟muc16的c端114个氨基酸残基(seqid no:150为成熟muc16的序列)组成，除了氨基酸位点30的天冬酰胺 (对应seq id no:150氨基酸位点1806)被突变为丙氨酸。从而， muc16
c114-n3
不能在seq id no:139氨基酸位点30(对应seq id no:150 的氨基酸位点asn1806)被n-糖基化。
[0440]
在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的， 且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139，其结合至少3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30或40倍低于4h11结合细 胞。在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其 中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139，其结合约3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、20、30或40倍低于4h11
结合细胞。在某 些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段结合重组 表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形 式的氨基酸序列是seq id no:139，其结合3-5、5-10、10-20或20-40倍低 于4h11结合细胞。
[0441]
用于确定本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段与细胞的 结合的测定法，例如，如，facs，是本领域技术人员已知的。参见，例如， 第6.2节描述的方法。
[0442]
如本文使用的，“4h11”表示rao等，appl.immunohistochem molmorphol，2010、18(5):462-72和国际专利申请公开号wo 2011/119979中的 单克隆抗muc16抗体4h11。
[0443]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段结合一种肽，所述肽包含氨基酸序列ctrngtqlqnftldrssv(seqid no:130)，其中ctrngtqlqnftldrssv(seq id no:130)的4号氨基 酸残基(n4)和10号氨基酸残基(n10)是糖基化的。在某些实施方案中，所 述肽由氨基酸序列ctrngtqlqnftldrssv(seq id no:130)组成，其 中ctrngtqlqnftldrssv(seq id no:130)的4号氨基酸残基(n4)和10 号氨基酸残基(n10)是糖基化的。在某些实施方案中，糖基化包含n连接的 壳二糖。在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段结合一 种肽，所述肽由氨基酸序列cgtqlqnftldrssv(seq id no:131)组成， 其中cgtqlqnftldrssv(seq id no:131)的7号氨基酸残基(n7)是糖基 化的。在某些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列cgtqlqnftldrssv (seq id no:131)，其中cgtqlqnftldrssv(seq id no:131)的7号氨 基酸残基(n7)是糖基化的。在某些实施方案中，糖基化包含n连接的壳二 糖。在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段结合肽混合 物，其中肽混合物包含(a)第一肽，其包含氨基酸序列 ctrngtqlqnftldrssv(seq id no:130)，其中 ctrngtqlqnftldrssv(seq id no:130)的4号氨基酸残基(n4)和10号 氨基酸残基(n10)是糖基化的和(b)第二肽，其包含氨基酸序列 cgtqlqnftldrssv(seq id no:131)，其中cgtqlqnftldrssv(seqid no:131)的7号氨基酸残基(n7)是糖基化的。在某些实施方案中，第一肽 由氨基酸序列ctrngtqlqnftldrssv(seq id no:130)组成，其中 ctrngtqlqnftldrssv(seq id no:130)的4号氨基酸残基(n4)和10号 氨基酸残基(n10)是糖基化的。在某些实施方案中，第二肽由氨基酸序列 cgtqlqnftldrssv(seq id no:131)组成，其中cgtqlqnftldrssv (seq id no:131)的7号氨基酸残基(n7)是糖基化的。在某些实施方案中， 糖基化包含n连接的壳二糖。
[0444]
测定本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段与细胞的结合 的测定法，例如，如，elisa，是本领域技术人员已知的。参见，例如，第 6.2节描述的方法。在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或 其抗原结合片段以相对于抗muc16单克隆抗体4h11与肽结合的至少2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或30 倍之多结合所述肽。在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或 其抗原结合片段以相对于抗muc16单克隆抗体4h11与肽结合的约2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或30 倍之多结合所述肽。
[0445]
在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段以低于0.5x10-3
/s、1x10-3
/s、1.5x10-3
/s、2x10-3
/s、2.5x10-3
/s、3x10-3
/s、4x10-3
/s、5x10-3
/s、6x10-3
/s、7x10-3
/s、8x10-3
/s、9x10-3
/s、1x10-4
/s、 2x10-4
/s、3x10-4
/s、4x10-4
/s、5x10-4
/s、6x10-4
/s、7x10-4
/s或8x10-4
/s的kd结 合所述肽。在一些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原 结合片段以约0.5x10-3
/s、1x10-3
/s、1.5x10-3
/s、2x10-3
/s、2.5x10-3
/s、 3x10
‑3/s、4x10-3
/s、5x10-3
/s、6x10-3
/s、7x10-3
/s、8x10-3
/s、9x10-3
/s、 1x10-4
/s、2x10-4
/s、3x10-4
/s、4x10-4
/s、5x10-4
/s、6x10-4
/s、7x10-4
/s或 8x10-4
/s的kd结合所述肽。在一些实施方案中，本文提供的muc16糖基化 抗体或其抗原结合片段以约0.5x10-3
/s-8x10-4
/s的kd结合所述肽。
[0446]
在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段以至少2.5x104/s、3x104/s、3.5x104/s、4x104/s、4.5x104/s、5x104/s、 5.5x104/s、6x104/s、6.5x104/s、7x104/s、7.5x104/s、8x104/s、9x104/s或 9x105/s的ka结合所述肽。在一些实施方案中，本文提供的muc16糖基化 抗体或其抗原结合片段以约2.5x104/s、3x104/s、3.5x104/s、4x104/s、 4.5x104/s、5x104/s、5.5x104/s、6x104/s、6.5x104/s、7x104/s、7.5x104/s、 8x104/s、9x104/s或9x105/s的ka结合所述肽of。在一些实施方案中，本文 提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段以约2.5x104/s-9x105/s的ka结 合所述肽。
[0447]
在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段以低于1000nm、500nm、100nm、50nm、25nm、20nm、15nm、 10nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.1nm或0.05nm的 kd结合所述肽。在一些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段以约1000nm、500nm、100nm、50nm、25nm、20nm、 15nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.1nm或 0.05nm的kd结合所述肽。在一些实施方案中，本文提供的muc16糖基化 抗体或其抗原结合片段以约500nm-1000nm的kd结合所述肽。
[0448]
在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或抗原结合片段不能免疫特 异性结合氨基酸序列ctrngtqlqnftldrssv(seq id no:130)，其中 ctrngtqlqnftldrssv(seq id no:130)的4号氨基酸残基(n4)和10号 氨基酸残基(n10)不是糖基化的。在某些实施方案中，muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段不能免疫特异性结合氨基酸序列cgtqlqnftldrssv (seq id no:131)，其中cgtqlqnftldrssv(seq id no:131)的7号氨 基酸残基(n7)是糖基化的。在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基 化抗体或其抗原结合片段，不能免疫特异性结合肽混合物，其中所述肽混 合物包含(a)第一肽，包含氨基酸序列ctrngtqlqnftldrssv(seq idno:130)，其中ctrngtqlqnftldrssv(seq id no:130)的4号氨基酸 残基(n4)和10号氨基酸残基(n10)是糖基化的；和(b)第二肽，包含氨基酸 序列cgtqlqnftldrssv(seq id no:131)，其中cgtqlqnftldrssv (seq id no:131)的7号氨基酸残基(n7)是糖基化的。
[0449]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段抑制重组表达一种形式的muc16的体外基质胶侵袭细胞，该形式的 muc16是糖基化的，且其氨基酸序列是seq id no:133(muc16
c114
)。在 某些实施方案中，重组表达糖基化的muc16
c114
的细胞是skov3细胞。在 某些实施方案中，糖基化形式的muc16
c114
是n-糖基化的。在某些实施方 案中，糖基化形式的muc16
c114
在氨基酸残基asn30(对应成熟muc16 (seq id no:150)的asn1806)处是n-糖基化的。在某些实施方案中，糖基化 形式的muc16
c114
在氨基酸残基asn 24和asn30(分别对应成熟muc16 (seq id no:150)的asn1800和asn1806)处是n-糖基化的。在某些实施方 案中，糖基化形式的muc16
c114
在氨基酸残基asn1，asn24和asn30(分别 对应成熟muc16(seq id no:150)的asn1777，asn1800和asn1806)处是 n-糖基化的。在某些实施方案中，糖基化包含n连接的壳二糖。在某些实 施方案中，糖基化由n连接的壳二糖组成。在某些实施方案中，与用对照 抗体(例如，不靶向muc16的抗体)或4h11处理的细胞的体外基
质胶侵袭 相比，基质胶侵袭被抑制至少1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9 或10倍。在某些实施方案中，与用对照抗体(例如，不靶向muc16的抗体) 或4h11处理的细胞的体外基质胶侵袭相比，基质胶侵袭被抑制约1.25、1.5、 1.75、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
[0450]
测定muc16糖基化抗体或抗原结合片段介导的基质胶侵袭的抑制的 测定法是本领域技术人员已知的。参见例如第6.2节中描述的方法。例如， 可以从bd biosciences，ma购买bd biocoat
tm matrigel
tm
侵袭插入物或室 (24孔板中，目录#354480)和对照插入物(24孔板中，目录#354578)。基质 胶侵袭分析可以按照制造商的方案进行。简言之，允许24孔板(-20℃储存) 和对照插入物(4℃储存)的基质胶室达到室温。在24孔板的内部(insert)以及 外部孔中将两种插入物用0.5ml无血清培养基在37℃5％co2加湿培养箱 中再水化2小时。培养的skov3细胞被胰蛋白酶化并用培养基洗涤。将一 百万个细胞分离至另一离心管并用无血清培养基洗涤3次。稍后调整这些 细胞以在0.5ml无血清培养基中得到5,000个细胞。去除再水化插入物中的 培养基，并将插入物转移到新的24孔板中，所述24孔板在孔中含有0.75ml 的含10％胎牛血清(fbs)培养基，该培养基用作化学引诱剂。立即将0.5ml 无血清培养基中的细胞(5,000个细胞)加入到插入物中。要适当注意，没有 气泡被困在插入物和外部的孔中。将24孔板在37℃5％co2加湿培养箱中 孵育48小时。孵育后，通过将棉花尖棉签插入基质胶或对照插入物中并轻 轻地施加压力，同时将棉签的尖端移动到膜表面上，通过“擦洗”从膜的上表 面去除非侵袭细胞。用浸有培养基的第二个棉签重复擦洗过程。然后将插 入物在含有0.5％结晶紫染色剂的0.5ml蒸馏水中的新24孔板中染色30分 钟。染色后，将插入物在3个蒸馏水烧瓶中冲洗以除去多余的染色剂。在 新的24孔板中将插入物风干。在倒置显微镜下以200倍放大倍率手工计数 侵袭细胞。计数三个平行膜的几个领域，并记录在图中。
[0451]
在某些实施方案中，本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 能够在小鼠模型研究中抑制或减少转移，抑制肿瘤生长或诱导肿瘤退化。 例如，可以将肿瘤细胞系导入无胸腺裸鼠，并且可以对无胸腺小鼠施用本 文所述的muc16糖基化抗体一次或多次，并且可以在几周和/或几个月内 监测注射的肿瘤细胞的肿瘤进展。在一些情况下，将muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段给予无胸腺裸鼠可以在引入肿瘤细胞系之前进行。在某 个实施方案中，表达muc16
c114
的skov3细胞被用于本文所述的小鼠异种 移植模型。参见例如第6.2节和第6.3节。
[0452]
在具体的实施方案中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的方法 进行评价，与模拟物处理的小鼠相比，本文描述的muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段在小鼠模型中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤退化至少约5％、10％、 15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％。在具体的实施方案中， 按照本文描述的或本领域技术人员已知的方法进行评价，与模拟物处理的 小鼠相比，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段在小鼠模型中 抑制肿瘤生长或诱导肿瘤退化至少约25％或35％、可选的约75％。在具体 的实施方案中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的方法进行评价， 与模拟物处理的小鼠相比，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段在小鼠模型中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤退化至少约1倍、1.2倍、1.3倍、 1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7 倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、 80倍、90倍或100倍。模拟物处理的小鼠可使
用磷酸盐缓冲盐水或对照(例 如，抗igg抗体)进行处理。
[0453]
可以例如通过在一段时间内监测肿瘤大小，例如通过可触诊肿瘤的物 理测量或其它视觉检测方法来评估确定肿瘤生长抑制或肿瘤退化。例如， 可以产生肿瘤细胞系以重组表达例如绿色荧光蛋白(gfp)或荧光素酶等可 视化试剂，然后可以通过显微镜进行gfp的体内可视化，以及可以通过向 异种移植小鼠施用荧光素酶底物并检测由荧光素酶处理荧光素酶底物引起 的发光进行荧光素酶的体内可视化。gfp或荧光素酶的检测程度或水平与 异种移植小鼠中肿瘤的大小有关。
[0454]
在某些实施方案中，与模拟物处理的小鼠相比，本文描述的muc16 糖基化抗体或其抗原结合片段能够增加肿瘤异种移植模型中动物的存活 率。在具体的实施方案中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的方法 进行评价，与模拟物处理的小鼠相比，本文描述的muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段使肿瘤异种移植模型中动物的存活率增加至少约5％、10％、 15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在具体的实施方案中，按照 本文描述的或本领域技术人员已知的方法进行评价，与模拟物处理的小鼠 相比，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段使肿瘤异种移植模 型中动物的存活率增加至少约25％或35％、可选的约75％。在具体的实施 方案中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的方法进行评价，与模拟 物处理的小鼠相比，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段使肿 瘤异种移植模型中动物的存活率增加至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、 1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、 9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、 90倍或100倍。可以通过例如在肿瘤细胞系注射后相对于时间(例如，天数 或周数)标绘存活小鼠数量的存活曲线来测定存活率。模拟物处理的小鼠可 使用磷酸盐缓冲盐水或对照(例如，抗igg抗体)进行处理。
[0455]
在某些实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 在细胞与muc16糖基化抗体或其抗原结合片段接触时被内化入表达一种 形式的muc16的细胞，所述形式的muc16是糖基化的，且其氨基酸序列 是seq id no:133(muc16
c114
)。当指向一种被细胞内化的分子时，“内化的
”ꢀ
或“内化”表示该与细胞膜的胞外表面接触的分子穿过细胞膜到达细胞膜的 胞内表面和/或进入细胞质。在某些实施方案中，重组表达糖基化muc16
c114
的细胞是skov3细胞。在某些实施方案中，糖基化形式的muc16
c114
是 n-糖基化的。在某些实施方案中，糖基化形式的muc16
c114
在氨基酸残基 asn30(对应成熟muc16(seq id no:150)的asn1806)处n-糖基化。在某些 实施方案中，糖基化形式的muc16
c114
在氨基酸残基asn 24和asn30(分别 对应成熟muc16(seq id no:150)的asn1800和asn1806)处n-糖基化。在 某些实施方案中，糖基化形式的muc16
c114
在氨基酸残基asn1，asn24和 asn30(分别对应成熟muc16(seq id no:150)的asn1777，asn1800和 asn1806)处n-糖基化。在某些实施方案中，糖基化包含n连接的壳二糖。 在某些实施方案中，糖基化由n连接的壳二糖组成。
[0456]
确定本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段内化至细胞的 测定法，例如，如使用放射性标记抗体是本领域技术人员已知的。参见例 如第6.2节中描述的方法。例如，可以在表达muc16
c114
的skov3细胞上 研究
89
zr标记的抗体的内化。简言之，将约1
×
105个细胞接种在12孔板中， 并在37℃ 5％co2培养箱中温育过夜。向每个孔中加入一体积的放射性标 记的蛋白质，并将板在37℃和4℃下孵育1，5，12和24小时。在每个孵 育期后，收
集培养基，并用1ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)冲洗细胞。通过在4℃ 下用1ml的含100mm甘氨酸(1:1，ph3.5)的100mm乙酸中洗涤细胞来收 集表面结合的活性。然后将粘附的细胞用1ml的1m naoh裂解。收集每 次的洗涤液并进行活性计数。使用最终洗涤液的活性与所有洗涤液的总活 性的比例来确定内化的％。在某些实施方案中，测定在37℃下进行。在某 些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段在至少百分之1、2、 3、5、6、7、8、9或10的与muc16糖基化抗体或其抗原结合片段一起孵 育的细胞中内化。在某些实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段在约百分之1、2、3、5、6、7、8、9或10的与muc16糖基化抗体或 其抗原结合片段一起孵育的细胞中内化。在某些实施方案中，muc16糖基 化抗体或其抗原结合片段在细胞与muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 接触的1、2、3、4、8、12、16、20或24小时中内化。
[0457]
5.2抗体缀合物
[0458]
在优选的实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段(参见第5.1节)不缀合至任何其它分子，例如有机部分，可检测标记或同 位素。在可选实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段(参见第5.1节)缀合至一个或多个有机部分。在可选实施方案中，本文提 供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段缀合至一个或多个可检测标记。 在可选实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段缀合 至一个或多个同位素。
[0459]
5.2.1可检测标记和同位素
[0460]
在某些实施方案中，本文提供了muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 (参见第5.1节)缀合物，其中所述muc16糖基化抗体或其抗原结合片段缀 合至一种或多种试剂，例如，显影剂或细胞毒性剂。本文还提供了双特异 性抗体缀合物，其中所述双特异性抗体缀合至一种或多种试剂，例如，显 影剂或细胞毒性剂。本文还提供了抗体重链缀合物，其中所述抗体重链缀 合至一种或多种试剂，例如，显影剂或细胞毒性剂。本文还提供了抗体轻 链缀合物，其中所述抗体轻链缀合至一种或多种试剂，例如，显影剂或细 胞毒性剂。本文还提供了融合蛋白缀合物，其中所述融合蛋白缀合一种试 剂，例如，显影剂或细胞毒性剂。在某些实施方案中，试剂共价或非共价 缀合。
[0461]
在某些实施方案中，成像剂是可检测标记，例如显色剂、酶剂、放射 性同位素剂、同位素剂、荧光剂、毒性剂、化学发光剂、核磁共振造影剂 或其它标记。
[0462]
合适的显色标记的非限制性实例包括二氨基联苯胺和4-羟基偶氮苯-2
‑ꢀ
羧酸。
[0463]
合适的酶标记的非限制性实例包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、 δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、 过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、 核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙 酰胆碱酯酶。
[0464]
合适的放射性同位素的非限制性实例包括3h、
111
in、
125
i、
131
i、
32
p、 35
s、
14
c、
51
cr、
57
to、
58
co、
59
fe、
75
se、
152
eu、
90
y、
67
cu、
217
ci、
211
at、 212
pb、
47
sc、
223
ra、
223
ra、
89
zr、
177
lu和
109
pd。在某些实施方案中，
111
in 是用于体内成像的优选同位素，因为它避免了
125
i或
131
i标记的muc16糖 基化抗体或其抗原结合片段在肝脏中脱卤的问题。此外，
111
in具有更有利 的成像伽马发射能(perkins等人，eur.j.nucl.med.70:296-301(1985)； carasquillo等，j.nucl.med.25:281-287(1987))。例如，与具有1-(p-异硫 氰酸苄基)-dpta的单克隆抗体
偶联的
111
in在非肿瘤组织，特别是肝脏中几 乎没有摄取，因此增强了肿瘤定位的特异性(esteban等，j.nucl.med. 28:861-870(1987))。
[0465]
合适的非放射性同位素标记的非限制性实例包括
157
gd、
55
mn、
162
dy、 52
tr和
56
fe。
[0466]
合适的荧光标记的非限制性实例包括
152
eu标记、荧光素标记、异硫氰 酸酯标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、 绿色荧光蛋白(gfp)标记、邻苯二甲醛标记和荧光胺标记。
[0467]
化学发光标记的非限制性实例包括鲁米诺标记、异亮氨酸标记、芳族 吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、萤光素标记、荧光素 酶标记和水母发光蛋白标记。
[0468]
核磁共振对比剂的非限制性实例包括重金属核，例如gd、mn和铁。
[0469]
本领域普通技术人员已知的用于将上述标记与所述muc16糖基化抗 体或其抗原结合片段、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链和融合蛋白缀 合的技术描述于例如，kennedy等，clin.cmm.acta 70:1-31(1976)和schurs 等，clin.cmm.acta 81:1-40(1977)。后者所述的偶联技术是戊二醛法、高 碘酸盐法、二马来酰亚胺法、间马来酰亚胺基苄基-n-羟基-琥珀酰亚胺酯法， 所有这些方法均通过引用并入本文。
[0470]
细胞毒性剂的非限制性实例包括细胞抑制剂或杀细胞剂、放射性金属 离子、例如α-发射体和毒素、例如假单胞菌外毒素、相思豆毒素、霍乱毒 素、蓖麻毒蛋白a和白喉毒素。
[0471]
在某些实施方案中，所述试剂是诊断试剂。诊断试剂是通过定位含有 抗原的细胞来诊断或检测疾病的试剂。有用的诊断剂包括但不限于放射性 同位素、染料(例如具有生物素-链霉亲和素复合物)、对比剂、荧光化合物 或分子以及用于磁共振成像(mri)的增强剂(例如顺磁离子)。美国专利号 6,331,175描述了mri技术和与mri增强剂缀合的抗体的制备，并通过引 用整体并入本文。优选地，诊断剂选自放射性同位素，用于磁共振成像的 增强剂和荧光化合物。为了用放射性金属或顺磁性离子负载muc16糖基化 抗体或其抗原结合片段，可能需要将其与具有长尾巴的试剂反应，后者附 着多个螯合基团以结合离子。这样的尾巴可以是聚合物，例如聚赖氨酸， 多糖或具有侧基的其它衍生化或可衍生的链，所述侧基可以结合螯合基团， 例如乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、卟啉、聚胺、冠 醚、双缩氨基硫脲、聚肟基等已知可用于该目的的基团。螯合剂使用标准 化学与抗体偶联。螯合剂通常通过能够与分子形成键的基团与抗体连接， 其具有最小的免疫反应性损失和最小聚集和/或内部交联，螯合剂与抗体缀 合的其它更为不寻常的方法和试剂公开于1989年4月25日授权的题为
ꢀ“
antibody conjugates”的hawthorne的美国专利号4,824,659，其公开内容通 过引用整体并入本文。特别有用的金属螯合剂组合包括2-苄基-dtpa及其 单甲基和环己基类似物，与用于放射成像的诊断同位素一起使用。当与本 文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段一起使用时，当与非放射性 金属如锰，铁和钆络合时，相同的螯合剂可用于mri。大环螯合剂如nota， dota和teta可分别用于各种金属和放射性金属，尤其是镓，钇和铜的 放射性核素。通过将环尺寸调整(tailoring)适合感兴趣的金属，可以使这种 金属-螯合剂复合物非常稳定。本文还包括用于稳定结合核素的其它环型螯 合剂如大环聚醚如用于rait的
223
ra。
[0472]
在某些实施方案中，试剂是有机试剂。该有机试剂可以产生具有改善 的药代动力学性质(例如体内血清半衰期增加)的缀合物。有机部分可以是亲 水性聚合物基团，脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文所用，术语“脂肪酸
”ꢀ
包括单羧酸和二羧酸。如本文所用，“亲
水性聚合物基团”是指在水中比在辛 烷中更可溶的有机聚合物，例如聚赖氨酸。适用于改性本文提供的muc16 糖基化抗体或其抗原结合片段的亲水性聚合物可以是直链或支链的，包括 例如聚链烷二醇(例如聚乙二醇、(peg)、单甲氧基-聚乙二醇和聚丙二醇)、 碳水化合物(例如葡聚糖、纤维素、寡糖和多糖)、亲水氨基酸的聚合物(例 如聚赖氨酸、聚精氨酸和聚天冬氨酸)、聚烷氧化物(例如聚乙烯氧化物和聚 丙烯氧化物)和聚乙烯吡咯烷酮。在某些实施方案中，修饰本文提供的 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，抗体重链，抗体轻 链或融合蛋白的亲水性聚合物作为一个单独的分子实体具有约800至约 150,000道尔顿的分子量。例如可以使用peg
5000
和peg
20,000
、其中下标是道 尔顿中聚合物的平均分子量。亲水性聚合基团可以被一至六个烷基、脂肪 酸或脂肪酸酯基团取代。用脂肪酸或脂肪酸酯基取代的亲水性聚合物可以 通过采用合适的方法制备。例如，包含胺基的聚合物可以与脂肪酸或脂肪 酸酯的羧酸酯偶合，脂肪酸或脂肪酸酯上的活化的羧酸酯(例如，用n，n
‑ꢀ
羰基二咪唑活化)可以与聚合物上的羟基偶联。
[0473]
适于修饰本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，双特异性 抗体，抗体重链，抗体轻链或融合蛋白的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的 或可以含有一种或更多的不饱和单位。适于修饰本文提供的muc16糖基化 抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，抗体重链，抗体轻链或融合蛋白 的脂肪酸包括例如正十二烷酸盐、正十四烷酸盐、正十六烷酸盐、正二十 烷酸盐、正二十烷酸盐、正三酸甘油酸盐、正四十烷酸盐、顺-δ-9-十八烷 酸盐、所有顺式-δ-5,8,11,14-二十碳五烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八 烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括含有直链或支链低级烷基 的二羧酸单酯。低级烷基可包含1至约12个，优选1至约6个碳原子。
[0474]
本文提供的缀合物可以使用合适的方法制备，例如通过与一种或多种 改性剂反应。如本文所用，“活化基团”是化学部分或官能团，其在适当条件 下可与第二化学基团反应，从而在改性剂和第二化学基团之间形成共价键。 例如，胺反应活化基团包括亲电子基团，例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤 素(氯、溴、氟、碘)、n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)等。可以与硫醇反应的活 化基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5
‑ꢀ
硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(tnb-硫醇)等。醛官能团可以与含胺或酰肼的分子 偶联，并且叠氮基可以与三价磷基反应形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将 活化基团引入分子的合适方法是本领域已知的(参见例如hernanson，g.t.， bioconjugate techniques，academic press：san diego，calif.(1996))。可以 将活化基团直接键合到有机基团(例如亲水性聚合物，脂肪酸，脂肪酸酯) 上或通过接头部分例如二价c
1-c
12
基团键合，其中一个或多个碳原子可以 被诸如氧，氮或硫的杂原子取代。合适的接头部分包括例如四甘醇，(ch2)3和nh。包含接头部分的修饰剂可以例如通过在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基) 碳化二亚胺(edc)的存在下使单boc-烷基二胺(例如单boc-乙二胺或单boc
‑ꢀ
二氨基己烷)与脂肪酸反应来制备，以形成游离胺和脂肪酸羧酸酯之间的酰 胺键。可以通过用三氟乙酸(tfa)处理将boc保护基从产物中除去，以暴露 可以如所述偶联至另一羧酸酯的伯胺，或者可以与马来酸酐反应，并将所 得产物环化以产生活化的马来酰亚胺脂肪酸的衍生物。(参见例如 thompson等人，wo 92/16221，其全部教导通过引用并入本文)。
[0475]“改性剂”可以指包含活化基团的合适的有机基团(例如亲水聚合物，脂 肪酸和脂肪酸酯)。例如，有机部分可以通过使用胺反应性改性剂，例如peg 的n-羟基琥珀酰亚胺酯，
以非位点特异性方式与muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段结合。修饰的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段也可以通 过将muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，抗体重链，抗 体轻链或融合蛋白的二硫键(例如，链内二硫键)还原进行制备。然后可以将 还原的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，双特异性抗体，抗体重链， 抗体轻链或融合蛋白与硫醇反应性改性剂反应，以产生本文提供的缀合物。 包含与本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的特定位点结合 的有机部分的缀合物可以使用合适的方法制备，例如反向蛋白水解(fisch等 人，bioconjugate chem.，3：147-153(1992)；werlen等人，bioconjugate chem.， 5：411-417(1994)；kumaran等人，protein sci.6(10)：2233-2241(1997)；itoh 等人，bioorg.chem.，24(1)：59-68(1996)；capellas等人，biotechnol. bioeng.，56(4)：456-463(1997))和hermanson，gt，bioconjugate techniques， academic press：san diego，calif(1996)。
[0476]
5.3抗体生产
[0477]
5.3.1生产和筛选抗体
[0478]
在另一方面，本文提供了生产muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的 方法(参见第5.1节和第5.2节)。
[0479]
本文所述的抗体或其抗原结合片段可以通过本领域已知的用于合成抗 体的任何方法来产生，例如通过化学合成或通过重组表达技术。除非另有 说明，否则本文所述的方法在分子生物学、微生物学、遗传分析、重组dna、 有机化学、生物化学、pcr、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交和相关领域中 均采用本领域的常规技术。这些技术描述于例如本文引用的参考文献中， 并在文献中得到充分解释。参见，例如，maniatis t等，(1982)molecularcloning：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press， sambrook j等，(1989)，molecular cloning：a laboratory manual，第二版， cold spring harbor laboratory press，sambrook j等，(2001)molecularcloning：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，coldspring harbor，ny，ausubel fm等，current protocols in molecular biology， john wiley&sons(1987年，每年更新)，current protocols in immunology， john wiley&sons(1987年，每年更新)gait(编)(1984)oligonucleotidesynthesis：a practical approach，irl press，eckstein(编)(1991) oligonucleotides和analogues：a practical approach，irl press，birren b 等，(编)(1999)genome analysis：a laboratory manual，cold spring harborlaboratory press。
[0480]
在具体实施方案中，本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 是通过任何方式制备，表达，产生或分离的抗体(例如，重组抗体)，其涉及 创建，例如通过合成，dna序列遗传工程。在某些实施方案中，此类抗体 包含由在动物或哺乳动物(例如人)体内的抗体种系谱中非天然存在的dna 序列编码的序列。在具体实施方案中，本文所述的muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段通过包括使用糖基化形式的seq id no：129，seq id no： 130和/或seq id no：131的方法制备。在具体实施方案中，seq id no： 129，seq id no：130和/或seq id no：131的糖基化形式用一个或多个 壳二糖进行糖基化。有关如何产生本文所述的抗体的详细描述参见第6.2 节、第6.3节和第6.4节。
[0481]
在某一方面，本文提供了包含一个或多个糖基化位点的免疫原性糖肽， 其中(i)
免疫原性糖肽是10-60个氨基酸残基、10-30个氨基酸残基、15-25 个氨基酸残基、15-20个氨基酸残基或15-18个氨基酸残基长和(ii)该一个或 多个糖基化位点的至少一个连接碳水化合物。
[0482]
在一些实施方案中，免疫原性糖肽包含1、2或3个糖基化位点。在具 体实施方案中，免疫原性糖肽包含一个糖基化位点。在另一具体实施方案 中，免疫原性糖肽包含两个糖基化位点。
[0483]
在具体的实施方案中，免疫原性糖肽包含一个连接碳水化合物的糖基 化位点。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽包含两个分别连接碳水化合 物的糖基化位点。
[0484]
与免疫原性糖肽的一个或多个糖基化位点连接的碳水化合物可以是n
‑ꢀ
连接的碳水化合物，o-连接的碳水化合物或c-连接的碳水化合物。n-连接 的碳水化合物与天冬酰胺残基相连，是自然界中最常见的形式。大多数n
‑ꢀ
连接的碳水化合物与glcnac-β-asn形式的肽连接。o-连接的碳水化合物 连接到氨基酸羟基侧链(通常来自丝氨酸或苏氨酸)。大多数o-连接的碳水 化合物与glcnac-β-ser/thr或glcnac-α-ser/thr形式的肽连接。c-连接的 碳水化合物是指与色氨酸残基相连的甘露糖，是自然界中最少见的形式。 在一个实施方案中，免疫原性糖肽中的碳水化合物是n-或o-连接的碳水化 合物。在具体实施方案中，免疫原性糖肽中的碳水化合物是n-连接的碳水 化合物。
[0485]
与免疫原性糖肽的一个或多个糖基化位点连接的碳水化合物可以是单 糖、二糖、寡糖(例如三糖、四糖或五糖)或多糖。在某些实施方案中，碳水 化合物是单糖、二糖、三糖、四糖或五糖。在具体实施方案中，碳水化合 物是二糖。在具体实施方案中，二糖是壳二糖。在另一具体实施方案中， 碳水化合物是man3glcnac2。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽的n端 是乙酰化的。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽的c端是n-甲基甲酰胺 衍生物的形式。
[0486]
在某些实施方案中，免疫原性糖肽与免疫原性载体蛋白缀合。在大多 数情况下，小抗原(例如短肽或小型半抗原)不足够复杂，不能诱导产生抗体。 免疫原性载体蛋白由于其大的尺寸和复杂的结构，可赋予缀合的小抗原免 疫原性，导致针对小抗原和免疫原性载体蛋白上的表位产生抗体。因此， 小抗原总是与免疫原性载体蛋白化学偶联，以加强免疫应答从而成功产生 抗体。通常使用的免疫原性载体蛋白包括但不限于匙孔血蓝蛋白(klh)，小 脑泡藻血蓝蛋白(cch)，牛血清白蛋白(bsa)和卵白蛋白(ova)。在具体实 施方案中，免疫原性糖肽与klh缀合。klh是属于一组称为血蓝蛋白的 非血红蛋白的含铜多肽，它们在节肢动物和软体动物中被发现。klh分离 自锁孔帽贝(megathura crenulata)。由于其与哺乳动物的进化距离，高分子 量，复杂结构以及含有提供伯胺作为缀合目标的数百个赖氨酸基团的大表 面，klh是哺乳动物中具有极大免疫原性的和有效的载体蛋白。
[0487]
在某些实施方案中，免疫原性糖肽是10-60个氨基酸残基长。在一些实 施方案中，免疫原性糖肽是10-30个氨基酸残基长。在一些实施方案中，免 疫原性糖肽是15-25个氨基酸残基长。在一些实施方案中，免疫原性糖肽是 15-20个氨基酸残基长。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽是15-18个氨 基酸残基长。在该具体实施方案的一个特定方面，其中免疫原性糖肽是 15-18个氨基酸残基长，免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。在该 具体实施方案的另一特定方面，其中免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基 长，免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。在具体实施方 案中，免疫原性糖肽是55个氨基酸
残基长。在该具体实施方案的一个特定 方面，其中免疫原性糖肽是55个氨基酸残基长，免疫原性糖肽包含连接壳 二糖的糖基化位点。在具体实施方案中，免疫原性糖肽是18个氨基酸残基 长。在该具体实施方案的一个特定方面，其中免疫原性糖肽是18个氨基酸 残基长，免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。在另一具 体实施方案中，免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长。在该具体实施方案的 一个特定方面，其中免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长，免疫原性糖肽包 含连接壳二糖的糖基化位点。
[0488]
在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含seq id no:150的氨基酸序列 的至少10个氨基酸部分，且该一个或多个糖基化位点的至少一个免疫原性 糖肽位于所述氨基序列部分内。在某些其它实施方案中，免疫原性糖肽包 含seq id no:150的氨基酸序列的至少15、20、25或30个氨基酸部分， 且该一个或多个糖基化位点的至少一个免疫原性糖肽位于所述氨基序列部 分内。在具体的实施方案中，免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基长。在具 体的实施方案中，免疫原性糖肽是55个氨基酸残基长。在具体的实施方案 中，免疫原性糖肽包含seq id no:129的氨基酸序列。在具体实施方案中， 免疫原性糖肽是55个氨基酸残基长并包含seq id no:129的氨基酸序列。 在具体实施方案中，包含seq id no:129的氨基酸序列的免疫原性糖肽在 第30位残基(asn)包含连接壳二糖的糖基化位点。在另一具体实施方案中， 包含seq id no:129的氨基酸序列的免疫原性糖肽在seq id no:129第30 位残基(asn)包含连接man3glcnac2部分的糖基化位点。在具体的实施方案 中，免疫原性糖肽是18个氨基酸残基长。在具体的实施方案中，免疫原性 糖肽包含seq id no:130的氨基酸序列。在具体实施方案中，免疫原性糖 肽是18个氨基酸残基长并包含seq id no:130的氨基酸序列。在具体实施 方案中，包含seq id no:130的氨基酸序列的免疫原性糖肽在第4位残基 (asn)和第10位残基(asn)包含两个糖基化位点，其分别连接壳二糖。在具 体的实施方案中，免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长。在具体的实施方案 中，免疫原性糖肽包含seq id no:131的氨基酸序列。在具体实施方案中， 免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长并包含seq id no:131的氨基酸序列。 在具体实施方案中，包含seq id no:131的氨基酸序列的免疫原性糖肽在 第7位残基(asn)包含连接壳二糖的糖基化位点。
[0489]
在另一方面，本文提供了产生特异性结合糖蛋白的抗体或其抗原结合 片段的方法，包括用包含如上所述一个或多个糖基化位点的免疫原性糖肽 来免疫对象。在某些实施方案中，免疫原性糖肽包含糖蛋白氨基酸序列的 至少10个氨基酸的部分且免疫原性糖肽的一个或多个糖基化位点的至少一 个位于所述氨基酸序列部分之内。在其它某些实施方案中，免疫原性糖肽 包含糖蛋白的至少15、20、25或30个氨基酸部分的氨基酸序列，且免疫 原性糖肽的一个或多个糖基化位点的至少一个位于所述氨基酸序列部分之 内。在具体实施方案中，糖蛋白包含seq id no:150的氨基酸序列。在具 体实施方案中，抗体或其抗原结合片段不能特异性结合非糖基化形式的糖 蛋白。按照本文描述的方法免疫的对象可以是，但不限于，山羊、绵羊、 驴、鸡、豚鼠、大鼠、兔或小鼠。在一些实施方案中，按照本文描述的方 法免疫的对象是大鼠、兔或小鼠。在具体实施方案中，按照本文描述的方 法免疫的对象是小鼠。对对象的免疫可以使用任何本领域已知方法进行， 例如，通过对对象给予免疫原性糖肽和佐剂，如实施例2和实施例3所述(参 见第6.2节和第6.3节)。
[0490]
在另一方面，本文还提供了制备本文所述的免疫原性糖肽的方法。在 某些实施方案中，制备免疫原性糖肽的方法包括将本文所述的免疫原性糖 肽的一个或多个糖基化位
点与碳水化合物(例如，壳二糖)连接。在某些实施 方案中，制备免疫原性糖肽的方法还包括合成肽部分。免疫原性糖肽的肽 部分可以通过本领域已知的任何方法合成，例如通过如实施例2中所述的 fmoc固相肽合成(参见第6.2节)。在某些实施方案中，在合成免疫原性糖 肽期间，一个或多个糖基化位点处的氨基酸(例如天冬酰胺)被保护基团保 护。在一个具体的实施方案中，肽部分的仅一个天冬酰胺残基与碳水化合 物(例如壳二糖)连接，天冬酰胺上的保护基是烯丙基。在另一具体实施方案 中，肽部分的多于一个(例如两个)天冬酰胺残基各自与碳水化合物(例如， 壳二糖)连接，天冬酰胺残基上的保护基是o-2-苯基异丙基酯(o-2-phi pr， opp)。连接步骤可以通过本领域已知的任何方法进行。在优选的实施方案 中，碳水化合物部分与肽部分连接，使用如实施例2所述的单烧瓶天冬氨 酰化/去保护程序(参见第6.2.2.1节)。
[0491]
产生muc16糖基化的方法本文所述的抗体或其抗原结合片段是本领 域普通技术人员已知的，例如通过化学合成，通过从生物来源纯化，或通 过重组表达技术，包括例如，来自哺乳动物细胞或转基因制剂。除非另有 说明，否则本文所述的方法在分子生物学、微生物学、遗传分析、重组dna、 有机化学、生物化学、pcr、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交和相关领域中 均采用本领域常规技术。这些技术例如在本文引用的参考文献中有描述， 并在文献中得到充分解释。参见，例如，maniatis等(1982)molecular cloning： a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，sambrook等 (1989)，molecular cloning：a laboratory manual，第二版，cold spring harborlaboratory press，sambrook等(2001)molecular cloning：a laboratorymanual，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，ny， ausubel等，current protocols in molecular biology，john wiley&sons(1987 年，每年更新)，current protocols in immunology，john wiley&sons(1987 年，每年更新)gait(编)(1984)oligonucleotide synthesis：a practicalapproach，irl press，eckstein(编)(1991)oligonucleotides和analogues：apractical approach，irl press，birren等(编)(1999)genome analysis：alaboratory manual，cold spring harbor laboratory press。
[0492]
本领域中存在用于产生本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段的多种方法(参见第5.1节和第5.2节)。例如，muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段可以通过重组dna方法制备，例如美国专利号4,816,567中 描述的方法。编码本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的一种 或多种dna可以容易地用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够特异 性结合编码鼠抗体的重链和轻链或来自人、人源化或其它来源的重链和轻 链的基因的寡核苷酸探针)。一旦分离，可将dna置于表达载体中，然后 将其转化入宿主细胞如ns0细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细 胞、酵母细胞、藻类细胞、卵或骨髓瘤细胞中，其不会产生免疫球蛋白， 以获得重组宿主细胞中muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的合成。也可 以通过将编码所需物种的重链和轻链恒定区的序列替换为同源人序列(美国 专利号4,816,567；morrison等，同上)或通过将免疫球蛋白编码序列共价连 接到全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列来对dna进行修饰。该非免 疫球蛋白多肽可以替换为本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段的恒定区。在某些实施方案中，dna如第5.3.2节所述。
[0493]
还可以使用至少一种muc16糖基化抗体或其抗原结合片段编码多核 苷酸来制备
本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，以提供转基 因动物或哺乳动物，例如山羊，牛，马，羊等，在其乳汁中产生这样的抗 体。可以使用已知方法提供这样的动物。参见，例如，但不限于，美国专 利号5,827,690、5,849,992、4,873,316、5,849,992、5,994,616、5,565,362、 5,304,489等，其各自全文引入作为参考。
[0494]
在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 可另外使用编码本文提供的至少一种muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段的多核苷酸进行制备，所述多核苷酸用于提供转基因植物，培养植物细 胞(例如但不限于烟草和玉米)，其在植物部分或在其中培养的细胞中产生此 类抗体、特定部分或变体。作为非限制性实例，表达重组蛋白的转基因烟 草叶已经成功地用于提供大量的重组蛋白，例如使用诱导型启动子。参见， 例如，curr.top.microbol.immunol.240:95-118(1999)及其中引用的参考文 献。此外，转基因玉米已被用于以商业生产水平表达哺乳动物蛋白质，其 生物活性与其它重组体系中产生的或者从天然来源纯化的生物活性相当。 参见例如hood等，adv.exp.med.biol.464:127-147(1999)及其中引用的参 考文献。抗体还大量产生自包括抗体片段如scfv的转基因植物种子，包括 烟草种子和马铃薯块茎。参见，例如，conrad等，plant mol.biol.38:101-109 (1998)及其中引用的参考文献。因此，muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段也可以使用转基因植物根据已知方法产生。另见，例如，fischer等， biotechnol.appl.biochem.30:99-108(1999年10月)，ma等，trendsbiotechnol.13:522-7(1995)，ma等，plant physiol.109:341-6(1995)， whitelam等，biochem soc.trans.22:940-944(1994)及其中引用的参考文 献。上述各参考文献全部并入本文作为参考。
[0495]
在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 可以使用本文提供的至少一种编码muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 的多核苷酸来制备，以提供产生此类muc16糖基化抗体或抗原结合片段的 细菌。作为非限制性实例，表达重组蛋白的大肠杆菌已经成功地用于提供 大量的重组蛋白。参见例如verma等人，1998，216(1-2)：165-181及其中 引用的参考文献。
[0496]
制备多特异性(例如，双特异性抗体)的方法已有描述，参见，例如，美 国专利号7,951,917、7,183,076、8,227,577、5,837,242、5,989,830、5,869,620、 6,132,992和8,586,713。
[0497]
在某些实施方案中，本文提供的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 (参见第5.1节和第5.2节)被用于产生双特异性抗体。可以通过融合两个杂 交瘤以产生具有两个结合位点的杂合免疫球蛋白分子来制备双特异性抗 体。双特异性抗体不仅将肿瘤移植(handcuff)至t细胞，它们还交联t细胞 上的cd3并启动激活级联。这样，基于t细胞受体的细胞毒性被重定向到 绕过mhc限制的期望的肿瘤靶标。用抗cd3-抗-muc16双特异性结合分 子装入多克隆活化的t细胞(atc)，组合了muc16糖基化抗体的靶向特异 性和t细胞的非mhc限制性穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒性。双特异性结 合分子bsab或bite可以在输注到患者体内之前装备体外扩增的活化的t 细胞。这种策略将每个atc转换成特定的ctl(thakur和lum，2010，curropin mol ther 12,340-349；grabert等人，2006，clin cancer res 12,569-576)。
[0498]
双特异性结合分子可以由muc16糖基化抗体组成，其中muc16糖基 化抗体是免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的每个轻链是融合蛋白，其中融合 蛋白由免疫球蛋白轻链通过肽
接头连接到靶向cd3的scfv。ch2结构域 中的n297a突变导致糖基化，导致不存在fcr或clq结合。
[0499]
muc16糖基化抗体或其抗原结合片段可用于产生car。car最通常 包括单链可变区片段长度抗体(scfv)(例如来源于靶向给定肿瘤相关抗原和/ 或其变体的单克隆抗体的一种)，跨膜域(例如来源于t细胞表面分子，例如 共刺激分子如cd8，cd28，ox-40和4-1bb的跨膜域)，tcr复合物的信 号传导部分(例如tcrζ链的胞内结构域和/或附加部分，例如其细胞质信号 结构域)。在具体实施方案中，本文所述的单克隆muc16糖基化抗体的重 链和轻链可变区从产生单克隆muc16糖基化抗体的杂交瘤细胞系中分离。 例如，从杂交瘤细胞系提取rna，通过逆转录pcr从rna产生cdna。 利用可变区特异性引物通过标准pcr克隆vh和vl链可变区。将得到的 vh和vl片段亚克隆到穿梭载体，例如topota pcr 2.1克隆载体 (invitrogen)中并进行测序。随后将vh和vl片段连接到(gly4ser)3间隔区， 产生muc16糖基化抗体scfv并通过重叠pcr与人cd8前导肽 (cd8l)(cd8l-muc16糖基化抗体scfv)融合(参见例如，maher j等，natbiotechnol 2002；20(1)：70-5；和gong mc等人，neoplasia 1999；1(2)： 123-7)。将cd8l-muc16糖基化抗体scfv编码区融合到人cd8铰链和跨 膜域，或者可选的与cd28跨膜和细胞质信号结构域融合，与t细胞受体 cd3-ζ信号结构域融合(参见例如maher j等，nat biotechnol 2002； 20(1):70-5.，brentjens rj等，nat med 2003；9(3):279-86和brentjens rj等， clin cancer res 2007；13(18pt 1):5426-35)。
[0500]
本文还提供了表达本文所述的car的t细胞。用于产生表达car的 t细胞的方法是本领域已知的。例如，car构建体可以亚克隆到经修饰的 mmlv逆转录病毒载体sfg(参见，例如，riviere i等，proc natl acad sciusa 1995；92(15):6733-7)或其它合适的逆转录病毒载体中。在一些实施方 案中，逆转录病毒载体是慢病毒载体，例如基于hiv的载体。来源于转导 的gpg29成纤维细胞的vsv-g假型逆转录病毒上清液可用于构建稳定的 pg13长臂猿白血病病毒(galv)包封假型逆转录病毒产生细胞系(参见例如 gong mc等，neoplasia 1999；1(2):123-7)。分离的健康供体外周血单核细 胞(pbmc)可以以2μg/m1(sigma，st.louis，mo)的植物凝集素(pha)活化， 并在纤连蛋白包被的非组织培养板上逆转录病毒转导(quintas-cardama a 等，hum gene ther 2007；18(12):1253-60)以产生重组表达car的t细胞。 可以通过facs评估car进入t细胞的基因转移。
[0501]
单域抗体，例如，缺乏轻链的抗体，可以通过本领域熟知的方法产生。 参见riechmann l&muyldermans s(1999)j immunol 231：25-38，nuttall sd 等，(2000)curr pharm biotechnol 1(3)：253-263，muyldermans s，(2001)jbiotechnol 74(4)：277-302，美国专利号6,005,079和国际公开号wo94/04678、wo 94/25591和wo 01/44301。
[0502]
在具体实施方案中，本文所述的结合与本文所述的muc16糖基化抗体 相同或重叠的表位的本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段是 人muc16糖基化抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，竞争性阻断 (例如，以剂量依赖的方式)本文所述的任何一种抗体与muc16结合的本文 所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段是人muc16糖基化抗体或抗 原其结合片段。可以使用本领域已知的任何方法制备人抗体。例如，可以 使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转 基因小鼠。特别地，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机引入 或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选的，除人类重链和轻链基因之 外，还可以将人可变区，恒定区和多样性区引入小鼠
胚胎干细胞。小鼠重 链和轻链免疫球蛋白基因可以通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座而分 开或同时进行非功能化。特别地，jh区域的纯合缺失可防止内源性抗体产 生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后 繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。转基因小鼠以正常方式用选 定的抗原(例如全部或部分抗原)进行免疫。针对抗原的单克隆抗体可以使用 常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得。由转基因小鼠携带(harbored)的 人类免疫球蛋白转基因在b细胞分化期间重排，随后进行类别转换和体细 胞突变。因此，使用这种技术可以产生治疗上有用的igg、iga、igm和ige 抗体。关于用于生产人抗体的该技术的概述，参见例如lonberg n&huszard(1995)int rev immunol 13:65-93。关于用于产生人抗体和人单克隆抗体的 该技术的详细讨论和用于产生此类抗体的方案，参见例如国际公开号wo 98/24893、wo 96/34096和wo 96/33735和美国专利号5,413,923、5,625,126、 5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598。能够 产生人抗体的小鼠的实例包括xenomouse
tm
(abgenix，inc.，美国专利号 6,075,181和6,150,184)、huab-mouse
tm
(mederex，inc./gen pharm，美国专 利号5,545,806和5,569,825)、trans chromo mouse
tm
(kirin)和km mouse
tm (medarex/kirin)。
[0503]
免疫特异性结合muc16的人抗体可以通过本领域已知的多种方法制 备，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库所述的噬菌体展示方法。 另见美国专利号4,444,887、4,716,111和5,885,793和国际公开号wo98/46645、wo 98/50433、wo 98/24893、wo 98/16654、wo 96/34096、 wo 96/33735和wo 91/10741。
[0504]
在一些实施方案中，可以使用小鼠-人杂交瘤产生人抗体。例如，用 epstein-barr病毒(ebv)转化的人外周血淋巴细胞可以与小鼠骨髓瘤细胞融 合以产生分泌人单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤，并且可筛选这些小鼠-人杂 交瘤以确定分泌免疫特异性结合靶抗原的人单克隆抗体的那些。这些方法 是已知的并且在本领域中描述，参见例如shinmoto h等，(2004) cytotechnology 46：19-23；naganawa y等，(2005)human antibodies 14： 27-31。
[0505]
在具体的实施方案中，产生免疫特异性结合muc16的抗体或其抗原结 合片段的方法描述于第6.2节，如下所示。
[0506]
在具体的实施方案中，筛选和选择免疫特异性结合muc16的抗体或其 抗原结合片段的方法描述于第6.2节，如下所示。
[0507]
一旦已经产生了本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，则 可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法纯化，例如通 过色谱法(例如，离子交换，亲和层析，特别是通过蛋白a和尺寸排阻柱色 谱法后对特异性抗原的亲和层析)，离心，差异溶解或通过任何其他用于纯 化蛋白质的标准技术。此外，本文所述的抗体可以融合到本文所述的或本 领域已知的异源多肽序列以促进纯化。
[0508]
在具体的实施方案中，本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段是分离的或纯化的。通常，分离的抗体是基本上不含与所分离的抗体具 有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。例如，在具体实施方案中，本文所 述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的制备基本上不含细胞材料和/ 或化学前体。“基本上不含细胞材料”的语言包括muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段的制剂，其中将抗体与分离或重组产生所述抗体的细胞的细 胞组分进行分离。因此，基本上不含细胞材料的muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段包括具有
小于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以 干重计)的异源蛋白(本文也称为“污染性蛋白质”)和/或muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段的变体(例如muc16糖基化抗体或抗原结合片段的不同 翻译后修饰形式或其它不同形式的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 (例如，抗体片段))的抗体制剂。当重组产生抗体时，其通常也基本上不含 培养基，即培养基代表小于蛋白质制剂体积的约20％、10％、2％、1％、0.5％ 或0.1％。当通过化学合成制备抗体时，其通常基本上不含化学前体或其它 化学物质，即它与参与合成蛋白质的化学前体或其它化学物质分离。因此， 抗体的这种制剂具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的除感兴趣 的抗体之外的化学前体或化合物。在具体实施方案中，本文描述的抗体是 分离的或纯化的。
[0509]
5.3.2多核苷酸
[0510]
在某些实施方案中，本文提供了包含编码muc16糖基化抗体或其抗原 结合片段的核苷酸序列的多核苷酸(参见第5.1节和第5.2节)。本文还提供 了包含这种多核苷酸的载体(参见第5.3.3节)。本文还提供编码本文所述的 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的抗原的多核苷酸(参见第5.1节和第 5.2节)。本文还提供了在严格或较低严格杂交条件下与编码本文所述的 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸杂交的多核苷酸。
[0511]
语言“纯化的”包括具有小于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特 别是小于约10％)的其他材料的多核苷酸或核酸分子的制剂，例如细胞材料， 培养基，其他核酸分子，化学前体和/或其它化学品。在具体实施方案中， 编码本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第 5.2节)的核酸分子是分离的或纯化的。
[0512]
本文提供的核酸分子可以是rna的形式，例如mrna，hnrna，trna 或任何其它形式，或以dna的形式，包括但不限于通过克隆或合成生产或 其任何组合获得的cdna和基因组dna。dna可以是三链，双链或单链， 或其任何组合。dna或rna的至少一条链的任何部分可以是编码链，也 称为有义链，或者它可以是非编码链，也称为反义链。
[0513]
在某些实施方案中，本文提供了一种多核苷酸，其包含编码本文描述 的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的核苷 酸序列。
[0514]
在特定方面，本文还提供了包含编码muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段(参见第5.1节和第5.2节)的核苷酸序列的多核苷酸，其免疫特异性结 合muc16，并且包含本文描述的氨基酸序列，以及与该muc16糖基化抗 体或其抗原结合片段竞争结合muc16的抗体，或者其与这些抗体结合相同 的表位。
[0515]
本文提供的多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，如 果编码本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(见第5.1节和第 5.2节)的核苷酸序列是已知的，则编码muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸(例如，如kutmeier等人， biotechniques 17：242(1994)中所述)进行组装，其简要地涉及包含编码抗体 的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成，退火和那些寡核苷酸的连接，然后 通过pcr扩增连接的寡核苷酸。
[0516]
可选的，编码muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸(参见 第5.1节和第5.2节)可以从合适来源的核酸产生。如果含有编码特定muc16 糖基化抗体或其抗原结合片段的核酸的克隆不可得，但muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段的序列是已知的，则编码muc16糖基化抗体或其抗原结 合片段的核酸可以通过化学合成获得或从合适的来源获得
(例如，表达抗体 的任何组织或细胞，例如选择用于表达本文提供的muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段的杂交瘤细胞，所产生的抗体cdna文库或cdna文库，或 从表达抗体的任何组织或细胞中分离的核酸，优选的poly a+rna)，其中 通过使用与序列的3'和5'末端杂交的合成引物进行pcr扩增或通过使用对 特定基因序列特异性的寡核苷酸探针进行克隆，以鉴别例如来自编码抗体 的cdna文库的cdna克隆。然后可以使用本领域熟知的任何方法将通过 pcr产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中(参见例如第5.3.3节)。
[0517]
在这样的实施方案中，编码这种muc16糖基化抗体或其抗原结合片 段的多核苷酸可以使用本领域熟知的用于操作核苷酸序列的方法进行操 作，例如重组dna技术，定点诱变，pcr，等等(参见例如sambrook等 人，1990、molecular cloning，a laboratory manual，第2版，cold springharbor laboratory，cold spring harbor，n.y.和ausubel等编，1998， current protocols in molecular biology，john wiley&sons，n.y.，中描述 的技术，其全部内容通过引用并入本文)，以产生具有不同氨基酸序列的 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，例如，以产生氨基酸取代，缺失和 /或插入。例如，可以进行这种操作以使编码的氨基酸被糖基化，或破坏抗 体结合c1q、fc受体或激活补体系统的能力。
[0518]
本文提供的分离的核酸分子可包括包含开放阅读框(orf)的核酸分子， 任选具有一个或多个内含子，例如但不限于至少一个互补决定区(cdr)的至 少一个特定部分，作为至少一个重链或轻链的cdr1，cdr2和/或cdr3； 包含muc16糖基化抗体或可变区的编码序列的核酸分子；和包含与上述基 本上不同的核苷酸序列，但由于遗传密码的简并性，仍然编码如本文所述 的至少一种muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
[0519]
本文还提供了在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交的分离 的核酸。因此，该实施方案的多核苷酸可用于分离，检测和/或定量包含此 类多核苷酸的核酸。例如，本文提供的多核苷酸可用于鉴定，分离或扩增 保藏的文库中的部分或全长克隆。在一些实施方案中，所述多核苷酸是与 人或哺乳动物核酸文库的cdna分离或以其它方式互补的基因组或cdna 序列。
[0520]
除了本文提供的多核苷酸之外，核酸可以方便地包括序列。例如，可 以将包含一个或多个内切核酸酶限制性位点的多克隆位点插入到核酸中以 有助于分离多核苷酸。此外，可插入可翻译序列以帮助分离本文提供的翻 译的多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了纯化本文提供的多肽的方 便手段。本文提供的核酸(不包括编码序列)任选的用于克隆和/或表达本文 提供的多核苷酸的载体，适配子或接头。
[0521]
另外的序列也可以加入到这样的克隆和/或表达序列中以优化它们在克 隆和/或表达中的功能，以帮助分离多核苷酸，或改进将多核苷酸引入细胞。 克隆载体，表达载体，适配子和接头的使用是本领域公知的。(参见例如 ausubel，同上；或sambrook，同上)。
[0522]
在具体实施方案中，使用常规的重组dna技术，本文所述的muc16 糖基化抗体或其抗原结合片段的一个或多个cdr可以插入已知的框架区域 内。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人框架区(参见例如 chothia等人，j.mol.biol.278：457-479(1998)的人框架区列表)。优选地， 通过框架区和cdr的组合产生的多核苷酸编码免疫特异性结合muc16的 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段。可以在框架区内进行一个或多个氨 基酸取代，优选地，氨基酸取代改善抗体与其抗原的结合。此外，这些方 法可用于进行参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸 取代或缺失，以产生缺少一个或多个链
idno:57)。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码16c5的vh cdr1、 vh cdr2和vh cdr3(即，分别为seq id no:63、seq id no:64和seqid no:65，或分别为seq id no:69、seq id no:70和seq id no:71，或 分别为seq id no:75、seq id no:76和seq id no:77)。在具体的实施方 案中，本文描述18c6的多核苷酸编码的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3 (即，分别为seq id no:83、seq id no:84和seq id no:85，或分别为seqid no:89、seq id no:90和seq id no:91，或分别为seq id no:95、seqid no:96和seq id no:97)。
[0530]
在具体的实施方案中，本文提供了包含编码muc16糖基化抗体的核 苷酸序列的多核苷酸，所述muc16糖基化抗体包含(a)3个vh cdr，例 如，含有如表1、表3或表5中所述的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3 和(b)3个vl链cdr，例如，含有如表2、表4或表6所述的vl cdr1、 vl cdr2和vl cdr3。在具体的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码(a) 10c6、7b12、19c11、16c5和18c6共同序列vh cdr的vh cdr1、vhcdr2和vh cdr3(即，分别为seq id no:103、seq id no:104和seqid no:105，或分别为seq id no:109、seq id no:110和seq idno:111，或seq id no:115、seq id no:116和seq id no:117)和(b) 10c6、7b12、19c11、16c5和18c6共同序列vl cdr的vl cdr1、vlcdr2和vl cdr3(即，分别为seq id no:106、seq id no:107和seqid no:108，或分别为seq id no:112、seq id no:113和seq idno:114，或seq id no:118、seq id no:119和seq id no:120)。在具体 的实施方案中，本文描述的多核苷酸编码(a)10c6的vh cdr1、vh cdr2 和vh cdr3(即，分别为seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5，或 分别为seq id no:9、seq id no:10和seq id no:11，或分别为seq idno:15、seq id no:16和seq id no:17)和(b)10c6的vl cdr1、vlcdr2和vl cdr3(即，分别为seq id no:6、seq id no:7和seq idno:8，或分别为seq id no:12、seq id no:13和seq id no:14，或分别 为seq id no:18、seq id no:19和seq id no:20)。在具体的实施方案 中，本文描述的多核苷酸编码(a)7b12的vh cdr1、vh cdr2和vhcdr3(即，分别为seq id no:23、seq id no:24和seq id no:25，或分 别为seq id no:29、seq id no:30和seq id no:31，或分别为seq idno:35、seq id no:36和seq id no:37)和(b)7b12的vl cdr1、vlcdr2和vl cdr3(即，分别为seq id no:26、seq id no:27和seq idno:28，或分别为seq id no:32、seq id no:33和seq id no:34，或分 别为seq id no:38、seq id no:39和seq id no:40)。在具体的实施方案 中，本文描述的多核苷酸编码(a)19c11的vh cdr1、vh cdr2和vhcdr3(即，分别为seq id no:43、seq id no:44和seq id no:45，或分 别为seq id no:49、seq id no:50和seq id no:51，或分别为seq idno:55、seq id no:56和seq id no:57)和(b)19c11的vl cdr1、vlcdr2和vl cdr3(即，分别为seq id no:46、seq id no:47和seq idno:48，或分别为seq id no:52、seq id no:53和seq id no:54，或分 别为seq id no:58、seq id no:59和seq id no:60)。在具体的实施方案 中，本文描述的多核苷酸编码(a)16c5的vh cdr1、vh cdr2和vhcdr3(即，分别为seq id no:63、seq id no:64和seq id no:65，或分 别为seq id no:69、seq id no:70和seq id no:71，或分别为seq idno:75、seq id no:76和seq id no:77)和(b)16c5的vl cdr1、vlcdr2和vl cdr3(即，分别为seq id no:66、seq id no:67和seq idno:68，或分别为seq id no:72、seq id no:73和seq id no:74，或分 别为seq id no:78、seq id no:79和seq id no:80)。在具体的实施方案 中，本文描述的多核苷酸编码(a)18c6的vh cdr1、vh cdr2和vhcdr3(即，分别为seq id no:83、seq id no:84和seq id no:85，或分 别为seq id no:89、seq id no:90和seq id no:
91，或分别为seq idno:95、seq id no:96和seq id no:97)和(b)18c6的vl cdr1、vlcdr2和vl cdr3(即，分别为seq id no:86、seq id no:87和seq idno:88，或分别为seq id no:92、seq id no:93和seq id no:94，或分 别为seq id no:98、seq id no:99和seq id no:100)。
[0531]
在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的 muc16糖基化抗体的核苷酸序列，所述muc16糖基化抗体包含含有本文 描述的氨基酸序列的重链可变区(例如，seq id no:1、seq id no:21、 seq id no:41、seq id no:61、seq id no:81或seq id no:101)，其中 抗体免疫特异性结合muc16。
[0532]
在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的 muc16糖基化抗体的核苷酸序列，所述muc16糖基化抗体包含含有本文 描述的氨基酸序列的轻链可变区(例如，seq id no:2、seq id no:22、 seq id no:42、seq id no:62、seq id no:82或seq id no:102)，其中 抗体免疫特异性结合muc16。
[0533]
在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的 muc16糖基化抗体的核苷酸序列，所述muc16糖基化抗体包含重链可变 区，其包含seq id no:101的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含seq idno:102的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码 本文描述的muc16糖基化抗体的核苷酸序列，所述muc16糖基化抗体包 含重链可变区，其包含seq id no:101的氨基酸序列；和轻链可变区，其 包含seq id no:2的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷 酸包含编码本文描述的muc16糖基化抗体的核苷酸序列，所述muc16糖 基化抗体包含重链可变区，其包含seq id no:101的氨基酸序列；和轻链 可变区，其包含seq id no:42的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文 描述的多核苷酸包含编码本文描述的muc16糖基化抗体的核苷酸序列， 所述muc16糖基化抗体包含重链可变区，其包含seq id no:1的氨基酸 序列；和轻链可变区，其包含seq id no:2的氨基酸序列。在某些实施方 案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的muc16糖基化抗体的核 苷酸序列，所述muc16糖基化抗体包含重链可变区，其包含seq idno:21的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含seq id no:22的氨基酸序 列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码本文描述的 muc16糖基化抗体的核苷酸序列，所述muc16糖基化抗体包含重链可变 区，其包含seq id no:41的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含seq idno:42的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸包含编码 本文描述的muc16糖基化抗体的核苷酸序列，所述muc16糖基化抗体包 含重链可变区，其包含seq id no:61的氨基酸序列；和轻链可变区，其 包含seq id no:62的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核 苷酸包含编码本文描述的muc16糖基化抗体的核苷酸序列，所述muc16 糖基化抗体包含重链可变区，其包含seq id no:81的氨基酸序列；和轻 链可变区，其包含seq id no:82的氨基酸序列。
[0534]
在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸编码vh，后者包含seq idno:140、seq id no:142、seq id no:144、seq id no:146或seq idno:148的核酸序列。在某些实施方案中，本文描述的多核苷酸编码vl， 后者包含seq id no:141、seq id no:143、seq id no:145、seq idno:147或seq id no:149的核酸序列。在具体实施方案中，本文描述的多 核苷酸编码具有核酸序列seq id no:140的vh和具有核酸序列seq idno:141的vl(例如，10c6)。在具体实施方案中，本文描述的多核苷酸编 码具有核酸序列seq id no:142的vh和
具有核酸序列seq id no:143的 vl(例如，7b12)。在具体实施方案中，本文描述的多核苷酸编码具有核 酸序列seq id no:144的vh和具有核酸序列seq id no:145的vl(例 如，19c11)。在具体实施方案中，本文描述的多核苷酸编码具有核酸序列 seq id no:146的vh和具有核酸序列seq id no:147的vl(例如， 16c5)。在具体实施方案中，本文描述的多核苷酸编码具有核酸序列seq idno:148的vh和具有核酸序列seq id no:149的vl(例如，18c6)。
[0535]
在具体的方面，本文提供了一种多核苷酸，其包含编码包含轻链和重 链的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，例如，单独的轻 链和重链。对于重链，在具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码γ (例如，γ1，γ2，γ3或γ4)重链的核苷酸序列。在具体实施方案中，本文提 供的多核苷酸包含编码本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 的核苷酸序列，其中抗体包含重链，且其中重链可变区的氨基酸序列可包 含任何seq id no:1、seq id no:21、seq id no:41、seq id no:61、seqid no:81或seq id no:101的氨基酸序列，且其中重链恒定区是人γ重链 恒定区。
[0536]
对于轻链，在具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码κ轻链 的核苷酸序列。在另一具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码λ 轻链的核苷酸序列。在又一具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编 码本文描述的包含人κ轻链或人λ轻链的muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段的核苷酸序列。在具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码本 文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中抗体包 含轻链，且其中轻链可变区氨基酸序列可包含任何seq id no:2、seq idno:22、seq id no:42、seq id no:62、seq id no:82或seq id no:102 的氨基酸序列，且其中轻链恒定区是人κ轻链恒定区。在另一具体实施方 案中，本文提供的多核苷酸包含编码本文描述的muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段的核苷酸序列，其中抗体包含轻链，其中轻链可变区氨基酸序 列可包含任何seq id no:2、seq id no:22、seq id no:42、seq id no:62、 seq id no:82或seq id no:102的氨基酸序列，且其中轻链恒定区是人λ 轻链恒定区。
[0537]
对于产生本文描述的muc16糖基化抗体的详细实施例，参见第6.2节 和第6.3节。
[0538]
5.3.3细胞和载体
[0539]
在某些实施方案中，本文提供了表达(例如，重组表达)一个或多个 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的细胞(例 如，离体细胞)。本文还提供了包含编码本文描述的muc16糖基化抗体或 其抗原结合片段的核苷酸序列(参见，例如，第5.3.2节)的载体(例如，表达 载体)，用于在宿主细胞中重组表达，优选在哺乳动物细胞中重组表达。本 文还提供了包含该载体或核苷酸序列的细胞(例如，离体细胞)，用于重组 表达本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段。本文还提供了用于 生产本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的方法，包括从细胞 (例如，离体细胞)中表达该muc16糖基化抗体或其抗原结合片段。在一个 优选实施方案中，细胞是离体细胞。
[0540]
载体(例如，表达载体)是包含在细胞(例如离体细胞)中表达的基因的 dna分子。通常，将基因表达置于某些调节元件的控制下，包括组成型或 诱导型启动子，组织特异性调节元件和增强子。将这样的基因称为与调节 元件例如启动子“可操作地连接”。重组宿主可以是含有克隆载体或表达载体 的任何原核或真核细胞。该术语还包括原核或真核细胞以及转基因动物， 其被遗传工程化以在宿主细胞或宿主细胞(例如，离体细胞)的细胞的染
色体 或基因组中含有克隆的基因。在一个实施方案中，启动子是cmv启动子。
[0541]
在某些实施方案中，本文提供了包含如第5.3.2节所述的一种或多种多 核苷酸的载体。在某些实施方案中，可以将第5.3.2节所述的多核苷酸克隆 到合适的载体中，并可用于转化或转染任何合适的宿主。用于构建此类载 体的载体和方法是本领域普通技术人员已知的，并且在一般技术参考文献 中有所描述(参见，一般参见“recombinant dna part d，”methods inenzymology，vol.153，wu和grossman编，academic press(1987))。在某 些实施方案中，载体包含调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子， 其特异于待引入载体的宿主(例如细菌，真菌，植物，昆虫或哺乳动物)的类 型，酌情考虑载体是dna还是rna。在某些实施方案中，载体包含特异 于宿主属的调节序列。在某些实施方案中，载体包含特异于宿主种的调节 序列。
[0542]
在某些实施方案中，载体包含一个或多个标记基因，其允许选择转化 或转染的宿主。标记基因的非限制性实例包括杀生物剂抗性，例如抗生素， 重金属等的抗性，营养缺陷型宿主中的互补以提供原养型等。在优选的实 施方案中，载体包含氨苄青霉素和潮霉素选择标记。
[0543]
在某些实施方案中，表达载体可以包含与第5.3.2节所述的多核苷酸可 操作地连接的天然或规范性启动子。启动子的选择，例如强，弱，可诱导， 组织特异性和发育特异性，均在本领域技能范围内。类似地，如上所述的 核酸分子或其片段与启动子的组合也在本领域的技能范围内。
[0544]
合适的载体的非限制性实例包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或两 者的那些。例如，克隆载体可以选自puc系列，pbluescript系列(stratagene， lajolla，calif.)，pet系列(novagen，madison，wis.)，pgex系列(pharmaciabiotech，uppsala，瑞典)和pex系列(clontech，palo alto，calif.)。还可以 使用噬菌体载体，如λ-gt10、λ-gt11，λ-zapii(stratagene)，λ-embl4和 λ-nm1149。植物表达载体的非限制性实例包括pbi110、pbi101.2，pbi101.3， pbi121和pbin19(clontech)。动物表达载体的非限制性实例包括peuk-c1， pmam和pmamneo(clontech)。也可以根据制造商的建议使用topo克隆 系统(invitrogen，carlsbad，calif)。
[0545]
在某些实施方案中，载体是哺乳动物载体。在某些实施方案中，哺乳 动物载体含有至少一个启动子元件，其介导mrna，muc16糖基化抗体或 其抗原结合片段的编码序列，以及转录终止和转录多聚腺苷酸化所需的信 号的转录起始。在某些实施方案中，哺乳动物载体包含另外的元件，例如 增强子，kozak序列和两侧为用于rna剪接的供体和受体位点的插入序列。 在某些实施方案中，可以使用例如来自sv40的早期和晚期启动子，来自逆 转录病毒的长末端重复序列(ltrs)例如rsv、htlvi，hivi和巨细胞病毒 (cmv)的早期启动子达到高效转录。然而，也可以使用细胞元件(例如，人 肌动蛋白启动子)。哺乳动物表达载体的非限制性实例包括载体，例如 pireslneo，pretro-off，pretro-on，plxsn或plncx(clonetech labs，paloalto，calif.)，pcdna3.1(+/-)，pcdna/zeo(+/-)或pcdna3.1/hygro(+/-) (invitrogen)，psvl和pmsg(pharmacia，uppsala，sweden)，prsvcat(atcc 37152)，psv2dhfr(atcc 37146)和pbc12mi(atcc 67109)。可以与这些哺 乳动物载体组合使用的哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括人hela 293， h9和jurkat细胞，小鼠nih3t3和c127细胞，cos 1，cos 7和cv 1，鹌 鹑qc1-3细胞，小鼠l细胞和中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
[0546]
在某些实施方案中，载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体，基于细 小病毒的载体，例如基于腺相关病毒(aav)的载体，aav-腺病毒嵌合载体 和基于腺病毒的载体，和慢病毒载体，例如基于单纯疱疹(hsv)的载体。在 某些实施方案中，操纵病毒载体以使病毒复制缺陷。在某些实施方案中， 操作病毒载体以消除对宿主的毒性。这些病毒载体可以使用例如sambrook 等人，molecular cloning，a laboratory manual，第二版，cold spring harborpress，cold spring harbor，n.y.(1989)；和ausubel等人，current protocolsin molecular biology，greene publishing associates和john wiley&sons，newyork，n.y.(1994)中所述的标准重组dna技术来制备。
[0547]
在某些实施方案中，本文所述的载体或多核苷酸可以通过常规技术转 移至细胞(例如，离体细胞)，并且所得细胞可以通过常规技术培养以产生 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段。因此，本文提供的是包含编码 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其重链或轻链或其轻链融合多肽的 多核苷酸的细胞，其可操作地连接到用于在宿主细胞中表达此类序列的启 动子。在某些实施方案中，编码可操作地连接到启动子的重链的载体和编 码可操作地连接到启动子的轻链的载体可以在细胞中共表达，用于表达整 个muc16糖基化抗体。在某些实施方案中，编码可操作地连接到启动子的 重链的载体和编码可操作地连接到启动子的轻链融合多肽的载体可以在细 胞中共表达以表达整个双特异性结合分子。在某些实施方案中，细胞包含 载体，其包含编码与启动子可操作地连接的本文所述的muc16糖基化抗体 的重链和轻链多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，细胞包含载体，所述 载体包含编码与启动子可操作地连接的本文描述的双特异性结合分子的重 链和轻链融合多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，细胞包含两种不同的 载体，包含编码与启动子可操作地连接的重链的多核苷酸的第一载体，和 包含编码与启动子可操作地连接的轻链多肽的多核苷酸的第二载体。在某 些实施方案中，细胞包含两种不同的载体，包含编码与启动子可操作地连 接的重链的多核苷酸的第一载体，和包含编码与启动子可操作地连接的轻 链融合多肽的多核苷酸的第二载体。在某些实施方案中，第一细胞包含第 一载体，其包含编码本文所述的muc16糖基化抗体的重链的多核苷酸，第 二细胞包含第二载体，其包含编码本文所述的muc16糖基化抗体的轻链多 肽的多核苷酸。在某些实施方案中，本文提供了包含该第一细胞和该第二 细胞的细胞混合物。在某些实施方案中，第一细胞包含第一载体，其包含 编码本文所述的双特异性结合分子的重链的多核苷酸，第二细胞包含第二 载体，其包含编码本文所述的双特异性结合分子的轻链融合多肽的多核苷 酸。在某些实施方案中，本文提供了包含该第一细胞和该第二细胞的细胞 混合物。在优选的实施方案中，细胞表达载体或载体，使得寡核苷酸被细 胞有效转录和翻译。
[0548]
在实施方案中，细胞表达载体，从而寡核苷酸或其片段被细胞有效转 录和翻译。
[0549]
在某些实施方案中，细胞存在于宿主中，宿主可以是动物，例如哺乳 动物。细胞的实例包括但不限于人细胞、人细胞系、大肠杆菌(例如大肠杆 菌tb-1、tg-2、dh5a、xl-blue mrf'(stratagene)、sa2821和y1090)、枯 草芽孢杆菌(b.subtilis)、铜绿假单胞菌(p.aerugenosa)、酿酒酵母(s. cerevisiae)、粗糙脉孢菌(n.crassa)、昆虫细胞(例如sf9、ea4)下文所述的其 它细胞。在优选的实施方案中，细胞是cho细胞。在特别优选的实施方案 中，细胞是cho-s细胞。
[0550]
在某些实施方案中，本文所述的多核苷酸可以通过将多核苷酸引入细 胞而在包
含整合到染色体中的多核苷酸的稳定细胞系中表达。在某些实施 方案中，通过例如电穿孔将多核苷酸引入细胞。在某些实施方案中，通过 例如将包含多核苷酸的载体转染到细胞中将多核苷酸引入细胞。在某些实 施方案中，载体用选择性标记如dhfr，gpt，新霉素或潮霉素共转染，以 允许鉴定和分离转染的细胞。在某些实施方案中，也可以扩增所转染的多 核苷酸以表达大量的编码的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段。例如， dhfr(二氢叶酸还原酶)标记可用于开发携带数百或甚至数千拷贝目标多核 苷酸的细胞系。选择标记的另一个实例是酶谷氨酰胺合成酶(gs)(murphy 等，biochem.j.227:277-279(1991)，bebbington等，bio/technology10:169-175(1992))。使用这些标记物，细胞在选择性培养基中生长，并选出 具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合到染色体中的扩增基因。中国 仓鼠卵巢(cho)和nso细胞常用于生产抗体。
[0551]
在一个实施方案中，载体包含(i)编码结合muc16的免疫球蛋白轻链的 第一多核苷酸序列，其可操作地连接到第一启动子和(ii)编码结合muc16 的免疫球蛋白重链的第二多核苷酸，其可操作地连接到第二启动子。在某 些实施方案中，载体是病毒载体。
[0552]
在一个实施方案中，载体包含(i)可操作地连接到第一启动子的编码轻 链融合多肽的第一多核苷酸序列，其包含通过肽接头与scfv融合的免疫球 蛋白轻链，其中轻链结合muc16，其中scfv结合cd3，和(ii)可操作地连 接到第二启动子的编码结合muc16的免疫球蛋白重链的第二多核苷酸。在 某些实施方案中，载体是病毒载体。
[0553]
5.4药物组合物
[0554]
在某些实施方案中，本文提供了包含药学有效量的一种或多种muc16 糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的组合物(例如药物 组合物)和试剂盒。在某些实施方案中，药物组合物包含免疫细胞，例如t 细胞，其重组表达本文所述的抗体、其抗原结合片段和/或car。组合物可 用于制备单个单一剂量形式。本文提供的组合物可以配制用于胃肠外、皮 下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体 腔内、小脑内、脑室内、ommaya内、眼内、玻璃体内、结肠内、颈管内、 胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺 内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸廓内、子宫内、 膀胱内、大丸、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内、囊内、脑心室内、脑薄 壁组织内或透皮给药。在优选的实施方案中，将组合物配制成肠胃外给药。 在特别优选的实施方案中，将组合物配制用于静脉内给药。在优选的实施 方案中，将组合物配制用于腹膜内给药。在具体实施方案中，将组合物配 制用于腹膜内给药以治疗腹膜转移。在优选的实施方案中，将组合物配制 用于鞘内给药。在具体实施方案中，将组合物配制用于鞘内施用以治疗脑 转移。参见例如kramer等，2010、97：409-418。在优选的实施方案中，将 组合物配制用于脑部脑室内给药。在具体实施方案中，将组合物配制用于 心室内给药以治疗脑转移。参见例如kramer等，2010,97：409-418。在优 选的实施方案中，将组合物配制成用于脑内实施内给药。在具体实施方案 中，将组合物配制用于薄壁组织内施用以治疗脑肿瘤或脑肿瘤转移。参见 例如luther等人，2014，neuro oncol，16：800-806和clinical trial id nonct01502917。
[0555]
在具体实施方案中，将组合物配制用于腹膜内给药用于腹膜转移。
[0556]
在某些实施方案中，本文提供了包含一种或多种包含编码本文所述的 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸的组合物。 在某些实施方案中，本文提
供了包含细胞的组合物，其中所述细胞包含一 种或多种包含编码本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的核 苷酸序列的多核苷酸。在某些实施方案中，本文提供了包含载体的组合物， 其中所述载体包含一种或多种包含编码本文所述的muc16糖基化抗体或 其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸。在某些实施方案中，本文提供 的是包含细胞的组合物，其中所述细胞包含载体，其中所述载体包含一种 或多种包含本文所述的编码muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的核苷 酸序列的多核苷酸。
[0557]
在某些实施方案中，本文所述的组合物是稳定或保存的制剂。在某些 实施方案中，稳定的制剂包含具有盐水或选择的盐的磷酸盐缓冲液。在某 些实施方案中，所描述的组合物是适用于药物或兽医用途的多用途保藏制 剂。在某些实施方案中，本文所述的组合物包含防腐剂。本领域普通技术 人员已知防腐剂。防腐剂的非限制性实例包括苯酚，间甲酚，对甲酚，邻 甲酚，氯甲酚，苄醇，亚硝酸苯汞，苯氧基乙醇，甲醛，氯丁醇，氯化镁(例 如六水合物)，对羟基苯甲酸烷基酯(甲基，乙基，丙基，丁基等)，苯扎氯 铵，苄索氯铵和脱氢乙酸钠和硫柳汞，或它们在水性稀释剂中的混合物。 可以使用本领域已知的任何合适的浓度或混合物，例如0.001-5％或其中的 任何范围或值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、 0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、 1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、 2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、 4.6、4.7、4.8、4.9或其中的任何范围或值。非限制性示例包括，无防腐剂、 0.1-2％间甲酚(例如0.2、0.3.0.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1-3％苯甲醇(例如0.5、 0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(例如0.005、0.01)、0.001-2.0％ 苯酚(例如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％对羟基苯甲酸 烷基酯(例如0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、 0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
[0558]
有时可能期望将本文提供的组合物长时间地递送到对象，例如从单次 给药递送一周至一年或更长时间。可以使用各种缓释、贮存(depot)或植入剂 型。例如，剂型可以含有在体液中具有低溶解度的化合物的药学上可接受 的无毒盐，例如(a)与多元酸如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、丹宁酸、双 羟萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘单磺酸或二磺酸、聚半乳糖醛酸等的酸加成 盐；(b)与多价金属阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等 的盐，或与有机阳离子例如n，n'-二苄基乙二胺或乙二胺的盐；或(c)(a)和 (b)的组合，例如单宁酸锌盐。此外，本文提供的组合物，优选相对不溶性 的盐，例如刚刚描述的那些，可以配制成凝胶，例如适用于注射的具有例 如芝麻油的单硬脂酸铝凝胶。特别优选的盐是锌盐、单宁酸锌盐、双羟萘 酸盐等。用于注射的另一种类型的缓释贮存制剂将含有分散用于包封在缓 慢降解，无毒，非抗原性聚合物如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物中的化合物或盐， 例如美国专利号3,773,919中描述的。化合物或优选的相对不溶性的盐，如 上述那些，也可以配制在胆固醇基质硅橡胶微丸中，特别是用于动物。文 献(美国专利号5,770,222和"sustained and controlled release drug deliverysystems"，j.r.robinson编，marcel dekker，inc.，n.y.，1978)中已知另外 的缓释、贮存或植入组合物，例如气体或液体脂质体。
[0559]
本文提供的至少一种muc16糖基化抗体或其抗原结合片段组合物(参 见第5.1节和第5.2节)的范围包括在重构时产生的量，如果在湿/干系统中， 浓度为约1.0微克/毫升至约1000毫克/毫升，尽管较低和较高的浓度是可操 作的并且取决于预期的递送载体，例
如，溶液制剂将不同于透皮贴剂、肺、 经粘膜或渗透或微泵方法。
[0560]
在某些实施方案中，本文提供的组合物包含任何合适的辅助剂，例如 但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、 佐剂等中的至少一种。在某些实施方案中，优选药学上可接受的助剂。制 备这种无菌溶液的非限制性实例和方法是本领域公知的，例如但不限于， gennaro编，remington's pharmaceutical sciences，第18版，mack publishingco.(easton，pa.)。可以常规选择适合本文所述的muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段的施用方式，溶解度和/或稳定性的药学上可接受的载体。
[0561]
在某些实施方案中，本文提供的组合物含有一种或多种药物赋形剂和/ 或添加剂。药物赋形剂和添加剂的非限制性实例是蛋白质、肽、氨基酸、 脂质和碳水化合物(例如，糖、包括单糖、二、三、四和寡糖；衍生糖如糖 醇、醛糖酸、酯化糖等；和多糖或糖聚合物)，其可以单独或组合存在，包 含单独或组合的1-99.99％的重量或体积。蛋白质赋形剂的非限制性实例包 括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(hsa)、重组人白蛋白(rha)、明胶、酪 蛋白等。氨基酸/抗体组分也可以起缓冲作用的非限制性实例包括丙氨酸、 甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。在 某些实施方案中，氨基酸是甘氨酸。碳水化合物赋形剂的非限制性实例包 括单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、d-甘露糖、山梨糖等；二 糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦 芽糖糊精，葡聚糖、淀粉等；和糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、 乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡萄糖醇)、肌醇等。在某些实施方案中，碳水化合 物赋形剂是甘露糖醇、海藻糖或棉子糖。
[0562]
在某些实施方案中，本文提供的组合物包括一种或多种缓冲液或ph调 节剂；通常，缓冲液是由有机酸或碱制备的盐。缓冲剂的非限制性实例包 括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、 乙酸或邻苯二甲酸的盐；tris，氨丁三醇盐酸盐或磷酸盐缓冲液。在某些实 施方案中，缓冲液是有机酸盐，例如柠檬酸盐。其它赋形剂，例如等渗剂、 缓冲剂、抗氧化剂、防腐增强剂，可以任选和优选加入到稀释剂中。通常 在已知浓度下使用等渗剂如甘油。优选加入生理上耐受的缓冲液以提供改 善的ph控制。组合物可以覆盖宽范围的ph，例如约ph 4至约ph 10、优 选范围为约ph 5至约ph 9，最优选范围为约6.0至约8.0。优选地，本文 提供的组合物的ph在约6.8和约7.8之间。优选的缓冲液包括磷酸盐缓冲 液，最优选磷酸钠，特别是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。
[0563]
在某些实施方案中，本文提供的组合物包括一种或多种聚合物赋形剂/ 添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、多糖(聚合糖)、糊精(例如环糊精，例如2
‑ꢀ
羟基丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、 抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨酸酯如“tween 20”和“tween 80”)、 脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇、胆固醇)和/或螯合剂(例如edta)。
[0564]
其它添加剂，例如药学上可接受的助溶剂如吐温20(聚氧乙烯(20)脱水 山梨醇单月桂酸酯)、吐温40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、吐 温80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、pluronic f68(聚氧乙烯聚氧丙 烯嵌段共聚物)和peg(聚乙二醇)或非离子表面活性剂如聚山梨醇酯20或80 或泊洛沙姆184或188、pluronic.rtm.聚醚，其它嵌段共聚物和螯合剂如 edta和egta可以任选加入到组合物中以减少聚集。如果使用泵或塑料 容器来施用组合物，这些添加剂是特别有用的。药学上可接受的表面活性 剂的存在
减轻了蛋白质聚集的倾向。
[0565]
适用于本文提供的组合物的另外的药物赋形剂和/或添加剂是本领域技 术人员已知的，并且参考例如“remington：the science&practice ofpharmacy”，第19版，williams&williams，(1995)和“physician's deskreference”，第52版，medical economics，montvale，n.j.(1998)，其全部 内容通过引用并入本文。在某些优选实施方案中，载体或赋形剂材料是碳 水化合物(例如糖和糖醇)和缓冲液(例如柠檬酸盐)或聚合物。
[0566]
优选地，水性稀释剂任选地还包含药学上可接受的防腐剂。优选的防 腐剂包括选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯 甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱水乙酸 酯和硫柳汞、或其混合物的那些。组合物中使用的防腐剂的浓度是足以产 生抗微生物作用的浓度。这样的浓度取决于所选择的防腐剂，并且是本领 域技术人员容易确定的。
[0567]
本文提供的组合物可以通过包括在水性稀释剂中混合本文所述的至少 一种muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)和选 自以下的防腐剂的方法制备：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、 苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苄索 氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。使用常规的溶解和混合程序将本 文所述的至少一种muc16糖基化抗体或其抗原结合片段与水性稀释剂中 的防腐剂混合。为了制备合适的组合物，例如，将缓冲溶液中实测量的至 少一种本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段与缓冲溶液中的 所需防腐剂组合，其量足以提供本文所述的muc16糖基化抗体或抗原结合 片段和所需浓度的防腐剂。本文提供的组合物可以通过包括混合本文所述 的至少一种muc16糖基化抗体或其抗原结合片段和选择的缓冲液，优选含 有盐水或选择的盐的磷酸盐缓冲液的方法来制备。使用常规溶解和混合程 序将本文所述的至少一种muc16糖基化抗体或其抗原结合片段与水性稀 释液中的缓冲液混合。为了制备合适的组合物，例如将在水或缓冲液中实 测量的至少一种本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段与所需 的缓冲剂水溶液合并，其量足以提供蛋白质和缓冲液所需浓度。这些方法 的变化将由本领域普通技术人员认识到。例如，添加组分的顺序，是否使 用其他添加剂，制备组合物的温度和ph都是可以针对所用浓度和给药方式 进行优化的因素。
[0568]
5.4.1肠胃外剂型
[0569]
在某些实施方案中，本文提供的组合物被配制用于肠胃外可注射给药。 如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、血管内、肌内、皮内、皮下和眼内。 对于肠胃外给药，组合物可以配制成溶液、悬浮液、乳剂或冻干粉末，其 与药学上可接受的肠胃外载体联合或者单独提供。这种载体的非限制性实 例是水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、甘油、乙醇和1-10％人血清白 蛋白。还可以使用脂质体和非水性载体如固定油。载体或冻干粉末可以含 有保持等渗性(例如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如缓冲剂和防腐剂)的 添加剂。制剂通过已知或合适的技术灭菌。
[0570]
在本领域的标准参考文献的最新版本的remington's pharmaceuticalsciences，a.osol中描述了合适的药物载体。
[0571]
用于肠胃外给药的制剂可以含有作为常规赋形剂的无菌水或盐水、聚 亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等。用于注射的水性或油 性悬浮液可以根据已知方法使用合适的乳化剂或润湿剂和悬浮剂来制备。 注射剂可以是无毒的，非口服给药的稀释
剂，例如水溶液或溶剂中的无菌 注射溶液或悬浮液。作为可用的载体或溶剂，允许使用水，林格氏溶液， 等渗盐水等；作为普通溶剂或悬浮溶剂，可以使用无菌非挥发性油。为了 这些目的，可以使用任何种类的非挥发油和脂肪酸，包括天然或合成或半 合成脂肪油或脂肪酸；天然的或合成的或半合成的甘油单酯或甘油三酯。 亲本(parental)施用是本领域已知的，并且包括但不限于常规的注射方法、 美国专利号5,851,198中所述的气压无针注射装置和美国专利号5,839,446 所述的激光穿孔装置，其通过引用整体并入本文。
[0572]
5.4.2肺部剂型
[0573]
在某些实施方案中，包含本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段的组合物(参见第5.1节和第5.2节)被配制用于肺部给药。对于肺部给 药，组合物以有效用于到达肺或窦的下呼吸道的粒径递送。用于肺部给药 的组合物可以通过本领域已知的各种吸入或鼻部装置通过吸入施用治疗剂 来递送。能够在患者鼻腔或肺泡中沉积雾化制剂的这些装置包括计量吸入 器、雾化器、干粉发生器、喷雾器等。适用于引导本文所述的muc16糖基 化抗体或其抗原结合片段的肺或鼻施用的其它装置也是本领域已知的。所 有这些装置都使用适合于在气溶胶中分配本文所述的muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段的施用的制剂。这种气溶胶可以由溶液(水溶液和非水溶 液)或固体颗粒组成。计量吸入器，如计量吸入器，通常使用推进 气体，并且在吸气期间需要驱动(参见例如wo 94/16970、wo 98/35888)。 干粉吸入器，如turbuhaler
tm
(astra)，(glaxo)，(glaxo)， 由inhale therapeutics销售的装置，仅举几例，使用混合粉末的呼吸驱动(美 国专利号4,668,218astra，ep 237507astra，wo 97/25086glaxo，wo94/08552dura，美国专利号5,458,135inhale，wo 94/06498fisons，通过引 用完全并入本文)。雾化器如雾化器(mallinckrodt)和雾 化器(marquest medical products)(美国专利号5,404,871aradigm，wo97/22376)，以上参考文献全部并入本文作为参考，从溶液中产生气溶胶， 而计量吸入器，干粉吸入器等产生小颗粒气溶胶。商业上可获得的吸入装 置的这些实例是非限制性实施例，并不意在限制范围。
[0574]
在某些实施方案中，可以通过使得至少一种muc16糖基化抗体或其抗 原结合片段的悬浮液或溶液在压力下穿过喷嘴来制备包含本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的喷雾剂。 可以选择喷嘴的尺寸和构型，施加的压力和液体进料速率来实现所需的输 出和粒度。电喷雾可以例如通过与毛细管或喷嘴进料结合的电场来产生。 有利地，由喷雾器递送的包含至少一种本文所述的muc16糖基化抗体或其 抗原结合片段的组合物的颗粒具有小于约10μm的粒度，优选在约1μm至 约5μm的范围内，并且最多优选约2μm至约3μm。
[0575]
适合与喷雾器一起使用的本文所述的至少一种muc16糖基化抗体或 其抗原结合片段(见第5.1节和第5.2节)的组合物的制剂通常包括至少一种 muc16糖基化抗体或抗原水溶液，其浓度为约0.1mg至约100mg/ml溶液 或mg/gm，或其中的任何范围或值，例如但不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 40、45、50、60、70、80、90或100mg/ml或mg/gm。制剂可以包括诸如 赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂、和优选锌的试剂。制剂 还可以包括用于稳定muc16糖基化抗体或其抗原结合片段组合物的赋形 剂或试剂，如缓冲剂、还原剂、散装(bulk)蛋白质或碳水化合物。用于配制 这种组合物的散装蛋
白包括白蛋白、鱼精蛋白等。用于配制抗体组合物蛋 白质的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。 组合物还可以包括表面活性剂，其可以减少或防止由形成气溶胶时的溶液 雾化引起的组合物的表面诱导聚集。可以使用各种常规的表面活性剂，例 如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其用量通常 为制剂重量的0.001至14％。优选的表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单 油酸酯，聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。
[0576]
在某些实施方案中，组合物通过雾化器，例如喷射雾化器或超声雾化 器施用。通常，在喷射雾化器中，压缩空气源被用于通过孔口产生高速空 气射流。当气体扩张超过喷嘴时，产生低压区域，其通过连接到液体储存 器的毛细管吸引抗体组合物蛋白质的溶液。来自毛细管的液体流在离开管 时被剪切成不稳定的细丝和液滴，产生气溶胶。可以使用一系列配置，流 速和挡板类型来实现来自给定喷射雾化器的所需性能特征。在超声波雾化 器中，高频电能被用于产生振动、机械能，通常采用压电换能器。该能量 直接或通过偶联流体传递给抗体组合物蛋白质的制剂，产生包含抗体组合 物蛋白质的气溶胶。有利地，由雾化器递送的抗体组合物蛋白颗粒具有小 于约10μm的粒度，优选在约1μm至约5μm的范围内，最优选约2μm至约 3μm。
[0577]
在某些实施方案中，组合物经由计量吸入器(mdi)施用，其中推进剂， 至少一种本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和 第5.2节)，和任意赋形剂或其它添加剂作为包括液化压缩气体的混合物盛 放于罐中。计量阀的致动将混合物(die mixture)释放为气溶胶，优选含有尺 寸范围小于约10μm，优选约1μm至约5μm，最优选约2μm至约3μm的颗 粒。可以通过使用包括喷射研磨，喷雾干燥，临界点冷凝等本领域技术人 员已知的各种方法产生的抗体组合物蛋白质的制剂，来获得所需的气溶胶 粒度。优选的计量吸入器包括由3m或glaxo制造并使用氢氟烃推进剂的那 些。
[0578]
用于计量吸入器装置的本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合 片段(参见第5.1节和第5.2节)的制剂通常包括细碎粉末，其含有至少一种 抗-il-6抗体作为非水介质中的悬浮液，例如借助表面活性剂悬浮在推进剂 中。推进剂可以是用于此目的的任何常规材料，例如氯氟烃、氢氯氟烃、 氢氟烃或烃、包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四 氟乙烷、hfa-134a(氢氟烷烃-134a)、hfa-227(氢氟烷-227)等。优选地，推 进剂是氢氟烃。可以选择表面活性剂以将本文所述的至少一种muc16糖基 化抗体或其抗原结合片段稳定化为推进剂中的悬浮液，以保护活性剂免于 化学降解等。合适的表面活性剂包括脱水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、 油酸等。在某些情况下，优选使用溶剂如乙醇制备溶液气溶胶。本领域已 知的用于制备蛋白质的其它试剂也可以包括在制剂中。
[0579]
5.4.3口服剂型
[0580]
在某些实施方案中，本文提供的组合物被配制用于口服给药。在某些 实施方案中，对于口服给药，施用至少一种本文所述的muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段的组合物和方法依赖于佐剂的共同给药，例如间苯二酚 和非离子表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚，以人工增 加肠壁的渗透性，以及共同给药酶抑制剂，例如胰蛋白酶抑制剂，二异丙 基氟磷酸盐(dff)和特斯乐，以抑制酶降解。用于口服给药的固体型剂型的 活性构成化合物可以与至少一种添加剂混合，所述添加剂包括蔗糖、乳糖、 纤维素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、 精氨酸、壳多糖、壳聚糖、果胶、黄
蓍胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原蛋白、 酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。这些剂型还可以含有其 它类型的添加剂，例如无活性稀释剂；润滑剂如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸 酯；防腐剂如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚；抗氧化剂如半胱氨酸；崩解剂； 粘合剂；增稠剂；缓冲剂；甜味剂；调味剂；芳香剂等。
[0581]
在某些实施方案中，用于口服给药的片剂和丸剂可以进一步加工成肠 溶衣制剂。在某些实施方案中，用于口服给药的液体制剂包括例如可用于 医疗用途的乳剂、糖浆、酏剂、悬浮液和溶液制剂。这些制剂可以含有通 常用于所述领域的无活性稀释剂，例如水。脂质体制剂可用于口服给药制 剂，例如，如用于胰岛素和肝素所述(美国专利号4,239,754)。此外，混合 氨基酸(类蛋白质)的人造聚合物的微球可以用于药物的口服给药，例如，如 美国专利号4,925,673所述。此外，载体化合物，例如美国专利号5,879,681 和美国专利号5,871,753所述的，被用于口服给药生物活性剂。
[0582]
5.4.4粘膜剂型
[0583]
在某些实施方案中，本文提供的组合物被配制用于通过粘膜表面吸收。 在某些实施方案中，为了通过粘膜表面进行吸收，施用本文所述至少一种 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的组合物和 方法包括含有多个亚微米颗粒，粘膜粘附性大分子，生物活性肽和水性连 续相的乳剂，其通过实现乳剂颗粒的粘膜粘附而促进通过粘膜表面的吸收 (美国专利号5,514,670)。适用于本文提供的乳剂的粘膜表面可包括例如角 膜、结膜、颊、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠给药途径。用于阴道 或直肠给药的制剂，例如栓剂，可以含有赋形剂，例如聚亚烷基二醇、凡 士林、可可脂等。用于鼻内给药的制剂可以是固体的并且含有赋形剂，例 如乳糖、或者可以是含水或油性的滴鼻溶液。对于口腔含化给药，赋形剂 包括例如糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预凝胶淀粉等(美国专利号5,849,695)。
[0584]
5.4.5透皮剂型
[0585]
在某些实施方案中，本文提供的组合物被配制用于透皮给药。在某些 实施方案中，为了透皮给药，包含至少一种muc16糖基化抗体或本文所述 的其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)的组合物被包封在递送装置中， 例如脂质体或聚合物纳米颗粒，微粒，微胶囊或微球(除非另有说明，否则 统称为微粒)。已知多种合适的透皮给药装置，包括由合成聚合物如聚乳酸、 聚乙醇酸及其共聚物等多羟基酸、聚原酸酯、聚酐和聚磷腈等合成聚合物， 以及天然聚合物如胶原、聚氨基酸、白蛋白和其他蛋白质、藻酸盐和其他 多糖、及其组合制成的微粒(美国专利号5,814,599)。
[0586]
5.4.6试剂盒
[0587]
本文还提供了包含本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段或其 缀合物的试剂盒。在具体实施方案中，本文提供了药物包装或试剂盒，其 包含一个或多个填充有本文所述药物组合物的一种或多种成分的容器，例 如本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，试 剂盒含有本文所述的药物组合物和预防或治疗剂。
[0588]
任选地与这种容器相关联的可以是由管理药物或生物制品的制造、使 用或销售的政府机构规定的形式的通知，剂型和/或使用说明书。在某些实 施方案中，试剂盒中包含的说明书提供关于用于药物组合物给药的剂量和/ 或给药方案的指导。
[0589]
药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶子、小包、小药囊、 管、吸入器、
泵、袋、小瓶、容器、注射器以及适用于选择的药物组合物 和期望的给药和治疗方式的任何包装材料。
[0590]
本文提供的试剂盒可进一步包括用于施用活性成分的装置。这种装置 的实例包括但不限于注射器、无针注射器、滴灌袋、贴剂和吸入器。
[0591]
本文提供的试剂盒可以进一步包括可用于施用成分的药学上可接受的 载体。例如，如果成分以固体形式提供，必须重新配制用于肠胃外给药， 试剂盒可以包含合适载体的密封容器，其中可以将成分溶解以形成无颗粒 的无菌溶液，其适用于肠胃外给药或可以重构为口服给药的悬浮液。药学 上可接受的载体的实例包括但不限于：水性载体，包括但不限于注射用水 usp、氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液 以及乳酸林格注射液；水混溶性载体，包括但不限于乙醇、聚乙二醇和聚 丙二醇；和非水性载体，包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、 油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
[0592]
5.5用途和方法
[0593]
5.5.1治疗用途和方法
[0594]
在某些实施方案中，本文提供了用于治疗对象的癌症，特别是对象中 muc16阳性癌症的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的muc16 糖基化抗体或抗原其结合片段(参见第5.1节和第5.2节)。在具体实施方案 中，对象是如第5.5.5节所述的对象。在具体实施方案中，muc16糖基化 抗体或其抗原结合片段以5.5.3节所述的剂量施用。在具体实施方案中， muc16糖基化抗体或其抗原结合片段根据5.5节所述的方法给药。在具体 实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段与一种或多种另外的药 物活性剂组合施用，如第5.5.4节所述。
[0595]
为了在特定物种的对象中使用muc16糖基化抗体或其片段，使用与该 特定物种的muc16结合的muc16糖基化抗体或其片段。例如，为了治疗 人，使用与人muc16结合的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段。在具 体实施方案中，muc16糖基化抗体或其抗原结合片段是免疫球蛋白。
[0596]
此外，为了在特定物种的对象中使用muc16糖基化抗体或其片段， muc16糖基化抗体，优选muc16糖基化抗体或其抗原结合片段的恒定区 源自该特定物种。例如，为了治疗人，muc16糖基化抗体或其片段可以包 含作为免疫球蛋白的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫 球蛋白包含人恒定区。在具体实施方案中，对象是人。
[0597]
在具体实施方案中，muc16-阳性癌症是卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺 癌、输卵管癌、子宫(例如，子宫内膜)癌、原发性腹膜癌或表达muc16受 体的任何其他组织的癌症。
[0598]
在具体实施方案中，治疗可以是实现有益或期望的临床结果，包括但 不限于症状的减轻，疾病程度的减小，疾病状态的稳定(即不恶化)，延迟或 减缓疾病进展，改善或缓解疾病状态，以及缓解(无论是部分还是全部)，无 论是可检测的还是不可检测的。在具体实施方案中，与不接受治疗的预期 生存期相比，“治疗”还可以延长生存期。在一个具体实施方案中，将本文所 述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段或本文所述的药物组合物施用 于患有癌症的对象(例如，卵巢癌，肺癌，胰腺癌，乳腺癌，输卵管癌，子 宫(例如，子宫内膜)癌或原发性腹膜癌，或表达muc16受体的任何其他组 织的癌症)达到以下效果中的至少一种，两种，三种，四种或更多种：(i)减 少或改善一种或多种癌症症状的严重程度；(ii)减少
与癌症相关的一种或多 种症状的持续时间；(iii)预防与癌症相关的症状复发；(iv)对象的住院治疗 减少；(v)减少住院时间；(vi)对象生存期增加；(vii)增强或改善另一疗法的 治疗效果；(viii)抑制与癌症相关的一种或多种症状的发展或发作；(ix)与癌 症相关的症状数量减少；(x)通过本领域熟知的方法评估的生活质量的改善； (x)抑制肿瘤的复发；(xi)肿瘤和/或与之相关的一种或多种症状的消退；(xii) 抑制肿瘤和/或与之相关的一种或多种症状的进展；(xiii)肿瘤生长减少；(xiv) 肿瘤大小的减小(例如体积或直径)；(xv)新形成的肿瘤的形成减少；(xvi)预 防，根除，清除或控制原发性，局部性和/或转移性肿瘤；(xvii)转移的数量 或大小减少；(xviii)降低死亡率；(xix)无复发生存率的增加；(xx)维持肿瘤 的大小，并且肿瘤的大小不增加或增加的量小于在给予标准治疗之后的肿 瘤的增加，所述大小如本领域技术人员可获得的常规方法进行测量，例如 磁共振成像(mri)、动态对比增强mri(dce-mri)、x射线和计算机断层(ct) 扫描或正电子发射断层(pet)扫描；和/或(xxi)患者缓解长度增加。治疗可以 实现前述的一个或多个。
[0599]
5.5.2诊断用途
[0600]
在某些实施方案中，本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 (参见第5.1节和第5.2节)可用于诊断目的以检测，诊断或监测本文所述的 病症(例如，涉及muc16阳性癌细胞的病症)。在某些实施方案中，用于诊 断目的的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段如第5.2节所述进行标记。
[0601]
在某些实施方案中，本文提供了用于检测本文描述的病症的方法，其 包括(a)使用一种或多种本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段 来测定对象的细胞或组织样品中muc16或其片段的表达；和(b)将muc16 或其片段的表达水平与对照水平进行比较，例如，在正常组织样品中的水 平(例如，来自不具有本文所述病症的对象或来自相同患者的病症发作前)， 由此与muc16或其片段表达的对照水平相比，muc16的测定水平或其片 段表达的增加或减少是本文所述的病症的指标。
[0602]
本文所述的抗体可用于使用本文所述的或本领域技术人员已知的常规 免疫组织学方法来测定生物样品中muc16或其片段的水平(例如参见 jalkanen等，1985，j.cell.biol.101:976-985和jalkanen等，1987，j.cell.biol. 105:3087-3096)。用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫 测定，例如酶联免疫吸附测定(elisa)和放射免疫测定(ria)。合适的抗体测 定标记是本领域已知的，并且包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶；放射性同 位素，如碘(
125
i、
121
i)、碳(
14
c)、硫(
35
s)、氚(3h)、铟(
121
in)和锝(
99
tc)；发光 标签，如鲁米诺；和荧光标记，如荧光素和罗丹明，以及生物素。
[0603]
在某些实施方案中，通过在初次诊断后一段时间重复诊断的方法来进 行本文所述的病症(例如，muc16阳性癌症)的监测。
[0604]
可以使用本领域已知的用于体内扫描的方法在对象中检测标记分子的 存在。技术人员将能够确定检测特定标签的适当方法。可用于本发明的诊 断方法的方法和装置包括但不限于计算机断层扫描(ct)，全身扫描如位置 发射断层扫描(pet)，磁共振成像(mri)和超声检查。
[0605]
5.5.3剂量和给药方案
[0606]
本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第 5.2节)或组合物(参见第5.4节)或表达抗体或其抗原结合片段的细胞可以通 过各种途径递送给对象。
这些包括但不限于胃肠外、鼻内、气管内、口服、 皮内、局部、肌肉内、腹膜内、透皮、静脉内、肿瘤内、结膜和皮下途径。 也可以使用肺部给药，例如通过使用吸入器或雾化器，以及用作为喷雾剂 的雾化剂的制剂。在一个实施方案中，将本文所述的muc16糖基化抗体或 其抗原结合片段或组合物肠胃外施用于对象(例如，如第5.5.5节所述的对 象)。在一个具体实施方案中，所述肠胃外给药是静脉内，肌内或皮下。
[0607]
muc16糖基化抗体或其抗原结合片段或其在治疗和/或预防病症中有 效的组合物的量将取决于疾病的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。
[0608]
在组合物中使用的精确剂量还将取决于施用途径和癌症的类型，并且 应根据从业者的判断和每个对象的情况来决定。例如，有效剂量还可以根 据给药方式、目标部位、患者的生理状态(包括年龄、体重和健康状况)、患 者是人类还是动物、其他药物施用、或治疗是预防性的还是治疗性的来发 生变化。治疗剂量被最佳滴定以优化安全性和功效。
[0609]
在某些实施方案中，使用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。可以从 源自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推断有效剂量。
[0610]
对于muc16糖基化抗体或其抗原结合片段，剂量可以为约0.0001至 100mg/kg的患者体重，更通常为0.01至15mg/kg。例如，剂量可以是1mg/kg 体重，10mg/kg体重或1-10mg/kg的范围，或换句话说，针对70kg的患者， 分别为70mg或700mg或在70-700mg范围内。通常，由于对外来多肽的免 疫应答，人抗体在人体内的半衰期比其他物种的抗体更长。因此，较低剂 量的人抗体和较不频繁的施用通常是可能的。
[0611]
在某些实施方案中，例如在施用表达抗体或其抗原结合片段或car的 工程细胞时，将对象在约百万至约1000亿个细胞的范围内施用于对象，例 如，如100万至500亿细胞(例如约500万细胞、约2500万细胞、约5亿细 胞、约10亿细胞、约50亿细胞、约200亿细胞、约300亿细胞、约4百 亿细胞或由任意前述两个值定义的范围)，例如约1千万至约1千亿细胞(例 如，约2千万细胞、约3千万细胞、约4千万细胞、约6千万细胞、约7 千万细胞、约8千万细胞、约9千万细胞、约1百亿细胞、约250亿细胞、 约5百亿细胞、约750亿细胞、约9百亿细胞或由任意前述两个值定义的 范围)和在一些情况下约1亿细胞至约5百亿细胞(例如，约1.2亿细胞、 约2.5亿细胞、约3.5亿细胞、约4.5亿细胞、约6.5亿细胞、约8亿细胞、 约9亿细胞、约30亿细胞、约3百亿细胞、约450亿细胞)或这些范围之间 的任何值。在一些实施方案中，总细胞的剂量和/或个体的亚群细胞的剂量 在约104至约109细胞/千克(kg)体重范围内，例如105至106细胞/kg体重， 例如，约1x105细胞/kg、1.5x105细胞/kg、2x105细胞/kg或1x106细胞 /kg、2x106细胞/kg、5x106细胞/kg或10x106细胞/kg体重。例如，在一 些实施方案中，施用细胞的剂量在误差为约104至约109个t细胞/千克(kg) 体重，例如105至107个t细胞/kg体重的某个范围内。
[0612]
muc16糖基化抗体或其抗原结合片段可以多次施用。单剂量之间的间 隔可以是1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年 或2年。
[0613]
5.5.4联合治疗
[0614]
在一个具体实施方案中，本文提供的用于治疗对象的癌症(例如，卵巢 癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫(例如子宫内膜)癌或原发性腹 膜癌)的方法包括向有需要的对象施用包含本文所述的muc16糖基化抗体 或其抗原结合片段的药物组合物(参见第5.1节和第5.2节)，还包括向对象 施用一种或多种另外的治疗剂。在一个具体实施方案中，
式的muc16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨 基酸序列是seq id no:133；(ii)其免疫特异性结合重组表达第三形式的 muc16的细胞的能力，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸 序列是seq id no:139；和(iii)其不能免疫特异性结合重组表达第四形式 的muc16的细胞，其第四形式是糖基化的，其中第四形式的氨基酸序列是 seq id no:152，其中重组表达第一形式的muc16的细胞、重组表达第三 形式的muc16的细胞和重组表达第四形式的muc16的细胞是相同类型的 细胞。
[0617]
在具体的实施方案中，另外的试剂是用于治疗卵巢癌的试剂。在具体 的实施方案中，另外的试剂是用于治疗胰腺癌的试剂。在具体的实施方案 中，另外的试剂是用于治疗肺癌的试剂。在具体的实施方案中，另外的试 剂是用于治疗乳腺癌的试剂。在具体的实施方案中，另外的试剂是用于治 疗输卵管癌的试剂。在具体的实施方案中，另外的试剂是用于治疗子宫(例 如，子宫内膜)癌的试剂。在具体的实施方案中，另外的试剂是用于治疗原 发性腹膜癌的试剂。
[0618]
本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第 5.2节)可以同时或顺序(之前和/或之后)与另外的治疗剂一起施用。抗体或其 抗原结合片段和另外的治疗剂可以以相同或不同的组合物和相同或不同的 施用途径施用。针对患有癌症的对象(例如，卵巢癌、胰腺癌、肺癌、乳腺 癌、输卵管癌、子宫(例如子宫内膜)癌和原发性腹膜癌)，可以在施用第二 次治疗(本文所述的muc16糖基化抗体或抗原结合片段(参见本文所述的第 5.1节和第5.2节)或其他治疗剂)之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45 分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72 小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、 同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4 小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、 3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用第一疗法(其是本文所述的 muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)或另外的治 疗剂)。在某些实施方案中，与本文所述的muc16糖基化抗体或其抗原结 合片段(见第5.1节和第5.2节)组合给予对象的另外的治疗剂以相同的组合 物(药物组合物)给药。在其它实施方案中，与本文所述的muc16糖基化抗 体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2节)组合施用的另外的治疗剂以 与本文描述的muc16糖基化抗体或其抗原结合片段(参见第5.1节和第5.2 节)不同的组合物对对象施用(例如，使用两种或更多种药物组合物)。
[0619]
5.5.5患者群
[0620]
根据本文提供的方法治疗的对象可以是任何哺乳动物，例如啮齿动物、 猫、犬、马、牛、猪、猴、灵长类动物或人等。在优选的实施方案中，对 象是人。在另一优选实施方案中，对象是犬。如本文所使用的，术语“对 象”和“患者”可互换使用。
[0621]
在某些实施方案中，根据本文提供的方法治疗的对象已被诊断患有 muc16阳性癌症，包括但不限于卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫癌、 输卵管癌或原发性腹膜癌、或表达muc16的任何其他组织的癌症。
[0622]
通过说明而非限制的方式提供以下实施例。
6.实施例
[0623]
6.1实施例1：muc16/ca125羧末端部分的表达诱导转化和肿瘤侵袭
[0624]
6.1.1介绍
[0625]
自20世纪80年代初以来，血清ca125抗原(muc16的抗原性片段) 一直是卵巢癌评估和管理的支柱，但其对卵巢癌表现的生物学和贡献了解 甚少(参见参考文献1-3，如下文第6.1.5节所述)。2001年实现的ca125的 克隆首先将muc16鉴定为具有小胞内域、跨膜域、靠近推测的切割位点的 胞外域、以及各自为156个氨基酸长的12-20个串联重复的大的重度糖基化 区域的拴粘蛋白(图1a)(参见下文第6.1.5节所述的参考文献4-6)。卵巢、输 卵管和子宫的浆液性癌症通常表达大量的muc16，异常的muc16表达可 以在其他几种恶性肿瘤中发现，包括肺癌、胰腺癌和乳腺癌。其他拴粘蛋 白的表达是上皮器官的常见特征，并且它们通常在恶性肿瘤中过度表达。 两个突出的例子是在许多乳腺和卵巢癌中过度表达的muc1和在胰腺和胃 肠癌中特征性的丰富的muc4(参见下文第6.1.5节所述的参考文献7)。这 两种粘蛋白都被鉴定为具有转化性质(参见下文第6.1.5节所述的参考文献8 和9)。转化机制不同，不完全清楚。muc1具有β-连环蛋白同源性区域， 已显示其转位至细胞核并作为转录因子(参见下文第6.1.5节所述的参考文 献10和11)。相比之下，muc4在其跨膜域内具有her结合域，并且至少 部分地通过her家族激酶起作用(参见下文第6.1.5节中所述的参考文献12 和13)。muc16与这些域中的任一个缺乏同源区，并且似乎已经独立进化(参 见下文第6.1.5节所述的参考文献12)。与muc1和muc4两者相比，muc16 的表达受到更多的限制，通常几乎专一性地表达于苗勒带(m
ü
llerian tract) 和眼上皮(参见下文第6.1.5节所述的参考文献14-16)。muc16分子的串联 重复区似乎作为与间皮素和其他基质蛋白的关键相互作用蛋白起作用(参见 下文第6.1.5节所述的参考文献17)。这些相互作用可能是卵巢癌的浆膜传 播的经典模式的原因。在临床环境中，来自编码ca125抗原的muc16的 高水平循环元素与不良临床结果相关，与阶段、等级和其他传统临床因素 无关(参见如下第6.1.5节所述的参考文献18)。其他人已鉴定得到muc16 的c末端在侵袭和生长中是重要的，但是负责转化的近端muc16序列的 特定区域尚未被描述(参见例如，therialt等，gynecol oncol 2011， 121(3):434-443和giannakouros等int.j.oncol.2015，41(1):91-98)。已经在 癌症基因组图谱(tcga)卵巢癌项目中观察到在卵巢癌dna中编码muc16 的基因组区域的扩增和muc16 mrna的过度表达，并且与更差的结果相 关(参见如下第6.1.5节所述参考文献19)。小鼠中muc16的缺失与不同的 表型不相关，但持续或异常的muc16表达的作用是未知的(参见下文第 6.1.5节所述的参考文献20)。本实施例中的数据显示muc16的114个c
‑ꢀ
末端氨基酸残基(muc16
c114
，seq id no：133)的表达，以及特别的， muc16
c114
的残基asn30(对应于成熟muc16(seq id no：no：150)的 asn1806)的糖基化，与信号转导、基因表达和侵袭性生物学行为的特异性 改变相关。
[0626]
6.1.2材料和方法
[0627]
6.1.2.1 muc16羧端(muc16
c114
)和muc16-ca125域 (muc16
c344
)dna构建体和糖基化的融合蛋白的合成
[0628]
产生了编码截短形式的muc16(命名为muc16
c344
，muc16
c114
， muc16
c80
和muc16
c86
，图1b和图1c)的dna构建体。使用phrgfp ii-c 载体(phrgfp)(stratagene，lajolla，ca)的ecorv和noti多克隆位点引入 muc16
c114
，muc16
c80
、muc16
c86
和muc16
c344 dna以产生gfp融合构建 体，其中在截短的muc16融合蛋白羧端上存在gfp蛋白。使用 pbk-cmv-muc16-b53 dna作为模板产生muc16片段(muc16
c344
， muc16
c114
，muc16
c80
和muc16
c86
)的pcr产物(yin bwt等
人，2002， 98(5):737-740)，pcr产物在1％琼脂糖凝胶中纯化，测序，并插入到phrgfpii-c载体(phrgfp)的ecorv和noti多克隆位点。pfuse-higg1-fc2载体购 自invivogen(san diego，ca)。针对胞外域muc16
c57-114
(seq id no：150 的位点1777至1834)设计聚合酶链反应(pcr)引物，或合成
117-244
lgals3 dna序列的糖结合域(sigma-genosys，the woodlands，tx)，使用限制性 内切酶位点ecorv作为正向引物，限制性内切酶位点ncoi作为反向引物。 使用pbk-cmv-muc16-b53 dna作为模板产生muc16
c57-114
片段的pcr 产物，使用来自atcc(manassas，va)的lgals3 cdna克隆(mgc:2058 image:3050135genbank：aah01120.1；dbsource登录号bc001120.2) 作为dna模板合成lgals3 pcr产物的糖结合域。pcr产物在1％琼脂 糖凝胶中纯化，测序，并插入pfuse-higg1-fc2载体中。
[0629]
6.1.2.2引物和pcr
[0630]
muc16-胞浆区(muc16
c114
，羧端114aa)正向和反向引物 (5
’‑
ccatgcgatatcgccaccatggtgaacttctcgccactggct-3’和 5
’‑
tacggcggccgcttgcagatcctccaggtctagg-3’，seq idno:121和seq id no:122)。muc16
c344
(一个仅具有一个半胱氨酸环的串 联重复，344aa) (5
’‑
ccatgcgatatcgccaccatggtgacaggccctgggctggacag a-3’和5
’‑
tacggcggccgcttgcagatcctccaggtctagg-3’，seq idno:123和seq id no:124)在正向引物中具有ecorv和kozak，在反向 引物中具有noti。使用muc16
c114
–
gfp dna构建体通过快变(quick change) 引物产生muc16
c80
和muc16
c86
构建体。muc16
c57-114 pfuse-higg1-fc2 载体的正向和反向引物 (5'-ccatgcgatatcaaacttctcgccactggct-3’和 5
’‑
agatctaaccatgggaaggtcagaattcccagt-3’，seq id no:125 和seq id no:126)，pfuse-higg1-fc2载体
117-244
lgals3的糖结合域的正 向和反向引物(5
’‑
catgcgatatcaccttataacctgcctttg-3’和 5
’‑
agatctaaccatggtatatgaagcactggt-3’，seq id no:127和 seq id no:128)，在正向引物中具有ecorv，在反向引物中具有ncoi。所 有上述引物由sigma genosys，the woodlands，tx合成。
[0631]
通过以下方法实现pcr条件：将dna在95℃下解链5分钟以实现变 性。进行30个重复循环的97℃加热30秒、60℃退火1分钟、72℃延伸1 分钟。随后将生成的pcr产物链在72℃延伸5分钟，然后在4℃下冷却过 夜。
[0632]
phrgfp ii-c载体dna，muc16
c114
、muc16
c80
、muc16
c86
、muc16
c344
和muc16
c678
凝胶纯化的dna用ecorv和noti(new england biolabs， beverly，ma)限制性内切酶在37℃水浴中分别消化过夜。 pfuse-higg1-fc2载体dna，muc16
c57-114
和
117-244
gals3凝胶纯化的dna 用ecorv和ncoi(new england biolabs，beverly，ma)限制性内切酶在 37℃的水浴中分别消化过夜。对muc16
c114
和phrgfp，muc16
c344
和 phrgfp或muc16
c678
和phrgfp限制性消化的dna进行凝胶纯化，并使用 t4连接酶(roche diagnostics corporation，indianapolis，in)连接过夜。类 似地，对muc16
c57-114
和pfuse-higg1-fc2，
117-244
lgals3和 pfuse-higg1-fc2限制性消化的dna进行凝胶纯化，并使用t4连接酶 (roche diagnostics corporation，indianapolis，in)连接过夜。根据制造商的 方案将连接的dna转化到xl-1blue超感受态细胞(stratagene，la jolla， ca)中，并将它们铺在含有卡那霉素(50μg/ml，sigma chemical co.， st.louis，mo)的lb培养基的琼脂平板上(对于phrgfp载体)或含有25μg/ ml zeocin(invitrogen，ca)的lb培养基的琼脂平板上。在第二天选择克 隆，并使用wizard plus miniprep dna纯化系统(promega corporation， madison，wi)提取miniprep dna。对选择
的克隆dna在mskcc dna测 序核心实验室上使用muc16和phrgfp的正向和反向引物进行测序，以证 实序列中存在muc16和phrgfp作为融合构建体或muc16
c57-114
和 pfuse-higg1-fc2或
117-244
lgals3和pfuse-higg1-fc2。通过使用wizardplus megaprep dna纯化系统(promega corporation，madison，wi)制备来 自该克隆的megaprep dna，其也被证实在其序列中存在muc16和 phrgfp或muc16
c57-114
和pfuse-higg1-fc2或
117-244
lgals3和 pfuse-higg1-fc2作为融合构建体。
[0633]
6.1.2.3荧光活化细胞分选(facs)
[0634]
将转染的细胞进行胰蛋白酶消化，洗涤并通过血细胞计数器计数。将 细胞分散在多个eppendorf管中，至少0.5-1
×
106/管。用含有1％fcs和 0.025％叠氮化钠(facs缓冲液)的pbs洗涤细胞。对于表面facs染色， 将细胞在不含(用于第二抗体对照)或含有1μg/管的muc16-羧基末端单克隆 (4h11.2.5)的生物反应性上清液、小鼠抗人oc125(m3519)(dakocytomation， dako north a-merica inc.，carpinteria，ca)中在冰上孵育30分钟。eppendorf 管中的细胞还用1μg/管的非特异性同种型匹配的对照小鼠抗体(igg1为 13c4，igg2b单克隆为4e11，从mskcc单克隆核心实验室获得)进行表面 染色(数据未显示)，并在冰上孵育30分钟。所有细胞用facs缓冲液洗涤 3次。将细胞与1μg/管的第二抗体山羊抗小鼠igg1-pe或igg2b-pe在冰上 孵育30分钟，然后用facs缓冲液洗涤3次。细胞用facs calibur分析。
[0635]
6.1.2.4细胞培养
[0636]
从美国典型培养物保藏中心(atcc，manassas，va)获得nih/3t3(3t3) 细胞(成纤维细胞)，a2780细胞是人卵巢癌细胞系(参见下文第6.1.5节中所 述的参考文献28)。根据公布的条件维持两种细胞系。通过转染muc16表 达载体(phrgfp-muc16
c344
、phrgfp-muc16
c114
、phrgfp-muc16
c80
和 phrgfp-muc16
c86
)并在其各自培养物中使用遗传霉素(g418，invitrogen， grand island，ny)进行选择，并基于绿色荧光蛋白(gfp)的表达进行分离， 产生稳定的muc16阳性细胞系。muc16
c114
转染子具有从推定的切割位点 到羧基末端(seq id no：150的氨基酸1777至1890)的muc16蛋白的细胞 表面表达(参见下文第6.1.5节中所述的参考文献5)。以类似的方式制备具 有较长muc16片段的细胞系，包括具有muc16
c344-gfp载体表达的细胞 系，其具有作为延伸至muc16羧基端的344个氨基酸片段(氨基酸1547至 1890)的muc16蛋白的细胞表面表达(参见下文第6.1.5节所述的参考文献 5)。
[0637]
6.1.2.5转染
[0638]
使用制造商的方案，使用dotap(roche diagnostics，indianapoliscorporation，in)将所有构建体引入nih/3t3(3t3)和a2780细胞。在各自 的培养基中用400μg/ml的g418选择3t3和a2780细胞的稳定转染子。 在mskcc流式细胞计数核心实验室(fccf)上对细胞进行两次gfp表达的 细胞分选，选择的细胞作为细胞系生长至多达15代。通过facs分析进行 常规监测，以确认这些细胞系的gfp阳性。使用抗hrgfp(stratagene，lajolla，ca)和抗-muc16-羧基末端单克隆抗体通过western印迹分析这些细 胞系的蛋白质提取物(参见下文第6.1.5节中所述的参考文献5和14)。
[0639]
6.1.2.6生长曲线
[0640]
将1000稳定转染的细胞/孔接种在200μl培养基/孔中的多个96孔平底 板中，并在37℃和5％co2下孵育5天。每天用25μl/孔的alamar blue(abdserotec co.uk)发展三个平
行的培养板，并在37℃和5％co2下孵育4小时。 在perseptive biosystems cytofluor multiwell荧光板读数器型号#4000上读 取板，530nm激发和620nm发射。记录4天以上的生长曲线，并相应地绘 制三个平行平板的平均值。
[0641]
6.1.2.7软琼脂分析
[0642]
将稳定转染的细胞置于琼脂糖悬浮液中并铺在薄的琼脂糖层上，并分 析其形成不依赖贴壁的集落的能力。每块板铺10ml培养基-琼脂糖悬浮液 1-5百万个细胞，并在37℃和5％co2下孵育。监测板上的集落形成。每4-5 天覆盖额外的培养基。培养11-14天后，计算了集落数并对集落进行拍照。
[0643]
6.1.2.8转染至真核表达载体
[0644]
分别将muc16
c57-114-pfuse-higg1-fc2和 117-244
lgals3-pfuse-higg1-fc2构建体转染到人胚胎肾(hek)freestyle 293f细胞(invitrogen，ca)中，其表达并分泌融合蛋白到血清培养基中。用 5μg/道的来自携带pfuse-higg1-fc2对照空载体、 muc16
c57-114-pfuse-higg1-fc2载体和lgals3-pfuse-higg1-fc2载体的 瞬时转染的hek 293f细胞的融合蛋白上清液进行3个10％sds-page凝 胶。根据制造商的方案，一个凝胶用gelcode试剂直接染色。将来自两个凝 胶的蛋白质转移到两个硝酸纤维素膜上，所述两个硝酸纤维素膜在室温下 的振荡器上用含有0.1％tween-20(pbst)的5％无脂奶-磷酸盐缓冲盐水封 闭1小时。用5％无脂奶pbst中以1:5000稀释的抗人igg1-fc-hrp(γ1链 特异性)(southern biotech inc.，ca)、5％无脂奶pbst中以1:2000稀释的 4h11-hrp mab(参见下文第6.1.5节所述的参考文献14)和5％无脂奶pbst 中以1：200稀释的抗人gal3mab(santa cruz biotechnology，ca)在振荡 器上4℃标记(probe)膜过夜。将gal3膜用pbst洗涤三次，并用抗小鼠 igg-hrp第二抗体以1:3,000稀释度在5％的无脂奶pbst中室温下振荡器 上标记1小时。膜用pbst洗涤三次，然后用ecl试剂(perkin el-mer，ny) 化学发光底物处理5分钟，并将照射的信号捕获在x射线胶片上。
[0645]
6.1.2.9侵袭
[0646]
在基质胶侵袭室(bd biosciences，bedford，ma)中测定基底膜侵袭。 在48孔时测量三个平行孔中的基质胶迁移，与phrgfp载体对照进行比较， 并表达为％phrgfp对照基质胶侵袭。测定了0.1μg/ml的衣霉素 (sigma-aldrich，st.louis mo cat#t7765)或5μg/ml的 muc16
c57-c114-pfuse-higg1-fc2或5μg/ml的
117-244
lgals3 pfuse-higg1-fc2融合蛋白处理的稳定细胞系的48小时后基质胶迁移并表 达为％phrgfp对照基质胶侵袭。
[0647]
bd biocoat
tm matrigel
tm
侵袭插入物或室(24孔板中的目录#354480) 和对照插入物(24孔板中的目录#354578)购自bd biosciences，ma。按照 制造商的方案进行基质胶侵袭测定。简言之，将24孔板(储存在-20℃)和对 照插入物(储存在4℃)中的基质胶体室进入室温。将两种插入物用插入物以 及24孔板的外孔中的0.5ml无血清培养基在37℃ 5％co2加湿培养箱中再 水合2小时。将培养的3t3或a2780细胞进行胰蛋白酶化，并用培养基洗 涤。将一百万个细胞分离至另一离心管中并用无血清培养基洗涤3次。随 后调节这些细胞，以在0.5ml无血清培养基中得到10,000个细胞。除去再 水合的插入物中的培养基，并将插入物转移到含有0.75ml含10％胎牛血清 (fbs)的培养基的新24孔板中，该培养基用作化学引诱剂。立即将0.5ml 无血清培养基中的细胞(10,000个细胞)加入到插入物中。适当注意插入物和 外孔中没有困住气泡。将24孔板在37℃ 5％co2加湿培养箱中孵育48小 时。孵育
后，通过将棉花尖棉签插入基质胶或对照插入物中并轻轻地施加 压力，同时将棉签的尖端移动到膜表面上，通过“擦洗”从膜的上表面去除非 侵袭细胞。用浸有培养基的第二个棉签重复擦洗过程。然后将插入物在含 有0.5％结晶紫染色剂的0.5ml蒸馏水中的新24孔板中染色30分钟。染色 后，将插入物在3个蒸馏水烧瓶中冲洗以除去多余的染色剂。在新的24孔 板中将插入物风干。在倒置显微镜下以200倍放大倍率手工计数侵袭细胞。 计数三个平行膜的几个领域，并记录在图中。
[0648]
6.1.2.10实时聚合酶链反应
[0649]
通过遵循ribopure试剂盒(ambion，austin，tx)方案制备rna分离 物。如前所述(参见下文第6.1.5节所述的参考文献29)，使用rt2 profilerpcr array系统(super array，frederick，md)进行一组转移和胞外区域 (extracellular domain)基质蛋白基因的rt pcr。
[0650]
6.1.2.11无胸腺裸鼠中的肿瘤生长
[0651]
将转染的细胞系和适当的对照细胞系引入无胸腺裸鼠的侧腹或腹膜 腔，并且由mskcc抗肿瘤评估核心实验室提供常规动物护理。对于肿瘤 生长评估实验，将来自每个肿瘤细胞系的2百万个细胞分别植入5-15个无 胸腺裸鼠中。每周进行两次肿瘤测量，根据mskcc rarc指南，肿瘤生 长记录为最大尺寸1500mm3。
[0652]
6.1.2.12 western印迹分析
[0653]
将稳定的细胞系在其各自培养基中的10cm培养皿中培养，并在37℃ 和5％co2下孵育3天。然后将它们用冰冷的pbs洗涤两次，并用1-2ml 冰冷的pbs刮洗并离心。将沉淀的细胞用0.2ml改良的ripa裂解缓冲液(20 mm tris-hcl，ph 7.4；150mm nacl；1％np-40；1mm na3vo4；1mmpmsf；1mm dtt；具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(来自rochediagnostics，in的cat#11836170001))在冰上裂解30分钟，并在4℃离心 10分钟。使用bio-rad蛋白测定(biorad laboratories，hercules，ca)测量 上清液的蛋白浓度。通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离等量的 蛋白，并在4℃下使用biorad转移装置转移到pvdf膜。用3％牛血清白 蛋白(bsa)或5％非脂乳在含有0.1％tween-20(pbst)的pbs中4℃将膜封 闭过夜。用多种一抗(cell signaling，ma：akt cat#9272，phospho-akt (ser473)(193h12)cat#4058，p44/43mapk(erk1/2)cat#9102，phospho
‑ꢀ
p44/43mapk(erk1/2)(thr202/tyr204)cat#9101)，(sigma-aldrich，inc.，st. louis，mo：β-肌动蛋白cat#a5441)，(southern biotech，birmingham， al：抗人-fc-igg1-hrp cat#9054-05和abgent，san diego，ca：多克隆 lgals3抗体cat#ap11938b)在4℃使膜显影过夜。将膜用pbst洗涤三次， 并用hrp缀合的抗小鼠或抗兔抗体(ge healthcare，uk)(1:5000稀释)在室 温下显影1小时。然后将膜用pbs-t洗涤三次，并在室温下用westernlightning chemiluminescence试剂(ecl，perkin el-mer)显影1-5分钟，并将 信号在hyblot cl膜(denville scientific inc.metuchen，nj)上显影。
[0654]
6.1.2.13 muc16的tcga表达分析
[0655]
作为tcga项目(tcga.cancer.gov)的一部分，可获得316个浆液性卵巢 癌样品的综合基因组数据。基因水平的dna拷贝数呼叫(calls)是使用 gistic从cbs分段的agilent 1m微阵列数据得到的。使用三种不同的平 台(agilent 244k全基因组表达阵列，affymetrix ht-hg-u133a和affymetrixexon 1.0阵列)测量muc16 mrna表达，并且如先前
所述导出基因表达值 (参见如下文第6.1.5节的参考文献30)。确定了muc16的体细胞突变，全 部外显子组捕获，然后进行下一代测序(solid或illumina)。所有tcga数 据均从cbio癌症基因组学门户网站(www.cbioportal.org)下载。然后将mrna 表达值与相应的dna拷贝数类别(纯合缺失、半合子缺失、二倍体、增益、 高水平扩增)进行关联，并将体细胞突变覆盖所有样品，并使用统计框架r (www.r-project.org)绘制箱形图，如前所述(参见下文第6.1.5节所述的参考 文献31)。临床数据来自tcga数据门户(tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)。
[0656]
6.1.2.14 muc16
c354
转基因小鼠
[0657]
使用载体phrgfp ii-c(stratagene，la jolla，ca)制备条件羧基末端354 氨基酸(muc16
c354
)转基因构建体，并用来自载体pcag-creert2 (addgene，cambridge，ma)的cag启动子替代cmv启动子。通过pcr 从yin bw等人制备的构建体b53扩增muc16
c354
片段(参见下文第6.1.5 节中所述的参考文献5和6)。muc16
c354
条件构建体包含以下单元：pcag， 5’loxp，hrgfp，bghpa，3’loxp，muc16
c354
，ha和sv40pa。
[0658]
使用上述muc16
c354
条件转基因构建体，mskcc小鼠遗传学核心实验 室在b6cbaf1/j小鼠上进行显微注射程序。通过southern印迹从99只小 鼠中鉴定出12只muc16
c354
条件转基因小鼠。所有12只前-建立者 (pro-founder)均与b6.fvb-tg(eiia-cre)c5379lmgd/j小鼠(the jacksonlaboratory，bar harbor，mi)交配，以除去位于两个loxp之间的hrgfp。解 剖每个建立者的muc16
c354 pcr阳性雌性小鼠。将来自这些解剖的小鼠的 器官(脑，结肠，心脏，肾脏，肝脏，肺，卵巢和脾脏)切碎并匀浆化。通过 western印迹分析蛋白样品，以鉴定高表达muc16
c354
的建立者。将得到的 转基因小鼠保持在混合背景上。
[0659]
将转基因muc16
c354
小鼠的两只建立者与p53杂合小鼠 (b6.129s2-trp53tm1tyj/j)(the jackson laboratory，bar harbor，mi)杂交 以产生双转基因muc16
c354
:p53+/-。将得到的转基因小鼠保持在混合背景 上。使用提取的脚趾或尾dna通过pcr对所有小鼠进行基因分型。所有 实验动物均按照mskcc制度化动物保护和使用委员会和研究动物资源中 心(mskcc institutional animal care and use committee and research animalresource center)以及nih“实验动物护理和使用指南”批准的指南进行维护。
[0660]
6.1.2.15组织学分析
[0661]
处死12个月龄的小鼠并进行尸检。经肉眼检查，将解剖组织样品在10％ 中性缓冲福尔马林中固定24小时，然后在醇和二甲苯中处理，包埋在石蜡 中，切片厚度5μm，用苏木精和伊红(h&e)染色。组织由兽医病理学家(sm) 检查，根据公布的啮齿动物病理学命名指南诊断肿瘤和非肿瘤性病变。
[0662]
6.1.2.16统计分析
[0663]
使用学生双侧配对t检验比较体外生长、侵袭和软琼脂生长潜力的研究 组。根据提供的软件(superarray)，使用卡方检验分析rt-pcr数据的显著 性。使用每个动物随着时间的总肿瘤体积曲线下面积评估进行肿瘤体积的 比较。基于两组中所有动物均存活的最后一天进行肿瘤体积评估。使用级 别的无参数检验(wilcoxon双样本测试)来测试组之间的分布差异。在动物生 存研究中，进行时间对事件的分析，事件定义为肿瘤体积超过1,500mm3或溃烂的时间。对肿瘤体积小于1,500mm3的动物跟踪多达60天，然后进 行检查。使用kaplan-meier方法估计存活分布(参见下文第6.1.5节所述的 参考文献32)。
[0664]
6.1.3结果
[0665]
在muc16蛋白的串联重复区的明显切割和释放之后，蛋白质的羧基末 端的大约114个氨基酸(c114)被认为保留在细胞表面上，并且该分子部分的 潜在功能是未知的。分析了muc16蛋白最接近部分在3t3成纤维细胞和卵 巢癌细胞系恶性转化和行为中的作用。为了测试接近切割位点的残留c114 氨基酸元件的作用，设计了两个载体：(1)muc16
c114-gfp载体，和(2)截短 的muc16
c344-gfp载体(图1)和这些载体和phrgfp对照载体，独立转染入 3t3成纤维细胞。选择表达muc16
c114-和muc16
c344
的细胞系，并用g418 维持，使用识别muc16羧基末端的独特氨基酸序列的单克隆抗体通过 facs分析证实muc16
c114
和muc16
c344
的稳定表达(参见下文6.1.5节引用 的参考文献14)。表达来自muc16(seq id no:132)蛋白的344个氨基酸的 细胞系(muc16
c344-gfp细胞系)具有典型的ca125表位，其通过facs分 析在细胞表面上被oc125抗体识别，ca125被释放到细胞培养上清液中。 oc125不识别muc16
c114-gfp细胞。然而，所有转染的细胞系都是 muc16
c114
胞外序列(seq id no：133)细胞表面阳性的，所述序列靠近推测 的切割位点并被muc16胞外域特异性4h11抗体识别(参见下文6.1.5节引 用的参考文献14，图1)。
[0666]
6.1.3.1 3t3细胞
[0667]
为了研究由muc16的残留的切割后元件赋予的转化特性，分析了3t3 muc16
c114-gfp和3t3 muc16
c344-gfp细胞系的特征，并将这两个最小的 muc16元件的效果与载体对照进行比较。muc16序列的最接近的114个 氨基酸(muc16
c114
)或近端344个氨基酸(muc16
c344
)的表达对于任何转染细 胞系的体外生长速率相对于亲本细胞系图2a的表达而言没有显著影响。然 而，muc16蛋白相同元件的表达在软琼脂克隆中显著改变了3t3的贴壁依 赖性生长。与仅载体对照相比，最小c114片段和c344片段都显著增加了软 琼脂菌落的数量(图3a)。与用phrgfp载体对照转染的3t3细胞相比， muc16蛋白表达的近端部分还增强了经典基质胶侵袭测定中的muc16+ 3t3细胞迁移(p《0.0001)(图3b)。在检测表达各种muc16蛋白片段的3t3 细胞表达所选择的转移和侵袭基因转录物时，存在多种侵袭基因上调，包 括趋化因子配体12(cxcl12)、钙粘蛋白11(cdh11)和基质金属蛋白酶 mmp2和mmp9(图3c)。包括纤连蛋白(fn1)和神经纤维蛋白(nf2)在内的 其他转录物一直在减少。muc16可能以类似于muc1和muc4的作用的 方式通过规范信号通路起作用，因为muc16改变体内肿瘤生长并增加携带 muc16蛋白的细胞的侵袭性质。之前已经将相互作用的erk和akt途径 鉴定为卵巢癌和肿瘤细胞侵袭调节因子中的重要信号机制(参见下文第 6.1.5节所述的参考文献21和22)。如图3d所示，存在由pakt(s473)和perk (t202/y204)的增加证明的两种途径的活化。
[0668]
致癌转化的最明确的标志是促进免疫缺陷小鼠生长的能力。为了测量 muc16对肿瘤生长速度的影响，采用侧腹部肿瘤模型来促进常规肿瘤测 量。如图3e所示，当将表达muc16的3t3细胞系(载体phrgfp、 muc16
c114-gfp和muc16
c344-gfp)植入无胸腺裸鼠的侧腹时，与仅载体对 照相比，muc16
c114-gfp和muc16
c344-gfp都在4周时形成更大的肿瘤。 表达muc16
c114-gfp和muc16
c344-gfp蛋白的细胞系(图3e)之间没有统计 学差异，表明muc16表达的致癌作用与分子的最近端部分相关。在肿瘤的 整个生长期间都观察到该肿瘤生长速度的增加，并且与高水平的muc16 表达(作为血清ca125)和较差的存活率之间的临床联系一致(参见下文第 6.1.5节所述的参考文献18)。
[0669]
6.1.3.2 a2780人卵巢癌细胞
[0670]
虽然3t3细胞中muc16蛋白的表达与转化的标志明显相关，但是当培 养时，一些完全转化的卵巢癌细胞系缺乏muc16表达。为了探索muc16 对人卵巢癌细胞行为的贡献，用muc16
c114-gfp或muc16
c344-gfp转染 a2780细胞(不表达muc16的人卵巢癌细胞系)。通过g418选择表达 muc16的细胞，并进行facs用于muc16和gfp表达。由于这些细胞在 没有muc16表达的情况下在软琼脂中生长良好，因此分析了muc16
c344
和muc16
c114
对基质胶侵袭的影响。如图4a所示，muc16
c344
和 muc16
c114
表达明显促进了a2780细胞中的基质胶侵袭。同样，muc16
c344
和muc16
c114
对erk和akt途径的激活的作用与3t3细胞中的相似，增 加pakt(s473)和perk(t202/y204)的基础水平(图4b)。因此，即使在恶性 卵巢细胞系中，muc16羧基末端元件的表达增加也与增加的侵袭和癌基因 激活有关。此外，分析了muc16
c114
和muc16
c344
转染的a2780系的体内 肿瘤生长(图4c)。在两种背景下，muc16
c114
细胞系和muc16
c344
细胞系 比仅载体对照生长更快。在这种人癌症模型中，载体对照确实以足够的速 度生长，最终杀死动物。
[0671]
6.1.3.3糖基化研究
[0672]
为了确定负责转化的muc16
c114
的特定部分，构建了两个另外的 muc16片段：(1)muc16
c80
，其中缺失了来自muc16
c114
的胞外域的34个 氨基酸序列(如原始出版中编号的1798至1831位)(图1d；seq id no： 135)(参见下文第6.1.5节所述的参考文献5)；(2)muc16
c86
，其中muc16
c114
构建体保留了muc16的整个胞外域，但从细胞质域的推定的ezrin域，潜 在的酪氨酸磷酸化位点和sh2域(位点1857到1884)去除了28个氨基酸的 序列(图1d；seq id no：134)。将这些构建体引入3t3细胞中，并通过 facs选择剩余的muc16
c80
和muc
c86
序列的细胞表面表达。然后检查这 两个额外的细胞群体muc16
c80
和muc
c86
的依赖性变化。muc16
c86
构建体 (具有完整的胞外域的构建体)与muc16
c80
构建体(具有完整的胞质域的构 建体)(图5a)相比，保留了更大的软琼脂集落形成能力。基质胶侵袭的能力 也是如此(图5b)。表达muc16
c80
的3t3细胞具有与phrgfp载体对照组无 统计学差异的侵袭率。相比之下，表达muc16
c86
的3t3细胞保留了更为侵 袭性的表型，与完整的muc16
c114
和muc16
c344
细胞相似。当检测akt和 erk途径的激活时，结果与软琼脂菌落和基质胶侵袭研究一致(图5c)。 muc16
c80
片段(没有全部的完整胞外域)的表达没有激活erk和akt，与 phrgfp载体对照相似；相比之下，表达muc16
c86
(具有完整的胞外域)的3t3 细胞与表达完整muc16
c114
的3t3细胞在激活erk和akt方面相似。最 后，在异种移植肿瘤模型中证实了完整胞外域的重要性。
[0673]
与muc16
c114
对照相比，完整muc16胞外域的丧失(3t3 muc16
c80
)导 致muc16
c114
依赖性3t3生长增强的丧失，而表达muc16
c86
的3t3细胞具 有适度的生长延迟，但与表达muc16
c114
的3t3细胞具有相似的总效果(图 5d)。因此，muc16
c114
片段的细胞外部分负责muc16在3t3细胞中的转 化效应。为了进一步研究muc16
c114
胞外片段的作用，使用一组muc16靶 向抗体用表达muc16
c114
的3t3细胞进行共沉淀研究(参见下文第6.1.5节所 述的参考文献14)。通过银染法鉴定没有共同沉淀的单条带，egfr、整合 素和her3的特异性western印迹为阴性。然而，muc16
c114
序列的分析表 明，胞外域中的三个潜在的n-糖基化位点(asn1777、asn1800和asn1806(图 6，seq id no：132和seq id no：133))可能起作用。分析了这些n-糖基 化位点的作用。使用位点特异性点突变，将所有三个天冬酰胺改为丙氨酸。 将该修饰的muc16
c114
构建体(命名为muc16
c114-n123
)导入3t3细胞，通过 facs和4h11胞外域抗体分离表达muc16
c114-n123
的细胞。如图7a所示， 这些天冬酰胺向丙氨酸的突变完全
消除了对3t3细胞中亲本muc16
c114
表 达载体观察到的muc16
c114
诱导的基质胶侵袭增强。为了证实n-糖基化的 作用，用糖基化抑制剂衣霉素(0.1μg/ml)处理3t3细胞，并注意到基质胶 侵袭的显著降低。还测试了两种合成蛋白抑制剂，以进一步探索muc16
c114
胞外序列的作用。将muc16外部序列(如下文第6.1.5节所述的参考文献5 中所编号的位点1777至1834)连接到人fc骨架pfuse(muc16
c57-c114 pfuse) 上以提供“虚拟”受体。将该构建体与muc16
c114
侵袭和pfuse载体对照进 行比较。如图7b所示，“虚拟”受体构建体降低了muc16
c114
表达载体对基 质胶侵袭的总体作用(图7)。推测凝集素与糖基化的muc16
c114
蛋白的作用 相关，将lgals3的糖结合域(氨基酸117至244；图7和图8)(参见6.1.5 节引用的参考文献23)连接到相同pfuse骨架(
117-244
lgals3pfuse)构建了 第二抑制剂。与衣霉素相同，这两种蛋白质抑制剂都会干扰muc16
c114
与 其他细胞表面蛋白质的相互作用，而单独的pfuse载体没有作用(图7b)。 与其他干预相同，当去除n-糖基化位点时，对pakt表达和perk的作用 减少，其平行于基质胶侵袭的丧失，如图7c所示。然而，muc16
c114-n123
构建体具有高水平的muc16
c114-n123
蛋白的表达，如4h11(muc16胞外域 特异性)结合所证明的。在nu/nu小鼠中转染的3t3细胞的生长减少同样证 实了n-糖基化损失的影响，如图7d所示。
[0674]
6.1.3.4转基因小鼠
[0675]
研究了羧基末端muc16元件在转基因小鼠中表达的作用和自发肿瘤 形成速率。产生了表达muc16
c354
(完整的c114序列和最近的携带ca125 的串联重复)的条件转基因小鼠。使用cmv早期增强子加鸡β肌动蛋白启 动子(cag)来强制所有鼠组织中的大量muc16
c354
表达。选择这种策略是因 为人类卵巢的生理学与鼠生殖系统非常不同，组织特异性卵巢启动子在转 基因系统中一直很弱，相对难于使用。这些小鼠的策略如图9a所示。
[0676]
通过southern印迹法选择条件转基因动物，如图9b所示，并与eiia-cre 小鼠交叉产生muc16
c354
转基因建立者(founder)。如图9c所示，选择了两 个建立者，并产生了muc16
c354
转基因小鼠的集落(colony)。两个建立者在 许多器官中高度表达muc16
c354
，例如脑，结肠，心脏，肾脏，肝脏，肺， 卵巢和脾脏。这些小鼠对muc16
c354
的广泛异位表达没有影响，具有正常 雄性:雌性后代比例，正常生育率和表观正常寿命，超过2年。对来自对照 群体的两只表观健康的动物(一只雄性和一只雌性)和muc16
c354
转基因小 鼠在3个月间隔至1年进行尸检仅在较老的雌性小鼠的轻度/中度子宫内膜 增生中显著，但发病率和严重程度与野生型对照无显著性差异。选定的组 织如图10所示。在超过100只动物观察2年或以上的集落中，仅观察到一 个自发的软组织肿瘤(肉瘤)。
[0677]
基于该结果，我们猜测潜在地需要“第二次命中(second hit)”。值得注意 的是，brca1突变的鼠模型也需要第二次命中，p53的缺失显著增加了肿 瘤的发生频率。将muc16
c354
小鼠与the jackson laboratory的p53+/-小鼠 杂交。早期效果有限。然而，大约6个月后，具有p53+/-的muc16
c354
小鼠 以比正常对照动物高的速度开始发展软组织和淋巴瘤的自发性肉瘤样肿 瘤。选定的肿瘤显示在图9d的面板插图中。这些小鼠的kaplan-meier存活 率示于图9e。muc16
c354
：p53+/-小鼠由于自发性肿瘤发展而显示出显著差 的总生存期(p《0.014)。每组观察到的肿瘤总数为：p53+/-小鼠，20/107只 小鼠；muc16
c354
和p53+/-小鼠，34/91只小鼠；muc16
c354
小鼠，1/72只小 鼠；野生型小鼠，0/91只小鼠。当检测8个收集的肿瘤的p53基因组测序 时，所有自发性肿瘤均缺失了p53正常等位基因，表明muc16依赖性肿瘤 发生也需要丧失正常的p53功能。
[0678]
6.1.3.5卵巢tcga
[0679]
基于在实验模型中的muc16片段的转化和肿瘤侵袭性，检查了 muc16的遗传改变与卵巢癌的结果之间的联系。tcga卵巢癌项目是一项 经过充分研究的收集，包含316例浆液性卵巢癌，具有完整数据，包括临 床结果数据。由于muc16蛋白表达是癌症行为的重要推动因素，分析了muc16拷贝数对muc16 mrna表达的影响。muc16转录本表达通常与 muc16基因拷贝数相关，尽管在所有检查组中muc16转录本表达存在广 泛的变化(当然，muc16的稀有纯合缺失除外)。在大多数情况下，muc16 mrna表达聚集在比包括作为对照的正常输卵管样品更高的转录本数量。 基因拷贝数是可能改变muc16蛋白表达的几个变量之一，但很明显，浆液 性卵巢癌中muc16 mrna表达(当然也是muc16蛋白)通常增加。还研究 了muc16过表达或突变对tcga数据集中临床结果的综合影响。当tcga 数据集分为muc16表达五分位数时，20％的muc16表达最高的患者的生 存期明显低于muc16表达较低的患者(p＝0.02969)。如图11a所示，当 muc16突变的18例患者被包括在高muc16表达组(p＝0.02117)时，这一 关系进一步加强。总之，这一分析表明muc16表达对卵巢癌患者的生存有 不利影响，并证实了我们临床前模型中鉴定的muc16表达的负面生物学效 应。
[0680]
卵巢癌常常表现出pi3k途径的激活。这些激活主要通过扩增和过表达 而不是点突变事件发生，因为卵巢癌通常以拷贝数的改变为特征。基于 pi3k/akt通路在我们的细胞系模型中的激活，检测了muc16与pi3k通 路中其他激活基因改变的关系。如图11b所示，与muc16相关的过表达 和突变事件通常与其他途径事件互补(如pten缺失，akt1、akt2或 pi3kca的扩增)。这种muc16驱动的akt激活的机制仍然是未知的。此 外，检查了erk激活的作用，但没有确定muc16表达和erk通路突变之 间的联系。
[0681]
6.1.4讨论
[0682]
编码ca125抗原的muc16在许多卵巢癌患者的血浆中循环(参见下文 第6.1.5节所述的参考文献1)。muc16因其在苗勒组织之外的有限表达在 拴粘蛋白中是独一无二的(参见下文第6.1.5节中所述的参考文献2和14)。 虽然越来越多地被视为不依赖于肿瘤体积的不利预后因素，但是其负面影 响的生物学机制尚未得到充分的了解(参见下文第6.1.5节所述的参考文献 18)。该分子的nh2部分含有编码ca125抗原的多个串联重复，并且似乎 用作间皮素和某些半乳糖凝集素的重要粘附伴侣(图1a)(参见如下文第 6.1.5节所述参考文献5、17和24-26)。虽然这些粘附功能已经被认为在 muc16相关的不良结局中至关重要，但是这些研究并没有解释卵巢癌细胞 行为的所有观察到的变化。muc16糖蛋白的克隆提供了关于muc16基因 产物的基本结构信息(参见下文第6.1.5节所述的参考文献4和5)。在该实 施例中呈现的数据是第一份数据，显示muc16可以介导从环境进入癌细胞 的信号传导，特别的，本实施例中呈现的数据表明糖基化的muc16胞外域 对于muc16癌细胞行为的改变至关重要。
[0683]
该实施例证明，来自muc16的羧基末端的114个氨基酸足以转化 nih/3t3(3t3)细胞，支持增加的软琼脂生长和增加的基质胶侵袭。虽然其 他人已经将muc16的膜最近端c末端部分确定为muc16诱导的行为的关 键因素，但是我们将这些行为与保留的muc16胞外域中的n-糖基化位点 相关联。这些变化与mmp2、mmp9、cxcl12和cdh11等关键的侵袭基 因的改变的基因表达谱和增加的表达有关。虽然较长的元件可以诱导更强 的行为，但是即使靠近推定切割位点的残留114个氨基酸在3t3细胞中足 以诱导侵袭基因表达的相同变化。此
外，muc16
c114
的asn30(对应于成熟muc16(seqidno：150)的asn1806)的糖基化对于muc16
c114
致癌性质是必需的，不受任何特定理论的束缚，这些发现与通过蛋白最近端部分(包括跟随跨膜域和胞质尾区的残余胞外区域(extracellulardomain))的“外向内”信号转导最相符。不同于theriault(therialt等，gynecoloncol2011，121(3):434-443)和giannakouros(giannakouros等，int.j.oncol.2015，41(1):91-98)，细胞内胞质域缺失比糖基化胞外域缺失的影响小，这些差异可能反映出选择的具体突变和方法学减少表达。“内向外”信号似乎激活了在软琼脂和裸鼠中促进表达muc16的细胞的植入和生长的基因程序的转录。当检测转染的细胞对常见的致瘤途径的激活时，akt和erk通路似乎都被muc16的组成型表达激活。muc16增加akt/erk磷酸化的机制尚不清楚，需要进一步研究。共沉淀受体的缺失表明也可能涉及其他机制。虽然muc16序列是非常不同的，但是其他拴粘蛋白(包括muc1和muc4)已被证明在3t3细胞和大鼠成纤维细胞中起到信号-产生癌基因的作用(参见下文第6.1.5节所述的参考文献8和9)。粘蛋白对癌细胞表面的作用可能通过仍待定义的机制起重要作用。
[0684]
基于3t3细胞中的发现，muc16转基因小鼠实验的结果是高度支持性的。本身，相同的muc16近端354序列可以容易地在几乎所有的鼠组织中表达，在转基因小鼠中没有不利影响。这些小鼠自发性肿瘤形成率非常低，生殖功能似乎没有受到影响。然而，像其他鼠卵巢癌模型一样，p53功能的丧失似乎在muc16依赖性肿瘤形成中起着很强的许可性作用(参见下文第6.1.5节所述的参考文献27)。这些结果当然与均一的p53失活一致，其表征tcga数据集中的卵巢癌。
[0685]
这些发现描述了细胞行为和基因转录中的muc16相关变化。体外和体内模型与浆液性卵巢癌muc16表达水平的不良反应一致，促进了对于muc16作为卵巢癌行为的致病因子的理解。增加ca125表达的不利影响与muc16(+)3t3转染子的增加的体内肿瘤生长和致死率一致(参见下文第6.1.5节所述的参考文献18)。
[0686]
6.1.5实施例1引用的参考文献
[0687]
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[0719]
6.2实施例2：muc16糖基化抗体
[0720]
6.2.1介绍
[0721]
被oc125抗体识别的ca125抗原(参见下文第6.2.5节所述的参考文献1)是在来自muc16糖蛋白的胞外部分的串联重复结构域中表达的重度糖基化抗原(参见参考文献2和3，如下文第6.2.5节所述)。这种循环抗原主要来源于良性或恶性苗勒组织，并被fda批准作为人类卵巢癌的肿瘤标志物，但其在致癌过程中的功能和作用尚不清楚(参见如下第6.2.5节所述的参考文献4-6)。muc16属于复杂的拴粘蛋白家族，其由大的重度糖基化的胞外区域、膜与推测的切割位点之间的小的胞外域、疏水性跨膜域和胞内短尾组成(见图1)(参见如下文第6.2.5节所述参考文献7和8)。大多数muc16蛋白在切割后释放到周围空间，胞外域保留在细胞表面。oc125和大多数其他muc16反应性单克隆抗体(mab)与仅存在于分子切割部分的串联重复 区中的抗原反应。由于这些表位可能在循环中发现，所以现有的
mab不能 用于追踪剩余的muc16蛋白片段的命运，并且可能不能准确地反映 muc16表达的真实分布(参见下文第6.2.5节中所述的参考文献9)。其他人 已经显示，糖基化表面蛋白质可以通过基于半乳糖凝集素3与酪氨酸激酶 受体(如egfr，pdgfr等)的n-糖基化位点的相互作用来调节细胞增殖和 分化(ks lau cell 129：123，2007)。如实施例1(参见第6.1节)所示，muc16 的近端部分(少至114个氨基酸)可以转化永生化的3t3细胞，并且这种作用 看起来被衣霉素消除。
[0722]
本实施例显示了介导这些作用的精确糖基化位点和半乳糖凝集素3在 muc16依赖性转化中的强制作用。因此，开发了能够以糖基化特异性方式 结合近端肽序列(例如，muc16
c114
)的抗体以抑制关键的muc16介导的癌 症功能，例如粘附和侵袭。通过使用定义的合成n-糖肽抗原作为关键表位 模拟物，产生了针对muc16胞外域内关键n-糖基化位点的单克隆抗体。 这些抗体通过降低muc16驱动的基质胶侵袭、癌基因激活和肿瘤生长来抑 制muc16的致癌生物学，这与其他非糖基化蛋白质导向的mab相反，后 者没有效果。这些抗体证明了粘蛋白转化的机制，并为muc16阳性肿瘤的 诊断和治疗应用提供了有用的工具。
[0723]
6.2.2材料和方法
[0724]
6.2.2.1糖肽的合成
[0725]
使用合成的糖肽作为关键表位模拟物产生了针对muc16的55个氨基 酸序列(muc16
c55
： nfsplarrvdrvaiyeeflrmtrngtqlqnftldrssvlvdgyspnrnepltgns(seq id no:129)的第三糖基化位点(asn30，类似于muc16的 asn1806)的特异性抗体，所述模拟物在muc16
c55
(seq id no:129，图13) 的asn30上引入定义明确的壳二糖(glcnac2)。均质的n-糖肽的合成是高度 收敛的，涉及部分保护的全长肽(muc16
c55
、seq id no:129)与壳二糖胺在 lansbury天冬氨酰化条件下的偶联(参见下文第6.2.5节所述的参考文献 11)。muc16
c55
(seq id no:129)获得自微波辅助的fmoc固相肽合成 (spps)，然后进行树脂上n-乙酰化(ac2o，diea)，asp
30
(pd(pph3)4，phsih3) 去烯丙基化(deallyation)和随后的树脂裂解(1-2％tfa/ch2cl2)。使用单烧瓶 (one-flask)天冬氨酰化/去保护流程(如下文第6.2.5节引用的参考文献12所 述)，将asn30位置的游离羧酸侧链与壳二糖胺偶联(如下文第6.2.5节引用 的参考文献13所述)，随后用tfa处理(混合物r：90％tfa，5％硫代苯甲 醚，3％乙二硫醇，2％茴香醚)，以提供糖肽glcnac
2-55-mer。伪脯氨酸基 序的存在有助于减轻天冬氨酰化期间不希望的天冬酰胺酰亚胺形成。
[0726]
此外，含有man3glcnac2的肽以类似的单烧瓶顺序制备。
[0727]
制备了包含muc16
c55
(seq id no：129)的asn30和asn24(分别类似于 muc16的asn1800和asn1806)的较短的糖肽(1)18-mer： ctrngtqlqnftldrssv(seq id no：130)和(2)15-mer： cgtqlqnftldrssv(seq id no：131)。将18-mer和15-mer糖肽与血红 素血蓝蛋白(klh)缀合。15-mer(seq id no：131)在asn7(类似于muc16 的asn1806)引入壳二糖。以类似于55-mer糖肽合成的方式合成了15-mer 糖肽。
[0728]
18-mer(seq id no：130)在asn4和asn10(分别类似于muc16的 asn1800和asn1806)引入壳二糖。18-mer的asn4和asn10(类似于muc16 的asn1800和asn1806)的烯丙基保护导致显著的天冬酰胺酰亚胺形成。因 此，在spps中使用较受阻碍的o-2-苯基异丙基酯(o-2-phipr，opp)以在n
‑ꢀ
乙酰化和同时进行的树脂切割/opp去除(1-2％tfa/ch2cl2)后提供具有 18-mer的游离asn4和asn10侧链(分别类似于muc16的asn1800和 asn1806)的部
1998；4(7)：8447)，随后通过hedvat等人修饰(参 见hedvat cv等人hum pathol 2002；33(10)：968-74)。使用来自beecherinstruments inc.(sun prairie，wi)的手动组织阵列mta-1用于产生直径为0.6 至1.0mm的样品圆形斑点(芯)。芯彼此间隔0.3至0.4毫米进行排列。策略 性地将一层对照组织置于实际组织微阵列周围，以避免边界效应。下面描 述了每种组织微阵列的具体组成。通过从福尔马林固定的石蜡包埋组织切 割4um切片来制备用于卵巢癌或对照组织的组织微阵列的玻片。
[0740]
在组织微阵列标准oc125(ventana，tuscon，az)、4h11(参见rao 等appl.immunohistochem mol morphol，2010，18(5):462-72)和19c11单克 隆抗体上进行免疫组织化学。将组织微阵列的切片切成4微米，置于 superfrost/plus显微镜载玻片(fisher品牌)上，并在60
°
烘箱中烘烤至少60 分钟。然后将载玻片脱蜡并水合至蒸馏水，在ph 6.00的柠檬酸盐缓冲液中 于97℃浸泡30分钟，在流水中洗涤2-5分钟，在蒸馏水中稀释的3％过氧 化氢中孵育5分钟。将载玻片在蒸馏水中洗涤1分钟，转移到ph7.2的磷 酸盐缓冲盐水(pbs)浴中，进行两次变化，每次5分钟，并置于用pbs稀释 的0.05％bsa中至少1分钟。在围绕组织切片干燥后，以1:20稀释度在2％ bsa/pbs中施用正常血清，并在室温下在湿度室中孵育至少10分钟。然后 吸出血清，而不允许切片干燥，将约150λ的新抗体以1:1000稀释度置于 组织上。将载玻片在4℃在湿度室中孵育过夜(约15-18小时)。使用三个变 化的pbs洗涤一抗，每次10分钟。在1％bsa/pbs中以1:500的稀释度施 用来自vector实验室(burlingame，ca)的二抗，生物素化的α小鼠，并在室 温下在湿度室中温育45-60分钟。如上所述再次使用三个变化的pbs洗脱 抗体。然后将玻片转移到二氨基联苯胺(dab)浴中，在pbs中稀释5-15分 钟。然后将玻片在自来水中洗涤1分钟，使用harris修饰的苏木精(fisher) 对染色，用1％酸性醇和氨水中的蓝(blue)脱色，用95％乙醇，100％乙醇和 二甲苯的3个变化各脱水2分钟，盖上永久封固剂。
[0741]
6.2.2.7内化分析
[0742]
在表达muc16
c114
的skov3细胞上研究
89
zr-19c11的内化。将大约 1
×
105个细胞接种在12孔板中，并在37℃ 5％co2培养箱中温育过夜。将 一体积的放射性标记蛋白加入各孔中，将板在37℃和4℃下孵育1、5、12 和24小时。在每个孵育期后，收集培养基，并用1ml磷酸盐缓冲盐水(pbs) 冲洗细胞。通过在4℃下用含100mm甘氨酸(1:1，ph3.5)的1ml的100mm 乙酸中洗涤细胞来收集表面结合的活性。然后将粘附的细胞用1ml的1mnaoh裂解。收集每次洗涤并计数活性。使用最终洗涤的活性与所有洗涤物 的总活性的比率来确定内化的百分比。
[0743]
6.2.3结果
[0744]
6.2.3.1 muc16病理生物学依赖于muc16胞外域c端的n
‑ꢀ
糖基化。
[0745]
实施例1(参见第6.1节)表明muc16
c114
的表达导致3t3小鼠成纤维细 胞的体外/体内行为更具侵袭性，导致muc16
c114
驱动的基质胶侵袭显著增 加，并且更迅速的体内肿瘤生长。因此，检测了skov-3细胞系(muc16 表达缺失的人类卵巢细胞系)的muc16
c114
依赖性质的影响。muc16
c114
表 达导致细胞表面表达，并且基质胶侵袭增加近3倍(图12a的泳道1和2)。 侵袭的这种增加取决于muc16
c114
的氨基酸位点1(asn1)、24(asn24)和 30(asn 30)(分别对应成熟muc16(seq id no：150)的asn1777、asn1800 和asn1806；muc16
c114-n123
)的天冬酰胺的n-糖基化，因为asn30突变为丙 氨酸(muc16
c114-n3
，图12a，泳道3)，asn1和asn24突变
为丙氨酸 (muc16
c114-n12
，图12a，泳道4)和asn1、asn24和asn30突变为丙氨酸 (muc16
c114-n123
，图12a，泳道4)，去除了基质胶侵袭。还参见图12b。此 外，muc16
c114
诱导的增加的基质胶侵袭依赖于mgat5(涉及n-糖基化反 应的第一个酶)和/或lgals3(在许多高级浆液性癌症中扩增的酶)，因为降 低的mgat5或lgals3表达的敲低shrna实验具有与n-糖基化位点处 的muc16
c114
突变相似的作用，并且将侵袭降低到接近基础水平(图12a， 泳道6-10)。
[0746]
致癌转化的最明确的标志是促进免疫缺陷小鼠生长的能力。为了测量 muc16 n-糖基化、mgat5和lgals2对肿瘤生长速度的影响，采用了侧 腹部肿瘤模型来便于常规肿瘤测量。如图12c所示，当将表达载体(phrgfp)、 muc16
c114
、muc16
c114-n123
、muc16
c114
和抗mgat5shrna(muc16
c114-shmgat5)或muc16
c114
和抗lgals3shrna(muc16
c114-shlgals3)的3t3细胞系植入到无胸腺裸鼠侧腹时，与 仅载体对照组相比，只有muc16
c114 3t3细胞在24天形成较大的肿瘤。这 些数据证实了体外分析，表明muc16 n-糖基化、mgat5和lgals3是肿 瘤生长所必需的。
[0747]
6.2.3.2作为mab开发的关键表位模拟物的均匀n-糖肽的合成
[0748]
由于muc16
c114
的asn30位点(对应于成熟muc16(seq id no：150) 的asn 1806；muc16
c114-n3
))的n-糖基化被确定为muc16致癌作用的中心 要求，因此进行了skov3细胞中表达的muc16
c114-n12
的聚糖谱分析，因 为muc16
c114-n12
保留在asn30(对应于成熟muc16(seq id no：150)的asn1806)被n-糖基化的能力。该糖组分析显示该c末端muc16片段具有高度 多样化的n-糖基化模式，其中关键的壳二糖(glcnac2)干作为附着各种甘露 糖部分的最小重复单元(图13a)。
[0749]
因此，产生糖基化导向的mab以努力抑制muc16对转移和侵袭的糖 基化依赖性作用。将这些抗体设计成靶向在muc16胞外域(muc16
c55
；seqid no：129)中较短的55个氨基酸序列上含有至关重要的第三糖基化位点 (muc16
c114
的asn30)的n-糖肽表位。关于用作免疫原的糖肽的合成的描述 参见第6.2.2.1节和图13b，13c，13d。有关免疫过程的描述参见第6.2.2.2 节。
[0750]
使用在对应于muc16
c114
的asn24和/或asn30的氨基酸残基(分别对应 成熟muc16(seq id no:150)的asn1800和asn1806)处包含壳二糖的短 (55-mer，18-mer和15-mer)muc16糖肽通过免疫产生抗体。除了作为较大 n聚糖共有的最小基序之外，壳二糖还可以使潜在的muc16衍生肽更好地 暴露以诱导抗体，所述抗体不仅显示出对聚糖的依赖性，而且还显示肽特 异性。与正常细胞相比，这种低糖基化是肿瘤细胞表面粘糖蛋白的一个常 见的区别性特征。
[0751]
6.2.3.3用合成糖肽/糖缀合物进行小鼠免疫接种及血清学分析
[0752]
根据6.2.2.2节中描述的方案进行小鼠免疫接种和血清采集。在用 glcnac
2-55-mer进行三次免疫后(图13b)，用klh缀合的构建体的混合物 (单糖基化的15-mer(seq id no：131；图13c)和双糖基化的18-mer(seq idno：130；图13d))进一步免疫小鼠，10只小鼠中的2只显示了针对两种 55-mer(具有和不具有glcnac2)的阳性elisa信号，但是反应通常较弱，表 明小鼠未完全被55-mer免疫接种致敏。使用klh缀合物(glcnac
2-15-mer (图13c)；和(glcnac2)
2-18-mer(图13d))进行两次额外免疫，导致针对较 短的15-mer和18-mer糖肽的igg免疫应答增强，特别是在两只老鼠(小鼠 7和小鼠8)中。然而，通过elisa测定，这些抗体没有显示与55-mer-glyco
‑ꢀ
肽的任何可检测的反应性，这表明在该特定分析中，该
433细胞)；(ii)缺失muc16表达，表达对照载体(skov3phrgfp细胞)的skov3细胞；(iii)表达muc16
c114
的skov3细胞(skov3muc16
c114
)；(iv)表达muc16
c114-n1
的skov3细胞(skov3 muc16
c114-n1
)，(v)表达muc16
c114-n3
的skov3细胞(skov3 muc16
c114-n3
)，或(vi)在存在 或不存在muc16糖基化抗体(18c6、19c11、10c、1b5或13a7)或单克隆 抗muc16抗体4h11(表10)的情况下表达skov3 muc16
c114-n123
的skov3 细胞(skov3 muc16
c114-n123
)进行fac分析。抗体4h11、18c6、19c11、 10c6、1b5和13a7显示与ovca-433细胞的结合(表10；比较id no：3-8 和阴性对照，id no：1和2)。相比之下，如基于研究的设计和抗体的产生 所预期的，抗体4h11、18c6、19c11、10c6、1b5和13a7均未结合skov3phrgfp细胞(表10，id no：11-16，与阴性对照id no：9和10相比)。抗 体4h11，18c6，19c11，10c6，1b5和13a7结合skov3 muc16
c114
(表 10，id no：19-24，与阴性对照id no：17和18相比)。muc16
c114
的asn1(对 应于成熟muc16(seq id no：150)的asn1777)的突变不抑制抗体与skov3 muc16
c114-n1
细胞的结合(表10，id no：27-32，与阴性对照id no：25 和26相比)。然而，muc16
c114
的asn30(对应于成熟muc16(seq id no： 150)的asn1806)的突变消除muc16糖基化抗体18c6，19c11，10c6，1b5 和13a7的结合(表10，id no：36-40，与阴性对照id no：33和34相比)。 此外，muc16
c114
(对应于成熟muc16(seq id no：150)的asn1806)的asn30 的突变没有消除抗体4h11的结合，后者不是muc16糖基化抗体(表10， id no：35，与阴性对照id nos：33和34相比)。此外，asn1、asn24和 asn30(分别对应于成熟muc16(seq id no：150)的asn1777、asn1800和 asn1806)上的天冬酰胺至丙氨酸突变消除了muc16糖基化抗体18c6， 19c11，10c6和1b5的结合(表10、id nos：44-47，与阴性对照id nos： 41和42相比)，而4h11的结合没有被消除。注意，13a7维持与skov3muc16
c114-n123
细胞的结合。这些数据表明muc16糖基化抗体以糖基化依 赖的方式结合muc16
c114
。
[0762]
表10.用ovca-433或skov3转染细胞进行muc16糖基化抗体的 fac分析
[0763]
[0764]
[0765][0766]
*表示没有观察到结合。
[0767]
6.2.3.6 muc16糖基化抗体抑制基质胶侵袭。
[0768]
鉴于muc16糖基化抗体的糖基化特异性(表9)，评估了muc16糖基 化抗体生物反应性上清液以糖基化特异性方式抑制基质胶侵袭的能力。因 此，在存在(图15a，泳道3-18)或不存在(图15a，泳道1和2)muc16糖基 化抗体生物反应性上清液的情况下，用表达phrgfp(图15a，泳道1)或 phr-gfp-muc16
c114
(muc16
c114
；图15a，泳道2-18)的skov3卵巢癌稳定 细胞系进行基质胶侵袭测定。muc16单克隆抗体4h11(图15a，泳道3)被 用作muc16糖基化抗体生物活性上清液的对照(图15a，泳道4-18)，以评 估基质胶侵袭中的糖基化依赖性。单独存在或在4h11存在下(图15a，泳 道2和3)muc16
c114
的表达导致基质胶侵袭活性的增加。相比之下，与 muc16糖基化抗体(图15a，泳道4-18)的温育降低了表达muc16
c114
的卵 巢癌细胞的基质胶侵袭。
[0769]
接下来，评估了纯化的muc16糖基化抗体抑制基质胶侵袭的能力。为 此，将表达muc16
c114
的skov3细胞在存在和不存在muc16抗体4h11 或纯化的muc16糖基化抗体(图15b)下孵育。muc16糖基化抗体7b12、 19c11、18c6和10c6抑制muc16
c114
诱导的基质胶侵袭(图15b，比较泳 道3-6和阴性对照，泳道2)。相比之下，单克隆抗muc16抗体4h11不抑 制muc16
c114
诱导的基质胶侵袭(图15b，比较泳道2和阴性对照，泳道1)。 这些数据表明，与单克隆抗体4h11相反，muc16糖基化抗体(例如7b12、 19c11、18c6和10c6)阻断基质胶侵袭。
[0770]
在muc16
c114 n-糖基化突变体的背景中测定了muc16糖基化抗体抑 制基质胶侵袭的能力(图16a)。为此，对skov3 phrgfp细胞， skov3muc16
c114
细胞，skov3muc16
c114-n1
细胞，skov3 muc16
c114-n2
细胞或skov3 muc16
c114-n3
细胞(图16a，分别为泳道1-5)进行基质胶侵袭 测定，其中存在：(i)对照抗体；(ii)4h11抗体；或(iii)muc16糖基化抗体 10c6。muc16
c114
诱导的基质胶侵袭在skov3 muc16
c114-n3
细胞中被抑制， 因为muc16
c114
的asn30对muc16
c114
基质胶侵袭是必需的。此外，在存 在和不存在muc16单克隆抗体4h11的情况下，在skov3 muc16
c114
细 胞，skov3 muc16
c114-n1
细胞和skov3 muc16
c114-n2
细胞中诱导基质胶侵 袭。相比之下，这些细胞与muc16糖基化抗体10c6的温育消除了基质胶 侵袭(图16a)。这些数据也在图16b和表达muc16
c344
突变体的3t3细胞(图 16c)中得到证实。
[0771]
总之，这些数据表明，与单克隆抗muc16抗体4h11相反，muc16 糖基化抗体能够以糖基化依赖性方式抑制基质胶侵袭。
[0772]
6.2.3.7 muc16糖基化抗体19c11被内化。
[0773]
最后，评价了靶向muc16
c114
的asn30的muc16糖基化抗体被内化的 能力。将表达muc16
c114
的skov3细胞与
89
zr-dfo-标记的19c11抗体一 起孵育并通过放射性示踪剂测定内化(图17)。这些数据表明，早在用抗体 处理1小时后，当在37℃孵育下与表达muc16
c114
的skov3细胞一起孵 育时，标记的19c11抗体被内化。标记抗体的细胞摄取在4℃下降低。
[0774]
6.2.4讨论
[0775]
muc16/ca125抗原——与muc1具有实质同源性的粘蛋白家族成员 ——长期以来与妇科恶性肿瘤关联(参见下文第6.2.5节所述的参考文献4)。 尽管作为一般筛选工具没
有足够的敏感性或特异性，ca125测量经常用于通过基于抗体的检测方法监测卵巢癌患者。绝大多数的muc16反应性抗体，例如oc125，是针对分子切割部分中发现的糖基化依赖性表位，并且不能用作检测切割后的muc16的近端部分的筛选工具。因此，缺乏对剩余的muc16蛋白片段的生物学研究。实施例1(第6.1节)中的数据证明近端muc16区域的114个氨基酸序列(muc16
c114
)足以增加几个卵巢癌细胞系的侵袭和肿瘤生长。本文中惊人的发现，该c末端胞外域的n-糖基化，特别是在第三asn位点(asn30，对应于成熟muc16(seqidno：150)的asn1806))，对于muc16致癌作用至关重要，这表明muc16新的作用，其可以被认为不仅是疾病的被动标志物，而且还被认为是病原分子。基于这一前提，针对这些muc16保留部分的单克隆抗体的开发似乎是探索这种粘蛋白的病理生物学和创造muc16靶向治疗药物的有力工具。
[0776]
以前的研究确定了针对muc16的非切割的c-末端区域的mab，尽管与现有抗体相反，它们被引导至非糖基化肽骨架而不是复合糖蛋白表位。特别地，4h11表现出与muc16胞外域的高亲和力结合，并且由于表位的邻近位置而比oc125更有效地被卵巢癌细胞内化。该发现表明，糖蛋白的近端区域具有远离推测切割位点的muc16的脱落部分的独立生物学。然而，由于4h11不识别muc16致病作用所必需的胞外域内的关键糖基化位点，因此其在靶向治疗中未来研究的潜力是有限的。
[0777]
通过使用klh缀合的合成糖肽模拟物与杂交瘤技术结合，开发了针对muc16胞外域中关键糖肽表位的一组糖基化依赖性单克隆抗体。该方法优于多克隆抗体产生，因为在多克隆阶段，糖肽特异性不完全，并且还检测到与非糖基化muc16肽片段的一些结合。为了获得muc16糖基化抗体，单克隆抗体产生的主要选择是基于与糖存在的某种程度的偏好相关的多克隆培养物中糖基化依赖性的较高比例。已经通过研究它们对muc16驱动的基质胶侵袭的影响来证明新的单克隆抗体的功能及其对糖肽表位的更高的特异性。这些muc16糖基化抗体能够抑制基质胶体测定中的侵袭，而针对非糖基化的4h11则不能。基于发现在asn30n糖基化对于muc16作用是必需的，这些结果证实新产生的抗体特异性靶向muc16胞外域的关键糖肽表位，这导致muc16病理生物学的抑制。重要的是，muc16糖基化抗体10c6在植入表达muc16
c114
的卵巢癌细胞的无胸腺裸鼠模型中显著延迟muc16阳性肿瘤生长，证明这些单克隆抗体作为优化临床应用中有希望的治疗工具的潜力。
[0778]
6.2.5引用的参考文献
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[0797]
6.3实施例3：muc16的肿瘤促进作用需要与半乳糖凝集素-3和细胞表面受体的相互作用
[0798]
该实施例提供(a)实施例2(第6.2节)中描述的某些实验的更详细的描述；和(b)与实施例2(第6.2节)相比的另外的实验。
[0799]
6.3.1介绍
[0800]
muc16/ca125的过度表达在浆液性卵巢癌中是常见的，并且升高的血 清ca125水平与存活率降低相关。oc125抗体识别的ca125抗原是来自 muc16糖蛋白胞外部分的串联重复结构域内表达的重度糖基化抗原(参见 下文第6.3.13节中的参考文献3和22)。该抗原主要由良性或恶性的苗勒组 织表达，但其在癌发生中的功能和作用目前尚未完全了解(参见下文第 6.3.13节中的参考文献4)。muc16是一种高度复杂的拴粘蛋白，其由大的 非均匀糖基化胞外区域、细胞膜与推测切割位点之间的58个氨基酸的胞外 域、疏水性跨膜区和细胞内短尾组成(见下文第6.3.13节参考文献21)。 oc125和大多数其他muc16反应性单克隆抗体(mab)识别分子切割部分中 存在的免疫原性156个氨基酸串联重复区。更新的胞外域特异性抗体(例如 4h11和4a5)识别muc16的切割后保留部分中的肽表位(参见下文第6.3.13 节中的参考文献6)。已经证明muc16的c-末端部分(muc16
c114
)能够通过 转化永生化的3t3细胞，如通过增加的锚定非依赖生长、akt和erk途 径的激活、增加的基质胶侵袭和增强的裸鼠异种移植物的生长测量得到的 (参见第6.1节和下文第6.3.13节中的参考文献19)。这些效应依赖于muc16 的胞外域，而31个氨基酸的胞质尾巴的缺失对这些性质影响不大。胞外域 促进致癌行为的机制尚未完全了解(参见下文第6.3.13节中的参考文献19)。 虽然不存在共有的蛋白质结合结构域，但muc16胞外域的58个氨基酸序 列包括三个n-糖基化位点，其代表muc16与其它细胞表面分子的潜在相 互作用/调节位点。
[0801]
酪氨酸激酶受体如表皮生长因子受体(egfr)、血小板衍生生长因子受 体(pdgfr)及其它等的n-糖基化位点似乎与细胞凝集素如半乳糖凝集素-3 相互作用以调节表面驻留、信号强度和细胞行为(见下文第6.3.13节参考文 献12)。n-糖基化的影响取决于生长增强受体上n-糖基化位点的数量和半 乳糖凝集素-3对复合n-糖基化种类的亲和力。来自细胞表面分子如转化生 长因子-β(tgf-β)受体的反补体抑制信号的n-糖基化位点较少。这些受体对 生长因子相关的高营养通量敏感，并在正常情况下提供抑制功能。然而， 癌症相关糖蛋白与经典受体酪氨酸激酶相互作用的机制尚不清楚。muc1、 muc4和muc16都是重度糖基化的拴糖蛋白，其特征在于跨膜域的存在并 在上皮癌中过表达(参见下文第6.3.13节中的参考文献10)。
[0802]
该实施例(第6.3节)表明，muc16的糖基化通过介导复合细胞表面相 互作用在粘蛋白相关转化中起关键作用。
[0803]
muc16的c末端部分促进癌基因激活、基质胶侵袭和肿瘤生长。这些 作用依赖于保留58个氨基酸的muc16胞外域中两个近端n糖基化位点的 mgat5依赖性糖基化。更远端的muc16串联重复区域中的n-和o-糖基 化位点都不能在功能上替代这两个位点。muc16糖基化的模式是多种多样 的，但是壳二糖干表征了所有n-糖基化种类的基础。抗近端含壳二糖的 muc16糖肽的抗体阻断半乳糖凝集素3介导的与细胞表面信号受体的结合 并抑制muc16的肿瘤促进作用。
[0804]
使用了muc16糖肽的系统性改变以直接考察聚糖结构与muc16表达 所起肿瘤促进作用之间的关系。这些作用，包括共定位、癌基因激活、基 质胶原侵袭和肿瘤异种生物生长，都由半乳糖凝集素-3介导的muc16的保 留的、非循环的部分上的n-糖基化序列和细胞表面分子如表皮生长因子受 体(egfr)和整合素β1的结合所表现。细胞外的、粘蛋白驱动的肿瘤促进是 由本文提出的发现和数据所支持的机制，其可以被n-糖基化位点定向抗体 成
功靶向。
[0805]
如本实施例所示：(1)muc16的细胞外糖基化状态驱动卵巢浆液性癌症 行为；(2)侵袭和muc16+异种移植物生长取决于具体的muc16 n-糖基化 位点；(3)muc16与半乳糖凝集素-3和egfr或整合素β1形成异三聚体复 合物；和(4)抗糖基化位点抗体阻断胞外muc16对肿瘤的促进。
[0806]
6.3.2材料和方法
[0807]
6.3.2.1 muc16羧基末端(muc16
c114
)、muc16-ca125域 (muc16
c344
)和糖基化融合蛋白dna构建体的合成
[0808]
关于muc16 c-末端构建体的描述，参见第6.1.2和6.2.2节和下述第 6.3.13节中的参考文献19。pfuse-human igg1-fc2载体(pfuse)购自 invivogen(san diego，ca)，嵌合蛋白muc16
c57-114-pfuse和 117-244
lgals3-pfuse的构建也描述于6.1.2节和6.2.2节和下文第6.3.13节 中的参考文献19。
[0809]
6.3.2.2细胞培养，转染和细胞系表征
[0810]
如第6.1.2节和第6.2.2节和下文第6.3.13节的参考文献19所述获得和 维持skov3、caov3和ovcar3细胞系。详见6.3.6节。
[0811]
6.3.2.3糖肽的合成
[0812]
关于muc16糖肽合成的详细描述，参见第6.4节。
[0813]
6.3.2.4基质胶侵袭
[0814]
在基质胶侵袭室(bd biosciences，bedford，ma)中测定基底膜侵袭。 用5μg/ml衣霉素(sigma-aldrich，st.louis mo cat#t7765)或5μg/mlmuc16
c57-c114-pfuse或5μg/ml 117-244
lgals3-pfuse融合蛋白(5μg/ml) 处理稳定的细胞系；然后在一式三份的孔中测量48小时后的基质胶迁移， 并与phrgfp载体对照和muc16
c114
转染子进行比较。另见第6.1.2和6.2.2 节以及下文第6.3.13节中的参考文献19。
[0815]
6.3.2.5无胸腺裸鼠的肿瘤生长
[0816]
将转染的细胞系和适当的对照细胞系引入无胸腺雌性裸鼠的侧腹，并 由纪念斯隆凯特琳癌症中心抗肿瘤评估核心实验室提供常规的动物护理。 每周进行两次肿瘤测量，按照纪念斯隆凯特琳癌症中心研究动物资源中心 指南，肿瘤生长记录至最大尺寸为1,500mm3。另见第6.1.2和6.2.2节以及 下文第6.3.13节中的参考文献19。
[0817]
6.3.2.6单克隆抗体制备；小鼠免疫方案
[0818]
免疫方案开始于含壳二糖的55-mer muc16糖肽(glcnac
2-55-mer； seq id no：129)，其对5只balb/c和5只瑞士韦伯斯特小鼠在佐剂存在 下每3周施用三次。第四次免疫用klh缀合的单糖基化的 15-mer(glcnac
2-15-mer-klh；seq id no：131)和双糖基化的 18-mer([glcnac2]
2-18-mer-klh；seq id no：130)muc16构建体的混合 物。分析血清对glcnac
2-55-mer(seq id no：129)和未缀合的携带壳二糖 的15/18-mer糖肽(分别为seq id no：131和seq id no：130)的反应性。 此外，非糖基化的55-mer(seq id no：129)、15-mer(seq id no：131)和 18-mer肽(seq id no：130)，以及两个muc16无关的含壳二糖肽用作阴 性对照进行筛选(seq id no：168和169)。每3周用更短的klh缀合物 (seq id no：130和seq id no：131)进一步免疫小鼠两次以上，每次免 疫后通过elisa分析响应。另见第6.2.2节。
[0819]
6.3.2.7 elisa
[0820]
根据用于elisa测定的常规核心实验室方案，进行三明治elisa以评 估抗体对个体(二醇)肽的阳性。另见第6.2.2节。
[0821]
6.3.2.8 western印迹分析
[0822]
通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离等量的蛋白质，并使用 biorad转移装置在4℃下转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)或硝酸纤维素膜上。 用3％牛血清白蛋白(bsa)或5％非脂肪乳在含有0.1％tween-20(pbst)的 pbs中在室温下封闭膜1小时。膜用多种一抗[cell signaling，ma：akt cat #9272，phospho-akt(ser473)(193h12)cat#4058，p44/43mapk(erk1/2)cat #9102，phospho-p44/43 mapk(erk1/2)(thr202/tyr204)cat#9101，src cat# 2109s，phospho-src cat#2101l，egfr cat#2237l，phospho-egfr (y1068)(d7a5)xp(r)cat#3777s]，(sigma-aldrich，inc.，st.louis，mo： β肌动蛋白cat#a5441)，(southern biotech，birmingham，al：抗人
ꢀ‑
fc-igg1-hrp cat#9054-05)，(abgent，san diego，ca：多克隆lgals3 抗体cat#ap11938b)和(origene，rockville，md：小鼠单克隆抗egfr v3 克隆oti3h2 cat#ta506224，小鼠单克隆抗ddk克隆4c5 cat# ta50011-100)在4℃下过夜显影。将膜用pbs-t洗涤三次，并在室温下用 hrp缀合的抗小鼠或抗兔抗体(ge healthcare，uk)(1:5000稀释)显影1小 时。然后将膜用pbs-t洗涤三次，并在室温下用western lightningchemiluminescence试剂(ecl，perkin el-mer)显影1-5分钟，并将信号在 hyblot cl膜(denville scientific inc.metuchen，nj)上显影。
[0823]
关于western印迹分析方案的描述，还参见6.1.2和6.2.2节和下述第 6.3.13节中的参考文献6。
[0824]
6.3.3组织微阵列免疫组织化学(tma)
[0825]
如前所述进行人tma筛选的免疫组织化学(参见下文第6.3.13节中的 参考文献6)。
[0826]
6.3.4 ovcar3、skov3-muc16
c344
和skov3-muc16
c114
的免疫荧光 染色
[0827]
将50,000个细胞分别接种在delta tpg 0.17mm培养皿中，并在各自的 培养基中于37℃在5％co2中培养过夜。用含1％胎牛血清(fcs)和0.025％ 叠氮化钠(facs缓冲液)的pbs洗涤粘附的细胞两次。细胞以1:50稀释后 用egfr(r-1)-alexa fluor 647nm(santa cruz biotechnology，ca，cat# sc-101af647)和4h11或整联蛋白β1(4b7r)-alexa fluor 647nm(santa cruzbiotechnology，ca，cat#sc-9970af647)和4h11在4℃下染色30分钟。 细胞用facs缓冲液洗涤三次，然后用山羊抗小鼠igg2b-pe(santa cruzbiotechnology，ca，cat#sc-3766-pe)在4℃下标记30分钟。将细胞用facs 缓冲液洗涤三次，并使用zen2采集软件在具有20x/0.8na空气镜和 63x/1.4na油镜的zeiss axio observer z1上拍摄图像。
[0828]
6.3.5统计分析
[0829]
为了比较在生长和侵袭的体外和体内研究中评估的组，使用graphpadprism软件(san diego，ca)的双尾学生t检验分析数据的统计学显著性。
[0830]
6.3.6细胞培养，转染和细胞系表征
[0831]
参见6.3.13节关于ovca-433细胞系的参考文献3。plenti四环素可诱 导系统购自invitrogen，ca(cat#k4925-00)，并用于产生plenti-skov3
c114
。 通过纪念斯隆凯特林癌症
中心高通量筛选(hts)核心实验室获得了egfr表 达病毒质粒的shrna发夹敲除；从hek293细胞收集转染的hek293细胞 和病毒上清液以感染plenti-skov3
c114-shegfr细胞系。muc16
c114
转染子 具有从推测切割位点到羧基末端(seq id no：150的氨基酸1777至1890) 的muc16蛋白的细胞表面表达(参见下文第6.3.13节中的参考文献21)。以 类似的方式制备具有较长muc16片段的细胞系，包括具有muc16
c344-gfp 载体表达的细胞系，其具有作为延伸至muc16羧基端的344个氨基酸片段 的muc16蛋白的细胞表面表达(seq id no：150的氨基酸1547至1890)(参 见下文第6.3.13节中的参考文献19和22)。
[0832]
6.3.7转染
[0833]
根据制造商的方案，使用dotap(roche diagnostics，indianapoliscorporation，in)将dna构建体引入skov3细胞。在其培养基中用 800μg/ml的g418选择skov3细胞的稳定转染子。它们被细胞分选两次 用于gfp表达，选择的细胞以多达15代的细胞系生长。进行facs分析的 常规监测，以确认这些细胞系的gfp阳性。通过使用抗hrgfp(stratagene， la jolla，ca)和抗-muc16-羧基末端单克隆抗体的western印迹分析这些细 胞系的蛋白提取物(参见下文第6.3.13节中的参考文献19)。如6.1节所述， 根据制造商的方案，将muc16
c57-114-pfuse-higg1-fc2和 117-244
lgals3-pfuse-higg1-fc2构建体分别转染到的人胚胎肾 (hek)freestyle 293f细胞(invitrogen，ca)中，其表达融合蛋白并分泌至无 血清培养基中(见第6.1节和下文第6.3.13节中的参考文献19)。纯化分泌的 融合蛋白并使用抗人igg1-fc-hrp(γ1链特异性)(southern biotech inc.， birmingham，al)或4h11-hrp或多克隆抗人lgals3抗体(abgent，sandiego，ca)的western印迹分析进行表征。在hek293细胞中表达的 egfrddk-his(cat#tp700043)、lgals3myc-ddk(cat#tp308785)和整 联蛋白-β1myc-ddk(cat#tp303818)纯化的蛋白购自origene，rockville， md。
[0834]
6.3.8通过facs分析的免疫荧光染色
[0835]
如第6.1节和下文第6.3.13节中的参考文献6所述进行muc16表达 facs分析。
[0836]
6.3.9生长曲线
[0837]
如第6.1节和第6.2节以及下文第6.3.13节中的参考文献18和19中所 述进行生长曲线。
[0838]
6.3.10命名
[0839]
如实施例3(第6.3节)所用，“n1”是指seq id no：150的位点1777的 天冬酰胺，也称为“asn1777”。如实施例3(6.3节)所用，“n24”是指seq idno：150的位点1800的天冬酰胺，也称为“asn1800”。如实施例3(6.3节) 所用，“n30”是指seq id no：150的位点1806的天冬酰胺，也称为
ꢀ“
asn1806”。
[0840]
6.3.11结果
[0841]
6.3.11.1 muc16病理生物学依赖于c端muc16胞外域的n-糖 基化
[0842]
c-末端muc16胞外域(muc16
c114
)的最近端114个氨基酸的表达导致 3t3小鼠成纤维细胞的更积极的体外/体内行为，包括muc16驱动的基质 胶侵袭的显著增加和更快速的肿瘤体内增长(见第6.1节和下文第6.3.13节 参考文献19)。为了考察muc16的作用及其在人卵巢细胞中的糖基化作用， 检测了muc16阴性skov3人卵巢细胞系的muc16表达的影响(图 18a-18c)。用muc16
c114
稳定表达载体转染skov3细胞导致高水平的细胞 表面muc16表达，大于基质胶侵袭中的两倍增加，如图19a所示。细胞 暴露于n-糖基化抑制剂衣霉素24小
时显著地降低了skov3-muc16
c114
细 胞的侵袭性，但对skov3-phrgfp仅载体转染细胞的基质胶侵袭几乎没有 影响(图19a)。
[0843]
凝集素在之前已经涉及糖基化作用的介导(参见下文第6.3.13节中的参 考文献17)，并且由于半乳糖凝集素-3通常在人类卵巢癌中过表达，因此通 过将半乳糖凝集素-3的糖结合域(
117-244
lgals3)与缺少可变结合域的截短 的pfuse-人igg1-fc2序列(pfuse)(参见下文6.3.13节中的参考文献1)进 行组合产生了凝集素阻断构建体(“117-244
lgals3-pfuse”)。该嵌合分子结合 半乳糖凝集素-3配体，但缺乏形成半乳糖凝集素-3五聚体的能力。如图19a 所示，当将该半乳糖凝集素阻断构建体导入细胞时，其对对照 skov3-phrgfp细胞的基质胶侵袭影响不大，但skov3-muc16
c114
侵袭显 著降低。缺少半乳糖凝集素-3糖结合域的对照pfuse载体没有作用。还通 过将相同的pfuse载体与muc16胞外域的58个氨基酸连接而构建产生了 可溶性muc16胞外域(“muc16
c57-114-pfuse”)。与半乳糖凝集素
ꢀ‑
3-pfuse(
117-244
lgals3-pfuse)阻断构建体相同，muc16
c57-114-pfuse构建 体也显著降低skov3-muc16
c114
细胞的侵袭，而不是skov3-phrgfp细胞 的侵袭。mgat5是催化形成具有对半乳糖凝集素-3结合的最高亲和力的四 触角n-聚糖的糖基化酶(参见下文第6.3.13节参考文献9)。mgat5敲除小 鼠对肿瘤生长有抗性(参见下文第6.3.13节参考文献8)。不受任何特定理论 的约束，假设muc16的作用将依赖于半乳糖凝集素-3和mgat5的表达。 如图19b所示，减少mgat5或半乳糖凝集素-3(lgals3)的shrna显著降 低skov3-muc16
c114
侵袭，而阴性对照敲低薄层(lamelli)shrna无效果。
[0844]
引入突变至muc16胞外域n-糖基化位点(muc16
c114
胞外域的n1，n24 和n30位置的天冬酰胺残基)降低观察到的muc16-糖基化依赖性变化。如 图19c所示，与切割位点相邻的最远端的天冬酰胺(n1)的天冬酰胺至丙氨 酸的突变对侵袭没有负面影响。相比之下，任何更近端的天门冬酰胺(n24 或n30)的天冬酰胺至丙氨酸突变都不利地影响了侵袭。特别地，最靠近膜 表面(n30)的天冬酰胺的保存对于增强侵袭是最关键的，并且通过额外的其 他天冬酰胺残基的天冬酰胺至丙氨酸的突变没有显著增加这种作用。还检 测了来自muc16 c-末端(muc16
c344
)的具有344个氨基酸的更大的muc16 构建体。当将在muc16
c344
的n30或muc16
c344
的n24和n30携带muc16 突变的表达载体转染到skov3细胞系中时，基质胶侵袭显著降低(图19d)。 尽管这个更大的构建体在切割位点的远端具有另外七个n-糖基化位点，但 突变关键的近端n24和n30位点仍然降低了基质胶侵袭，如图19d所示， 正如那些突变改变了skov3-muc16
c114
的侵袭一样。
[0845]
已经证明了3t3细胞的muc16
c114
转化中的erk和pi3k/akt途径的 下游激活(参见第6.1节和下文第6.3.13节中的参考文献19)。在图19e，可 以看出用muc16
c114
转染skov3细胞激活多种致癌基因，包括perk1/2， psrc和egfr的磷酸化。图19e证实，以下每种条件均影响muc16
c114
诱导的致癌基因激活：敲低mgat5(shmgat5)，敲低半乳糖凝集素
ꢀ‑
3(shlgals3)，将n30的天冬酰胺突变为丙氨酸。这些数据与在muc16
c114
表达相关的基质胶侵袭中观察到的降低一致。
[0846]
在裸小鼠的异种移植肿瘤生长中检测了敲低mgat5或lgals3或 muc16
c114
胞外域n-糖基化位点突变的作用。如图19f所示，用任何这些 n-糖基化定向干预均完全消除了muc16
c114
诱导的肿瘤生长。还研究了 muc16
c114
对受体稳定性的影响。n-糖基化和连接到半乳糖凝集素晶格的存 在已经与egfr在细胞表面的稳定相关联(参见下文第6.3.13节参考
文献 11)。不受任何特定理论的约束，我们推测muc16的增加的存在稳定了细 胞表面的半乳糖凝集素晶格，从而使egfr在细胞表面上稳定。如图20a 所示，当使用facs分析将稳定的skov3-muc16
c114
转染子与仅载体对照 相比时，skov3细胞的细胞表面上egfr的存在增加。此外，在放线菌酮 (chx)处理以抑制新的egfr合成后，与phrgfp载体对照相比，muc16
c114
表达在细胞表面上几乎使egfr翻倍。chx处理后muc16
c114
胞外域(4h11 阳性)的稳定性不变。在稳定的skov3-muc16
c114
和用chx处理24小时 的skov3-phrgfp细胞中通过western印迹比较总egfr相对时间，并将 egfr与β-肌动蛋白进行比较。光密度曲线(图20b)表明，与phrgfp载体 对照相比，细胞表面muc16
c114
的存在使egfr稳定。为了排除这种影响 与skov3稳定的muc16
c114
克隆的选择有关的可能性，使用了四环素诱导 型muc16
c114
系统。如图20c所示，四环素暴露24小时对于用空phrgfp 载体或稳定的cmv驱动的muc16
c114
表达载体转染的对照skov3细胞的 基质胶侵袭没有影响。在muc16
c114
四环素诱导系统中，四环素暴露诱导 的muc16
c114
依赖性基质胶侵袭类似于稳定转染子，无论是对照还是 muc16
c114
。通过导入skov3细胞的降低egfr表达的shrna构建体 (shegfr)的稳定表达来检测egfr的需求。shegfr转染细胞的两种单细胞 克隆都显示出明显降低的基质胶侵袭。与skov3-muc16
c114
细胞系相比， 四环素诱导的这两种shegfr细胞系中muc16
c114
的表达对基质胶侵袭的 影响最小，证实skov3-muc16
c114
诱导的基质胶侵袭与egfr的表达相互 依赖。通过western印迹法研究了用四环素诱导的chx处理的 skov3-muc16
c114
的egfr稳定性，并与β-肌动蛋白进行比较。如图20d 所示，chx暴露24小时导致未诱导的muc16(-)skov3细胞中总egfr 蛋白的稳定下降。当在skov3-muc16
c114(tet)
细胞四环素诱导后进行相同的 实验时，chx诱导的egfr损失率降低。muc16不仅稳定了细胞的egfr 含量，而且与未诱导的skov3-muc16
c114(tet)
细胞相比，其还稳定了四环素 诱导的skov3-muc16
c114(tet)
细胞中pegfr表达水平(图21)。
[0847]
6.3.11.2作为单克隆抗体(mab)开发的表位模拟物的均质n-糖 肽的合成
[0848]
在将muc16
c114
的n24和n30位点上的n-糖基化鉴定为muc16作用 的核心需要后，分析了从skov3-muc16
c114
细胞系纯化的在n1和n24含 有丙氨酸至天冬酰胺突变的muc16
c114
突变糖肽的聚糖谱(图22)。因此，这 种纯化的糖肽含有用于n-糖基化的单个天冬酰胺残基(n30)。纯化糖肽的糖 组分析如图22a所示。其特征在于主要由截短的糖基化种类组成的多种n
‑ꢀ
糖基化模式，其共享附着岩藻糖和各种甘露糖残基的作为最小重复单元的 常见的近端壳二糖(glcnac2)二糖(图22a)。
[0849]
假设针对包含关键的n30糖基化位点的muc-16-胞外域表位的抗体可 能抑制muc16与半乳糖凝集素晶格的相互作用，减少muc16表达的不良 反应，包括肿瘤生长和侵袭。因此，设计了在该n30位点用壳二糖糖基化 的muc16胞外域内各种长度的合成肽抗原(即分别为55、18和15个氨基 酸长，分别为seq id no：129、131和130)。除了作为更大、更复杂的 n-聚糖的共同最小基序之外，壳二糖也应该能够更好地暴露下面的肽以引 发保留肽特异性的聚糖导向的抗体。
[0850]
55-mer muc16-胞外域n-糖肽(glcnac
2-55-mer；seq id no：129)的 合成是高度收敛的，并涉及方便保护的全长肽(55-mer)和壳二糖胺之间的偶 联，然后使用我们的单烧瓶天冬氨酰基化/脱保护程序进行酸全局脱保护(参 见第6.2节和第6.4节以及下文第6.3.13节中的参考文献7和20)。按照类 似的方法，还通过收敛的天冬氨酰化制备了具有末端三聚甘露糖聚糖的更 精细的man3glcnac
2-55-mer糖肽。
muc16
c114
(全n-糖基化)、 skov3-muc16
n24c114
突变体(无n24糖基化位点)、skov3-muc16
n30c114
(无 n30糖基化位点)和skov3-muc16
n1-n24-n30c114
(无n1、n24或n30糖基化 位点)进行了对比。skov3-muc16
c114
是指表达截短形式的muc16的 skov3细胞，其能够在n1、n24和n30进行n-糖基化。skov3-muc16
n24c114
是指表达截短突变形式的muc16的skov3细胞，其中对应于seq id no： 150的asn1800的氨基酸位置包含天冬酰胺至丙氨酸突变，因此在该位置不 能进行n-糖基化位置。skov3-muc16
n30c114
是指表达截短突变形式的 muc16的skov3细胞，其中对应于seq id no：150的asn1806的氨基 酸位置包含天冬酰胺至丙氨酸突变，因此在此不能进行n-糖基化位置。 skov3-muc16
n1-n24-n30c114
是指表达截短突变形式的muc16的skov3细 胞，其中对应于seq id no：150的asn1777、asn1800和asn1806的氨基 酸位置包含天冬酰胺至丙氨酸突变，因此不是能够在这些位置被n-糖基化。 与elisa数据一致，结果表明存在muc16特异性靶向。
[0861]
然而，与elisa数据相反，muc16胞外域中n24和n30糖基化位点 的缺失降低了糖基化靶向的抗体反应性，而保留了对4h11抗体的反应性， 从而证实了细胞表面skov3-muc16
c114
的存在。具有延伸至344个氨基酸 的muc16 c-末端链的细胞(例如skov3-muc16
c344
)对n24或n30糖基化 也具有相似的要求(表11)。此外，与针对聚糖-muc16胞外域的抗体的反应 性没有受到mgat5的下调而减弱(表11)，证实n24/n30位点的壳二糖有 助于抗体与全细胞的结合，而不管更复杂的分支(branching)。
[0862]
表11.表11提供了4h11和四个glcnac
2-muc16胞外域单克隆抗体对 n-糖基化位点修饰转染的skov3-muc16的几何平均藻红蛋白(pe)荧光。 4h11保留与所有细胞系(除了不表达muc16的skov3-phrgfp系之外)的 结合，而不管糖基化修饰，从而证实了细胞表面上的muc16蛋白。当糖基 化的n24和n30位点都失去时，muc16
c114
和muc16
c344
转染子的聚糖
ꢀ‑
muc16抗体结合减少。mgat5敲低细胞系的有限的反应性丧失证实，壳 二糖对于每种glcnac
2-muc16胞外域抗体是必需的，而更广泛的支链具有 有限的作用。
[0863][0864]“g抗m”表示山羊抗小鼠。“pe”表示藻红蛋白.
[0865]
评估了表征的四种代表性的muc16糖基化抗体(18c6，10c6，19c11， 7b12)和4h11的结合亲和力(表12)及其通过基质胶测定对 skov3-muc16
c114
转染子的侵袭的影响。如图23b-23d，新开发的抗体显 示对基质胶侵袭的广泛抑制，而4h11的特征在于其不能阻断 skov3-muc16
c114
介导的侵袭，表明这些靶向muc16胞外域中糖基化肽 表位的抗体抑制了一些muc16的关键生物学特性，其优于针对紧邻表位的 抗体。所有muc16糖基化抗体在表达天然全长muc16的卵巢癌细胞(如 caov3和ovca-433细胞)中是抑制性的。这表明n24/n30糖基化位点对 于muc16的增强的侵袭性质是关键的，而其它muc16 n-和o-糖基化位 点的存在不足以克服(overcome)阻断该关键表位的muc16糖基化抗体。不 受任何特定理论的束缚，我们预测抗体对半乳糖凝集素-3与muc16的 n24/30结合的抑制也会削弱egfr的细胞表面稳定性。图23b-23d证实， 当将这些抗体中的一种(10c6)引入细胞培养物时，四环素诱导的 skov3-muc16
c114(tet)
的egfr稳定作用被克服，并且暴露于chx的细胞中egfr损失速率与没有muc16
c114
表达的未诱导的skov3-muc16
c114(tet)
细 胞系的相似。还在卵巢癌组织芯片中检测了抗体的免疫组织化学染色。如 图23e所示，每个聚糖导向的muc16胞外域抗体与石蜡固定的组织中的浆 液性卵巢癌细胞结合，与其他基质组织的相互作用有限，类似于4h11的行 为。最后，测试了10c6抗体对免疫受损小鼠中skov3-muc16
344
生长的影 响。使用skov3-muc16
c344
细胞代替skov3-muc16
c114
细胞作为具有多 个n-和o-糖基化位点的muc16阳性肿瘤细胞中抗体效应的更严格的测试。 10c6抗体降低了muc16
c344
细胞的基质胶侵袭(图23f)，并且当每周两次施 用至荷瘤小鼠时，小鼠侧腹中skov3-muc16
c344
肿瘤细胞的生长显著降低 (图23g)。
[0866]
表12.
[0867][0868]
*低计算置信度，未拟合解离率
[0869]
**ka对于结合率测定而言过低
[0870]
6.3.11.6 muc16和其他细胞表面蛋白的半乳凝素依赖性共定位 muc16稳定的egfr似乎是卵巢癌细胞侵袭的重要驱动因素，并且这 种相互作用取决于egfr、适当的n-糖基化的muc16蛋白胞外域和半乳糖 凝集素-3的存在。用纯化的蛋白质评估这种相互作用，以建立这三种蛋白 质之间必需/足够的三向相互作用。为此，使用了纯化的 muc16
c57-114-pfuse(在人胚胎肾[hek]freestyle 293f细胞中产生)(作为相 互作用的muc16部分)，纯化的egfr(由hek293细胞产生)和纯化的半乳 糖凝集素-3(lgals3；使用hek293细胞产生)蛋白。因为这些蛋白质是在 人类细胞中产生的，所以它们被期望具有典型的天然糖基化种类。不受任 何特定理论的约束，我们假设三种蛋白质将形成可通过免疫共沉淀鉴定的 异聚体。图24a示出了这种免疫共沉淀的结果，其中检测的三种蛋白中的 每一种都显示在左侧三个泳道的直接免疫印迹中。使用琼脂糖蛋白a/gplus珠，可以看出muc16
c57-114-pfuse蛋白与蛋白a/g plus缀合的珠结 合，并在sds-page凝胶上分离时存在于洗脱液中。egfr仅存在于半乳 糖凝集素-3(lgals3)也存在时的与muc16
c57-114-pfuse组合的洗脱液中。 抗体18c6通过阻断半乳糖凝集素-3的n-糖基化结合位点而消除egfr-muc16相互作用(参见图24a)。直接分子双重免疫荧光成像也用于 确认egfr和muc16在活细胞中的共定位。如图24b和25a所示，egfr 和muc16紧密共定位在ovcar3、skov3-muc16
c344
和 skov3-muc16
c114
细胞中(参见图24b和25a中的箭头)。这些研究强烈证 实muc16组合半乳糖凝集素-3以与muc16阳性卵巢癌细胞表面的egfr 结合。不受任何特定理论的约束，由于许多生长增强受体是糖基化的，我 们推测，凝集素依赖性muc16细胞表面效应可能包括其他n-糖基化蛋白， 而不限于egfr。整联蛋白经常在癌症中发生改变，并参与由间质-上皮相 互作用启动的“外向内”信号，引发src磷酸化和其他下游作用。图24c描 述了muc16与整联蛋白β1的相互作用，整联蛋白β1是与癌症发展和进展 频繁相关的整联蛋白成分。在egfr的情况下，纯化的muc16
c57-114-pfuse 以半乳糖凝集素-3依赖性方式结合整联蛋白β1，并且该异源三聚相互作用 需要所有3种蛋白质。与egfr相同，该相互作用被抗muc16
c114
糖基化 位点阻断抗体18c6完全阻断。muc16和整联蛋白β1的共定位也通过在几 种卵巢癌细胞系中的双重免疫荧光证实(图24d和图25b)。因此，muc16
‑ꢀ
胞外域表位的关键位点的n-糖基化以凝集素特异性方式介导与细胞表面蛋 白受体的相互作用，以产生恶性行为的特征，包括基质胶侵袭、pi3k/erk 和src途径的活化，以及在免疫受损小鼠中增强的muc16阳性肿瘤生长。
[0871]
不受任何特定机制的约束，癌症相关粘蛋白muc16的机理模型及其对 卵巢癌细胞行为的影响如图26所示。在图26a中，muc16通过半乳糖凝 集素-3结合egfr和整联蛋白β1，以增强能促进生长和侵袭的稳定性和“内 向外”信号。当muc16胞外域n-糖基化位点被突变或mgat5活性被抑制 时(图26b)，结合被阻止，并降低了egfr/整联蛋白信号。类似地，如果
半 乳糖凝集素-3蛋白质表达被抑制(图26c)，则分子缔合丧失，信号和侵袭减 少。最后，当muc16-胞外域嵌合抗体或嵌合“trap”lgals3分子阻止分 子相互作用时，癌细胞缺少观察到的muc16肿瘤促进特性(图26d)。
[0872]
6.3.12讨论
[0873]
muc16和其他栓粘蛋白例如muc1和muc4可以转化3t3细胞并与 不良结果相关。癌症中异常表达的粘蛋白的机制是复杂和多样的。我们很 好地描述了n-糖基化模式在响应局部环境的细胞生长中起重要作用。糖蛋 白模式的多样性受到通过基于高尔基体糖基化的环境依赖性己糖胺通量的 影响。常见的生长因子受体如egfr、胰岛素样生长因子受体(igf1r)和 pdgfr优选首先以营养依赖的方式糖基化，并且那些重度糖基化受体优先 递送到细胞表面。相比之下，抑制性受体如tgf-β具有较少的n-糖基化位 点，并且稍后呈现在细胞表面，从而导致生长程序的抑制(参见下文第6.3.13 节参考文献12)。在卵巢癌中，egfr表达与侵袭行为相关，egfr信号传 导依赖于受体的糖基化状态和n-糖基化种类对凝集素的亲和力(参见下文 第6.3.13节中的参考文献2)。酶mgat5似乎对于合成对半乳糖凝集素-3 具有最高亲和力的四触角支链n-聚糖是重要的，所述半乳糖凝集素-3是一 种在癌细胞中过表达的重要凝集素(参见下文第6.3.13节参考文献17)。
[0874]
本实施例提供了证据，证明与muc16表达相关的行为是通过这些方法 在muc16相对于细胞表面的最近端的胞外域上的特定n-糖基化位点介导 的。与半乳糖凝集素-3和细胞表面蛋白的高亲和力相互作用需要mgat5 依赖的n-糖基化模式，以促进免疫受损小鼠的侵袭、癌基因激活和增加的 肿瘤生长。特别地，切割后muc16的保留的胞外域上最近端的n-糖基化 对于这种相互作用至关重要。去除这些n-糖基化位点的干预、用模拟受体 阻断位点或干扰其完全n-糖基化都会损害muc16的转化作用。这些转化 作用似乎不仅取决于单独的muc16，还取决于n-糖基化的muc16与半乳 凝素-3和其他细胞表面蛋白在近端n-糖基化位点的相互作用。与亲本 skov3phrgfp细胞相比，muc16胞外域表达显示出能够稳定egfr(一 种生长和侵袭的介导物)并延长其在skov3-muc16
c114
细胞表面的驻留。 即使在仅保留一个n-糖基化位点的简化的muc16糖肽模型中，糖基化的 随机性质导致各种n-聚糖的存在，所有n-聚糖都通过共有的壳二糖干与 muc16蛋白骨架相连。因此，针对壳二糖连接(在n24/n30位点)的muc16 胞外域的muc16
c114
聚糖肽表位制备抗体。这些新抗体(muc16糖基化抗体) 阻断muc16增强的侵袭、癌基因激活和体内肿瘤生长。重要的是，这些 muc16糖基化抗体抑制具有全长muc16表达以及具有较短的muc16 c
‑ꢀ
末端表达的测试性截短的构建体的细胞中的muc16相关性质。muc16糖 基化抗体在chx存在下干扰了卵巢癌细胞表面的egfr稳定性，并在裸小 鼠中损伤了移植生长。此外，muc16糖基化抗体的作用也阻止了纯化的 muc16与纯化的egfr或整联蛋白β1在重组半乳糖凝集素-3存在下的相 互作用。
[0875]
本实施例揭示了粘蛋白过表达在癌症中的作用的见解。通过形成凝集 素介导的低亲和力多分子复合物，muc16能够以糖基化依赖的方式增强“外 向内”信号转导。负责最大作用的特异性n-糖基化位点是独特的并且靠近细 胞表面，而其他更远端的n-糖基化位点可能不那么重要。在临床开发中存 在半乳糖凝集素-3抑制剂，但是模拟受体“半乳糖凝集素-3-trap”构建体或 截短的“muc16-trap”分子在本实施例的体外模型中具有相似的效果。本 实施例中鉴定的muc16糖基化抗体抑制muc16的转化作用。
[0876]
6.3.13参考文献
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[0899]
6.4实施例4：补充化学信息
[0900]
该实施例提供(a)实施例2和3(第6.2和6.3节)中描述的某些使用的方法和实验的更详细描述；和(b)与实施例2和3(第6.2和6.3节)相比的附加信息。
[0901]
6.4.1一般材料和方法
[0902]
使用所有可商购的材料(aldrich，fluka，novabiochem)，无需进一步纯化。n-α-fmoc保护的氨基酸，伪脯氨酸二肽，oxymapure和novasyntgsieber树脂购自
novabiochem。1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三 唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐(hatu)购自genscript。(7-氮杂苯并三 唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(pyaop)购自oakwood products， inc。壳二糖八醋酸酯购自carbosynth limited。tcep溶液(0.5m，中性ph) 和异双功能接头磺基-gmbs购自pierce，thermoscientific。所有其他试 剂，包括血蓝蛋白(klh)购自aldrich。所有溶剂均为试剂级或hplc级 (fisher scientific)。无水四氢呋喃，乙醚，二氯甲烷，甲苯和苯由干溶剂体 系(在氩气氛下通过中性氧化铝柱)得到，不经进一步干燥使用。
[0903]
反应在预纯化的干燥氩气气氛下进行。空气和湿气敏感的液体和溶液 通过注射器转移。通过用甲苯共沸除去水来干燥合适的碳水化合物试剂。 分子筛在350℃下活化，并在使用前立即破碎，然后在真空下进行火焰干燥。 通过在30℃以下的旋转蒸发将有机溶液减压浓缩。在bruker advancedrx-600mhz光谱仪上记录nmr光谱(1h和
13
c)，以
tm
s或残余溶剂为参 考。使用joel jms-dx-303-hf质谱仪或waters micromass zq质谱仪进行 低分辨率质谱分析。在e.-merck硅胶60f254板上进行分析tlc，并在uv 光(254nm)下或通过用钼酸铈铵(cam)或5％硫酸在甲醇中染色显色。在 e.-merck 230-400目硅胶60上进行二氧化硅快速柱层析。
[0904]
6.4.1.1 uplc/lc-ms分析和rp-hplc纯化。
[0905]
所有反相色谱分离都涉及由在水中的0.05％三氟乙酸(tfa)(v/v)和在乙 腈中的0.04％tfa组成的流动相。在具有光电二极管检测器和单四极杆质 谱检测器的waters acquity
tm ultra preformance液相色谱系统的uplc-ms 分析中监测反应进程，该检测器装备有acquity uplc beh c18/c8/c4柱 (1.7μm，2.1
×
100mm)，流速为0.3ml/min。使用varian microsorb c18柱(150
ꢀ×
2.0mm)、varian microsorb c8/c4柱(250
×
2.0mm)或waters x-bridgec18柱(150
×
2.1mm)在具有waters 2996光电二极管阵列检测器的waters2695分离模块上进行分析lc-ms分析，流速为0.2ml/min。使用agilentdynamax反相hplc microsorb c18/c8/c4柱(250
×
21.4mm)或watersx-bridge c18柱(150
×
19.0mm)，在装有rainin uv-1检测器的ranin hplc 溶剂输送系统上进行制备级hplc纯化，流速为16.0ml/min。
[0906]
6.4.2实验流程
[0907]
6.4.2.1基于fmoc的固相肽合成(spps)
[0908]
在cem liberty微波肽合成仪上进行自动肽合成。在novasyn tgsieber树脂上用标准fmoc方案合成肽。解块(deblock)混合物由oxymapure(0.1m)的20％哌啶/dmf溶液组成。使用来自novabiochem的以下 fmoc氨基酸：fmoc-ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asn(dmcp)-oh、 fmoc-asp(ompe)-oh、fmoc-asp(opp)-oh、fmoc-asp(oallyl)-oh、 fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gln(dmcp)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、 fmoc-gly-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-met-oh、 fmoc-phe-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ser(otbu)-oh、 fmoc-thr(otbu)-oh、fmoc-tyr(otbu)-oh、fmoc-val-oh。使用以下 dmb(2,4-二甲氧基苄基)和伪脯氨酸二肽(novabiochem)： fmoc-asp(otbu)-(dmb)gly-oh、fmoc-gly-thr(ψ
me,me
pro)-oh、 fmoc-phe-thr(ψ
me,me
pro)-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(ψ
me,me
pro)-oh。
[0909]
6.4.2.2肽树脂的n末端乙酰化
[0910]
当以0.1mmol的规模自动合成完成时，将肽树脂用dmf(2ml)洗涤到 肽合成容器
000截 留分子量)除去未反应的(糖)肽。最后，获得作为pbs溶液的相应的klh缀 合物。
[0923]
6.4.3全长muc16糖肽(55-mer)的合成
[0924]
6.4.3.1含有壳二糖的全长糖肽的合成
[0925]
根据6.4.2.1的方法完成自动合成后，将肽树脂进行n-乙酰化和脱烯丙 基化(分别参见6.4.2.2和6.4.2.3节)，以提供在树脂切割后(见第6.4.2.4节)， 在asp30侧链上具有游离羧酸的部分保护的肽p55-mer[n1-s55]。通过硅胶 柱色谱法纯化该粗肽的一部分，用5
→
12％meoh/ch2cl2洗脱，冷冻干燥 后得到作为白色固体的肽p55-mer[n1-s55](70mg)。图27a描绘了侧链保护 的n-乙酰化的55-mer肽酰胺。图27b描绘了来自用于糖肽p55-mer[n1-s55] 的uplc分析的esi-ms和uv示踪。
[0926]
根据6.4.2.6节，将肽p55-mer[n1-s55](20mg，2.0μmol)和壳二糖 (glcnac2)端基异构胺(3.5mg，8.1μmol)合并并溶于无水dmso(100μl)。 然后加入pyaop(4.3mg，8.1μmol)的dmso(30μl)溶液，然后加入diea (2.0μl，12.2μmol)。将金黄色混合物搅拌3小时，加入1ml冰冷水(0.05％ tfa)淬火，冷冻干燥。
[0927]
然后将保护的糖肽用混合物r(1.0ml)处理2小时，用冰冷的et2o沉 淀，离心，重新悬浮并如第6.4.2.6节所述冻干。将粗肽溶解在25％乙腈/ 水(0.05％tfa)(2ml)中，并通过hplc在x-bridge c18柱上纯化，使用 25-35％乙腈水溶液(0.05％tfa)的线性梯度30分钟。收集含有20分钟洗脱 的所需产物的级分并冻干，得到糖肽“55-mer(壳二 糖)[n1-s55]”(glcnac
2-55-mer)(3.0mg，22％产率)，为白色固体(图28a)。 图28b提供来自uplc分析的糖肽“55-mer(壳二 糖)[n1-s55]”(glcnac
2-55-mer)的esi-ms和uv示踪。
[0928]
6.4.3.2含有五糖的全长糖肽的合成
[0929]
根据6.4.2.6节，将肽p55-mer[n1-s55](10mg，1.0μmol)和五糖 man3glcnac2端基异构胺(1.5mg，1.6μmol)合并并溶解在无水dmso(30 μl)中。然后加入pyaop(2.1mg，4.1μmol)的dmso(5μl)溶液，然后加入 diea(1.0μl，6.1μmol)。将金黄色混合物搅拌3小时，加入1ml冰冷水 (0.05％tfa)淬火，冷冻干燥。
[0930]
然后将保护的糖肽经受用混合物r(1.0ml)处理2小时，用冰冷的et2o 沉淀，离心，重新悬浮并如第6.4.2.6节所述冻干。将粗肽溶解在25％乙腈 /水(0.05％tfa)(2ml)中，并通过hplc在x-bridge c18柱上纯化，使用 25-35％乙腈水溶液(0.05％tfa)的线性梯度30分钟。收集含有18分钟洗脱 的所需产物的级分并冻干，得到糖肽
ꢀ“
55-mer(man3glcnac2)[n1-s55]”(man3glcnac
2-55-mer)(1.5mg，20％产率)， 为白色固体。图29a描绘了携带有man3glcnac2的55-mer糖肽：
ꢀ“
55-mer(man3glcnac2)[n1-s55]”(man3glcnac
2-55-mer)。图29b描绘了对于 糖肽“55-mer(man3glcnac2)[n1-s55]”(man3glcnac
2-55-mer)的分析级 hplc分析的esi-ms和uv示踪。
[0931]
6.4.4小尺寸糖肽(15-mer和18-mer)的合成
[0932]
6.4.4.1壳二糖-单糖基化15-mer的合成
[0933]
根据6.4.2.1节完成自动合成后，将肽树脂进行n-乙酰化和脱烯丙基化 (分别见第6.4.2.2节和第6.4.2.3节)，以提供从树脂裂解(参见第6.4.2.4节) 后的在asp30(对应于seq id no：150的asn1806)侧链上具有游离羧酸的 部分保护的肽p15-mer[c-g25-v38]。图30a。该肽不经进一步纯化用于下 一步骤。
[0934]
将肽p15-mer[c-g25-v38](10mg，3.8μmol)和壳二糖(glcnac2)端基异 构胺
(4.8mg，11.3μmol)合并并溶解在无水dmso(80μl)中。加入 pyaop(5.9mg，11.3μmol)的dmso(20μl)溶液，然后加入diea(2.6μl， 15μmol)，将金黄色混合物搅拌2.5小时，冷冻并冻干。然后将受保护的糖 肽用tfa混合物(1ml)处理2小时，用冰冷的乙醚沉淀，离心，重悬浮并 根据第6.4.2.6节冻干。将粗肽溶于15％乙腈/水(0.05％tfa)(2ml)中， 并在c18柱上使用15-35％乙腈水溶液(0.05％tfa)的线性梯度在30分钟内 纯化。收集含有17分钟洗脱的所需产物的级分并冻干，得到糖肽“15-mer(壳 二糖)[c-g25-v38]”(glcnac
2-15-mer)(2.0mg，25％产率)，为白色固体。壳 二糖-单糖基化的15-mer糖肽：15-mer(壳二糖)[c-g25-v38] (glcnac
2-15-mer)参见图30b。图30c描绘了用于糖肽“15-mer(壳二 糖)[c-g25-v38]”(glcnac
2-15-mer)的分析级hplc分析的esi-ms和uv示 踪。
[0935]
6.4.4.2壳二糖-双糖基化的18-mer的合成
[0936]
根据6.4.2.1节完成自动化合成后，将肽-树脂进行n-乙酰化(见6.4.2.2)。 然后，按照6.4.2.4节所述的方法，进行从树脂中切下并伴随去除opp保护 基，得到在asp24和asp30(分别对应于seq id no：150的asn1800和 asn1806)侧链上带有游离羧酸的部分保护的肽p18-mer[c-t22-v38]。该肽 不经进一步纯化用于下一步骤。参见图32a。
[0937]
将肽p18-mer[c-t22-v38](30mg，9.1μmol)和壳二糖(glcnac2)端基异 构胺(27mg，63.4μmol)合并并溶解在无水dmso(150μl)中。然后将 pyaop(28.5mg，54.6μmol)加入到dmso(50μl)中，然后加入diea(2.6μl， 15μmol)，并将金黄色混合物搅拌2.5小时，冷冻并冻干。然后将受保护的 糖肽用tfa混合物(1ml)处理2小时，用冰冷的乙醚沉淀，离心，重悬浮 并根据第6.4.2.6节冻干。将粗肽溶解在15％乙腈/水(0.05％tfa)(6ml)中， 并通过hplc在c8柱上纯化，使用15-27％乙腈水溶液(0.05％tfa)的线性 梯度在30分钟内纯化。收集含有15分钟洗脱的所需产物的级分并冻干， 得到糖肽“18-mer(壳二糖)2[c-t22-v38]”[(glcnac2)
2-18-mer](6.5mg，25％ 收率)，为白色固体。参见图32b。图31c描绘了用于糖肽“18-mer(壳二 糖)2[c-t22-v38]”[(glcnac2)
2-18-mer]的分析级hplc分析的esi-ms和uv 示踪。
[0938]
6.5 15-mer和18-mer muc16糖肽的klh缀合
[0939]
糖肽“15-mer(壳二糖)[c-g25-v38]”和“18-mer(壳二糖)2[c-t22-v38]”被 按照第6.4.2.7节所示流程缀合至klh以提供对应的klh缀合物，分别为 glcnac
2-15-mer-klh和(glcnac2)
2-18-mer-klh。参见图32a和图32b。
[0940]
7.序列表
[0941]
表13.序列表.
[0942]
[0943]
[0944]
[0945]
[0946]
[0947]
[0948]
[0949]
[0950]
[0951]
[0952]
[0953]
[0954]
[0955]
[0956]
[0957]
[0958]
[0959]
[0960]
[0961]
[0962]
[0963]
[0964]
[0965]
[0966]
[0967]
[0968]
[0969]
[0970]
[0971]
[0972]
[0973]
[0974]
[0975]
[0976]
[0977]
[0978]
[0979]
[0980]
[0981]
[0982]
[0983]
[0984]
[0985]
[0986][0987]
8.等同
[0988]
在本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文， 如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入。虽 然为了清楚理解的目的，已经通过说明和示例的方式对前述发明进行了一 些详细的描述，但是根据本发明的教导，对于本领域的普通技术人员将显 而易见的是，可以在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下做出对 其的某些改变和修改。
[0989]
9.综上所述，本发明包括但不限于以下各项：
[0990]
1.抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体
[0991]
(a)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化 的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133，
[0992]
(b)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未 糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seq id no:139，和
[0993]
(c)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
[0994]
2.项1的抗体或其抗原结合片段，其中抗体不能免疫特异性结合重组表达第三 形式的muc16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是seqid no:139。
[0995]
3.抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体
[0996]
(a)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133,
[0997]
(b)不能免疫特异性结合重组表达第三形式的muc16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是seqidno:139，和
[0998]
(c)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。项1的抗体或其抗原结合片段，其中(i)重组表达第一形式的muc16的细胞是skov3细胞；(ii)重组表达第二形式的muc16的细胞是skov3细胞；且(iii)步骤(c)中的细胞是skov3细胞。
[0999]
4.项3的抗体或其抗原结合片段，其中(i)重组表达第一形式的muc16的细胞是skov3细胞；(ii)重组表达第三形式的muc16的细胞是skov3细胞；且(iii)步骤(c)中的细胞是skov3细胞。
[1000]
5.项2的抗体或其抗原结合片段，其中(i)重组表达第一形式的muc16的细胞是skov3细胞；(ii)重组表达第二形式的muc16的细胞是skov3细胞；(iii)重组表达第三形式的muc16的细胞是skov3细胞；且(iv)步骤(c)中的细胞是skov3细胞。
[1001]
6.项1-5任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合氨基酸序列ctrngtqlqnftldrssv(seqidno:130)，其中ctrngtqlqnftldrssv(seqidno:130)的4号氨基酸残基(n4)和10号氨基酸残基(n10)是糖基化的。
[1002]
7.项1-6任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合包含n-糖基化的seqidno:150天冬酰胺1806的表位。
[1003]
8.项1-7任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合氨基酸序列cgtqlqnftldrssv(seqidno:131)，其中cgtqlqnftldrssv(seqidno:131)的7号氨基酸残基(n7)是糖基化的。
[1004]
9.项6-8任一项的抗体或其抗原结合片段，其中糖基化包含n连接的壳二糖。
[1005]
10.项1-9任一项的抗体或其抗原结合片段，其中当表达第一形式的muc16的细胞接触抗体或抗原结合片段时，抗体或其抗原结合片段内化入细胞。
[1006]
11.项10的抗体或其抗原结合片段，其中细胞是重组表达第一形式的muc16的skov3细胞。
[1007]
12.项1-11任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体抑制表达糖基化形式的muc16的肿瘤生长。
[1008]
13.项1-12任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体是单克隆抗体。
[1009]
14.项1-13任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(vh)，其包含
[1010]
(a)vh互补决定区(cdr)1，包含氨基酸序列tx1gmgvg(seqidno:103)，其中x1是l或v，
[1011]
(b)vhcdr2，包含氨基酸序列hiwwddx2dkyyx3palks(seqidno:104)，其中x2是e或不存在且x3是y或n，和
[1012]
(c)vhcdr3，包含氨基酸序列igtaqatdaldy(seqidno:105)。
[1013]
15.项1-13任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含vh，其包含：
[1014]
(a)vh cdr1，包含氨基酸序列gfslx8tx9gm(seq id no:109)，其中x8是n 或s且其中x9是l或v，
[1015]
(b)vh cdr2，包含氨基酸序列wddx10(seq id no:110)，其中x10是e或不 存在，和
[1016]
(c)vh cdr3，包含氨基酸序列gtaqatdald(seq id no:111)。
[1017]
16.项1-13任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vh，其包含：
[1018]
(a)vh cdr1，包含氨基酸序列gfslx15tx16gmg(seq id no:115)，其中x15 是n或s且x16是v或l，
[1019]
(b)vh cdr2，包含氨基酸序列iwwddx17dk(seq id no:116)，其中x17是 e或不存在，和
[1020]
(c)vh cdr3，包含氨基酸序列x18rigtaqatdaldy(seq id no:117)，其中 x18是t，a或s。
[1021]
17.项1-14任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:3的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:4 的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:5的氨基酸序列。
[1022]
18.项1-13或15任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:9的氨基酸序列；vh cdr2，包含seqid no:10的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:11的氨基酸序列。
[1023]
19.项1-13或16任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:15的氨基酸序列；vh cdr2，包含seqid no:16的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:17的氨基酸序列。
[1024]
20.项1-14任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:23的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:24的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:25的氨基酸序列。
[1025]
21.项1-13或15任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:29的氨基酸序列；vh cdr2，包含seqid no:30的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:31的氨基酸序列。
[1026]
22.项1-13或16任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:35的氨基酸序列；vh cdr2，包含seqid no:36的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:37的氨基酸序列。
[1027]
23.项1-14任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:43的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:44的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:45的氨基酸序列。
[1028]
24.项1-13或15任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:49的氨基酸序列；vh cdr2，包含seqid no:50的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:51的氨基酸序列。
[1029]
25.项1-13或16任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:55的氨基酸序列；vh cdr2，包含seqid no:56的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:57的氨基酸序列。
[1030]
26.项1-14任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:63的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq idno:64的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:65的氨基酸序列。
[1031]
27.项1-13或15任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:69的氨基酸序列；vh cdr2，包含seqid no:70的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:71的氨基酸序列。
[1032]
28.项1-13或16任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:75的氨基酸序列；vh cdr2，包含seqid no:76的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:77的氨基酸序列。
[1033]
29.项1-14任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体具有包含下述的vh： vh cdr1，包含seq id no:83的氨基酸序列；vh cdr2，包含seq id no:84的氨基 酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:85的氨基酸序列。
[1034]
30.项1-13或15任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:89的氨基酸序列；vh cdr2，包含seqid no:90的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:91的氨基酸序列。
[1035]
31.项1-13或16任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含：vh cdr1，包含seq id no:95的氨基酸序列；vh cdr2，包含seqid no:96的氨基酸序列；和vh cdr3，包含seq id no:97的氨基酸序列。
[1036]
32.项1-31任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vh，其包含下述氨基酸序列：
[1037]
qvx21lkesgpgx22lqpsqtlsltcsfsgfslx23tx24gmgvgwx25rqx26sgkgl ewlahiwwddx27dkyyx28palksrltisx29x30x31sknqvflkix32nvx33tad x34atyycx35rigtaqatdaldywgqgtsvtvss(seq id no:101)，其中x21是t 或n，x22是i或k，x23是n或s，x24是v或l，x25是s或i，x26是p或s， x27是e或不存在，x28是n或y，x29是k或r，x30是a或d，x31是t或s， x32是v或a，x33是g或d，x34是t，i或s且x35是t，s或a。
[1038]
33.项1-19或32任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段 包含vh，其包含seq id no:1的氨基酸序列。
[1039]
34.项1-16、20-22或32任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原 结合片段包含vh，其包含seq id no:21的氨基酸序列。
[1040]
35.项1-16、23-25或32任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原 结合片段包含vh，其包含seq id no:41的氨基酸序列。
[1041]
36.项1-16、26-28或32任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原 结合片段包含vh，其包含seq id no:61的氨基酸序列。
[1042]
37.项1-16或29-32任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合 片段包含vh，其包含seq id no:81的氨基酸序列。
[1043]
38.项1-37任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 轻链可变区(vl)，其包含
[1044]
(a)vl cdr1，包含氨基酸序列rsskslx4x5sngntyly(seq id no:106)，其 中x4是r或l且x5是k或h，
[1045]
(b)vl cdr2，包含氨基酸序列ymsnlas(seq id no:107)，和
[1046]
(c)vl cdr3，包含氨基酸序列mqx6lex7plt(seq id no:108)，其中x6是g 或s且x7是h或y。
[1047]
39.项1-37任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vl，其包含：
[1048]
(a)vl cdr1，包含氨基酸序列kslx11x12sngnty(seq id no:112)，其中x11 是l或r且x12是h或k，
[1049]
(b)vl cdr2，包含氨基酸序列yms(seq id no:113)，和
[1050]
(c)vl cdr3，包含氨基酸序列x13lex14pl(seq id no:114)，其中x13是g 或s且x14是h或y。
[1051]
40.项1-37任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vl，其包含：
[1052]
(a)vl cdr1，包含氨基酸序列kslx19x20sngnty(seq id no:118)，其中x19 是v或l且x20是h或k，
[1053]
(b)vl cdr2，包含氨基酸序列yms(seq id no:119)，和
[1054]
(c)vl cdr3，包含氨基酸序列mqsleyplt(seq id no:120)。
[1055]
41.项1-38任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 轻链可变区(vl)，其包含vl cdr1，包含seq id no:26的氨基酸序列；vl cdr2，包 含seq id no:27的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:28的氨基酸序列。
[1056]
42.项1-37或39的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vl，其包含：vl cdr1，包含seq id no:32的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:33的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:34的氨基酸序列。
[1057]
43.项1-37或40的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vl，其包含：vl cdr1，包含seq id no:38的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:39的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:40的氨基酸序列。
[1058]
44.项1-38任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 轻链可变区(vl)，其包含vl cdr1，包含seq id no:46的氨基酸序列；vl cdr2，包 含seq id no:47的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:48的氨基酸序列。
[1059]
45.项1-37或39的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vl，其包含：vl cdr1，包含seq id no:52的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:53的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:54的氨基酸序列。
[1060]
46.项1-37或40的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vl，其包含：vl cdr1，包含seq id no:58的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:59的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:60的氨基酸序列。
[1061]
47.项1-38任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 轻链可变区(vl)，其包含vl cdr1，包含seq id no:86的氨基酸序列；vl cdr2，包 含seq id no:87的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:88的氨基酸序列。
[1062]
48.项1-37或39的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vl，其包含：vl cdr1，包含seq id no:92的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:93的氨基酸
序列；和vl cdr3，包含seq id no:94的氨基酸序列。
[1063]
49.项1-37或40的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vl，其包含：vl cdr1，包含seq id no:98的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq idno:99的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:100的氨基酸序列。
[1064]
50.项1-37任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 轻链可变区(vl)，其包含vl cdr1，包含seq id no:6的氨基酸序列；vl cdr2，包 含seq id no:7的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:8的氨基酸序列。
[1065]
51.项1-37的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含vl，其 包含：vl cdr1，包含seq id no:12的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq id no:13 的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:14的氨基酸序列。
[1066]
52.项1-37的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含vl，其 包含：vl cdr1，包含seq id no:18的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq id no:19 的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:20的氨基酸序列。
[1067]
53.项1-37任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 轻链可变区(vl)，其包含vl cdr1，包含seq id no:66的氨基酸序列；vl cdr2，包 含seq id no:67的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:68的氨基酸序列。
[1068]
54.项1-37的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含vl，其 包含：vl cdr1，包含seq id no:72的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq id no:73 的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:74的氨基酸序列。
[1069]
55.项1-37的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含vl，其 包含：vl cdr1，包含seq id no:78的氨基酸序列；vl cdr2，包含seq id no:79 的氨基酸序列；和vl cdr3，包含seq id no:80的氨基酸序列。
[1070]
56.项1-49任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vl，其包含下述氨基酸序列：
[1071]
divmtqaapsx36x37vtpgesvsiscrsskslx38x39sngntylywflqrpgqspqrl iyymsnlasgvpdrfsgrgsgtdftlx40isrveax41dvgvyycmqx42lex43pltf gggtkleik(seq id no:102)，其中x36是i或v，x37是p或s，x38是r或l， x39是k或h，x40是r或k，x41是e或g，x42是s或g且x43是y或h。
[1072]
57.项1-43任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含 vl，其包含seq id no:22的氨基酸序列。
[1073]
58.项1-40或44-46任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合 片段包含vl，其包含seq id no:42的氨基酸序列。
[1074]
59.项1-40或47-49任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合 片段包含vl，其包含seq id no:82的氨基酸序列。
[1075]
60.项1-37或50-52任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合 片段包含vl，其包含seq id no:2的氨基酸序列。
[1076]
61.项1-37或53-55任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合 片段包含vl，其包含seq id no:62的氨基酸序列。
[1077]
62.免疫特异性结合muc16的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合 片
段包含vh，其vh包含：
[1078]
(a)vhcdr1，包含氨基酸序列tx1gmgvg(seqidno:103)，其中x1是l或v；vhcdr2，包含氨基酸序列hiwwddx2dkyyx3palks(seqidno:104)，其中x2是e或不存在且x3是y或n；和vhcdr3，包含氨基酸序列igtaqatdaldy(seqidno:105)，或
[1079]
(b)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx8tx9gm(seqidno:109)，其中x8是n或s且其中x9是l或v；vhcdr2，包含氨基酸序列wddx10(seqidno:110)，其中x10是e或不存在；和vhcdr3，包含氨基酸序列gtaqatdald(seqidno:111)，或
[1080]
(c)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx15tx16gmg(seqidno:115)，其中x15是n或s且x16是v或l；vhcdr2，包含氨基酸序列iwwddx17dk(seqidno:116)，其中x17是e或不存在；和vhcdr3，包含氨基酸序列x18rigtaqatdaldy(seqidno:117)，其中x18是t，a或s，或
[1081]
(d)vhcdr1，包含seqidno:3的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:4的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:5的氨基酸序列，或
[1082]
(e)vhcdr1，包含seqidno:9的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:10的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:11的氨基酸序列，或
[1083]
(f)vhcdr1，包含seqidno:15的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:16的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:17的氨基酸序列，或
[1084]
(g)vhcdr1，包含seqidno:23的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:24的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:25的氨基酸序列，或
[1085]
(h)vhcdr1，包含seqidno:29的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:30的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:31的氨基酸序列，或
[1086]
(i)vhcdr1，包含seqidno:35的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:36的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:37的氨基酸序列，或
[1087]
(j)vhcdr1，包含seqidno:43的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:44的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:45的氨基酸序列，或
[1088]
(k)vhcdr1，包含seqidno:49的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:50的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:51的氨基酸序列，或
[1089]
(l)vhcdr1，包含seqidno:55的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:56的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:57的氨基酸序列，或
[1090]
(m)vhcdr1，包含seqidno:63的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:64的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:65的氨基酸序列，或
[1091]
(n)vhcdr1，包含seqidno:69的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:70的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:71的氨基酸序列，或
[1092]
(o)vhcdr1，包含seqidno:75的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:76的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:77的氨基酸序列，或
[1093]
(p)vhcdr1，包含seqidno:83的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:84的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:85的氨基酸序列，或
[1094]
(q)vhcdr1，包含seqidno:89的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:90的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:91的氨基酸序列，或
[1095]
(r)vhcdr1，包含seqidno:95的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:96的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:97的氨基酸序列。
[1096]
63.免疫特异性结合muc16的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含vl，其vl包含：
[1097]
(a)vlcdr1，包含氨基酸序列rsskslx4x5sngntyly(seqidno:106)，其中x4是r或l且x5是k或h；vlcdr2，包含氨基酸序列ymsnlas(seqidno:107)；和vlcdr3，包含氨基酸序列mqx6lex7plt(seqidno:108)，其中x6是g或s且x7是h或y，或
[1098]
(b)vlcdr1，包含氨基酸序列kslx11x12sngnty(seqidno:112)，其中x11是l或r且x12是h或k；vlcdr2，包含氨基酸序列yms(seqidno:113)；和vlcdr3，包含氨基酸序列x13lex14pl(seqidno:114)，其中x13是g或s且x14是h或y，或
[1099]
(c)vlcdr1，包含氨基酸序列kslx19x20sngnty(seqidno:118)，其中x19是v或l且x20是h或k；vlcdr2，包含氨基酸序列yms(seqidno:119)；和vlcdr3，包含氨基酸序列mqsleyplt(seqidno:120)，或
[1100]
(d)vlcdr1，包含seqidno:26的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:27的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:28的氨基酸序列，或
[1101]
(e)vlcdr1，包含seqidno:32的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:33的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:34的氨基酸序列，或
[1102]
(f)vlcdr1，包含seqidno:38的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:39的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:40的氨基酸序列，或
[1103]
(g)vlcdr1，包含seqidno:46的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:47的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:48的氨基酸序列，或
[1104]
(h)vlcdr1，包含seqidno:52的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:53的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:54的氨基酸序列，或
[1105]
(i)vlcdr1，包含seqidno:58的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:59的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:60的氨基酸序列，或
[1106]
(j)vlcdr1，包含seqidno:86的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:87的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:88的氨基酸序列，或
[1107]
(k)vlcdr1，包含seqidno:92的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:93的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:94的氨基酸序列，或
[1108]
(l)vlcdr1，包含seqidno:98的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:99的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:100的氨基酸序列，或
[1109]
(m)vlcdr1，包含seqidno:6的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:7的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:8的氨基酸序列，或
[1110]
(n)vlcdr1，包含seqidno:12的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:13的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:14的氨基酸序列，或
[1111]
(o)vlcdr1，包含seqidno:18的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:19的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:20的氨基酸序列，或
[1112]
(p)vlcdr1，包含seqidno:66的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:67的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:68的氨基酸序列，或
[1113]
(q)vlcdr1，包含seqidno:72的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:73的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:74的氨基酸序列，或
[1114]
(r)vlcdr1，包含seqidno:78的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:79的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:80的氨基酸序列。
[1115]
64.免疫特异性结合muc16的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：
[1116]
(a)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含氨基酸序列tx1gmgvg(seqidno:103)，其中x1是l或v；vhcdr2，包含氨基酸序列hiwwddx2dkyyx3palks(seqidno:104)，其中x2是e或不存在且x3是y或n；和vhcdr3，包含氨基酸序列igtaqatdaldy(seqidno:105)，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含氨基酸序列rsskslx4x5sngntyly(seqidno:106)，其中x4是r或l且x5是k或h；vlcdr2，包含氨基酸序列ymsnlas(seqidno:107)；和vlcdr3，包含氨基酸序列mqx6lex7plt(seqidno:108)，其中x6是g或s且x7是h或y或
[1117]
(b)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx8tx9gm(seqidno:109)，其中x8是n或s且其中x9是l或v；vhcdr2，包含氨基酸序列wddx10(seqidno:110)，其中x10是e或不存在；和vhcdr3，包含氨基酸序列gtaqatdald(seqidno:111)，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含氨基酸序列kslx11x12sngnty(seqidno:112)，其中x11是l或r且x12是h或k；vlcdr2，包含氨基酸序列yms(seqidno:113)；和vlcdr3，包含氨基酸序列x13lex14pl(seqidno:114)，其中x13是g或s且x14是h或y，或
[1118]
(c)(i)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx15tx16gmg(seqidno:115)，其中x15是n或s且x16是v或l；vhcdr2，包含氨基酸序列iwwddx17dk(seqidno:116)，其中x17是e或不存在；和vhcdr3，包含氨基酸序列x18rigtaqatdaldy(seqidno:117)，其中x18是t，a或s，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含氨基酸序列kslx19x20sngnty(seqidno:118)，其中x19是v或l且x20是h或k；vlcdr2，包含氨基酸序列yms(seqidno:119)；和vlcdr3，包含氨基酸序列mqsleyplt(seqidno:120)，或
[1119]
(d)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:23的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:24的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:25的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:26的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:27的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:28的氨基酸序列，或
[1120]
(e)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:29的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:30的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:31的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:32的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:33的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:34的氨基酸序列，或
[1121]
(f)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:35的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:36的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:37的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:38的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:39的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:40的氨基酸序列，或
[1122]
(g)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:43的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:44的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:45的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:46的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:47的氨基酸
序列；和vlcdr3，包含seqidno:48的氨基酸序列，或
[1123]
(h)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:49的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:50的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:51的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:52的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:53的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:54的氨基酸序列，或
[1124]
(i)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:55的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:56的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:57的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:58的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:59的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:60的氨基酸序列，或
[1125]
(j)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:83的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:84的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:85的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:86的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:87的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:88的氨基酸序列，或
[1126]
(k)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:89的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:90的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:91的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:92的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:93的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:94的氨基酸序列，或
[1127]
(l)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:95的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:96的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:97的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:98的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:99的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:100的氨基酸序列，或
[1128]
(m)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:3的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:4的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:5的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:6的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:7的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:8的氨基酸序列，或
[1129]
(n)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:9的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:10的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:11的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:12的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:13的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:14的氨基酸序列，或
[1130]
(o)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:15的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:16的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:17的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:18的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:19的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:20的氨基酸序列，或
[1131]
(p)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:63的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:64的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:65的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:66的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:67的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:68的氨基酸序列，或
[1132]
(q)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:69的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:70的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:71的氨基酸序列，和(ii)包含下
述的vl：vlcdr1，包含seqidno:72的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:73的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:74的氨基酸序列，或
[1133]
(r)(i)包含下述的vh：vhcdr1，包含seqidno:75的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:76的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:77的氨基酸序列，和(ii)包含下述的vl：vlcdr1，包含seqidno:78的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:79的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:80的氨基酸序列。
[1134]
65.免疫特异性结合muc16的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含：
[1135]
(a)(i)包含下述氨基酸序列的vh：
[1136]
qvx21lkesgpgx22lqpsqtlsltcsfsgfslx23tx24gmgvgwx25rqx26sgkglewlahiwwddx27dkyyx28palksrltisx29x30x31sknqvflkix32nvx33tadx34atyycx35rigtaqatdaldywgqgtsvtvss(seqidno:101)，其中x21是t或n，x22是i或k，x23是n或s，x24是v或l，x25是s或i，x26是p或s，x27是e或不存在，x28是n或y，x29是k或r，x30是a或d，x31是t或s，x32是v或a，x33是g或d，x34是t，i或s且x35是t，s或a，和(ii)包含下述氨基酸序列的vl：
[1137]
divmtqaapsx36x37vtpgesvsiscrsskslx38x39sngntylywflqrpgqspqrliyymsnlasgvpdrfsgrgsgtdftlx40isrveax41dvgvyycmqx42lex43pltfgggtkleik(seqidno:102)，其中x36是i或v，x37是p或s，x38是r或l，x39是k或h，x40是r或k，x41是e或g，x42是s或g且x43是y或h，或
[1138]
(b)(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的vh，和(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的vl，
[1139]
(c)(i)包含seqidno:21的氨基酸序列的vh，和(ii)包含seqidno:22的氨基酸序列的vl，或
[1140]
(d)(i)包含seqidno:41的氨基酸序列的vh，和(ii)包含seqidno:42的氨基酸序列的vl，或
[1141]
(e)(i)包含seqidno:61的氨基酸序列的vh，和(ii)包含seqidno:62的氨基酸序列的vl，或
[1142]
(f)(i)包含seqidno:81的氨基酸序列的vh，和(ii)包含seqidno:82的氨基酸序列的vl。
[1143]
66.项14-65任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含人源的重链和轻链恒定区。
[1144]
67.项66的抗体或其抗原结合片段，其中重链恒定区具有选自γ1、γ2、γ3和γ4的同种型。
[1145]
68.项66或67的抗体或其抗原结合片段，其中轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。
[1146]
69.项1-31、38-55或62-64任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是人源化的。
[1147]
70.项69的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是人源化形式的啮齿类抗体。
[1148]
71.项1-70任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体是包含两条相同重链和两
条相同轻链的免疫球蛋白。
[1149]
72.项71的抗体或其抗原结合片段，其中免疫球蛋白是igg。
[1150]
73.抗体缀合物，包含缀合至试剂的项1-72任一项的抗体或其抗原结合片段。
[1151]
74.项73的抗体缀合物，其中试剂是显影剂或细胞毒性剂。
[1152]
75.项1-70任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。
[1153]
76.项75的双特异性抗体，其中双特异性抗体免疫特异性结合cd3。
[1154]
77.项75或76的双特异性抗体，其中双特异性抗体包含免疫特异性结合muc16的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白轻链通过肽接头缀合至免疫特异性结合cd3的单链可变区片段(scfv)。
[1155]
78.双特异性抗体缀合物，包含缀合至试剂的项75-77任一项的双特异性抗体。
[1156]
79.项78的双特异性抗体缀合物，其中试剂是显影剂或细胞毒性剂。
[1157]
80.项1-70任一项的抗体或其抗原结合片段，其中其抗原结合片段是scfv。
[1158]
81.scfv缀合物，包含缀合至试剂的项80的scfv。
[1159]
82.项81的scfv缀合物，其中试剂是显影剂或细胞毒性剂。
[1160]
83.嵌合抗原受体(car)，包含项1-72任一项的抗体或抗原结合片段，或项80的scfv，或项81或82的scfv缀合物。
[1161]
84.抗体重链或其抗原结合部分，其中重链或其抗原结合部分包含vh，其vh包含：
[1162]
(i)(a)vh互补决定区(cdr)1，包含氨基酸序列tx1gmgvg(seqidno:103)，其中x1是l或v，
[1163]
(b)vhcdr2，包含氨基酸序列hiwwddx2dkyyx3palks(seqidno:104)，其中x2是e或不存在且x3是y或n，和
[1164]
(c)vhcdr3，包含氨基酸序列igtaqatdaldy(seqidno:105)；其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1165]
或
[1166]
(ii)(a)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx8tx9gm(seqidno:109)，其中x8是n或s且x9是l或v，
[1167]
(b)vhcdr2，包含氨基酸序列wddx10(seqidno:110)，其中x10是e或不存在，和
[1168]
(c)vhcdr3，包含氨基酸序列gtaqatdald(seqidno:111)，
[1169]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1170]
或
[1171]
(iii)(a)vhcdr1，包含氨基酸序列gfslx15tx16gmg(seqidno:115)，其中x15是n或s且x16是v或l，
[1172]
(b)vhcdr2，包含氨基酸序列iwwddx17dk(seqidno:116)，其中x17是e或不存在，和
[1173]
(c)vhcdr3，包含氨基酸序列x18rigtaqatdaldy(seqidno:117)，其中x18是t，a或s，
[1174]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1175]
或
[1176]
(iv)vhcdr1，包含seqidno:3的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:4的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:5的氨基酸序列，
[1177]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1178]
或
[1179]
(v)vhcdr1，包含seqidno:9的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:10的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:11的氨基酸序列，
[1180]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭，
[1181]
或
[1182]
(vi)vhcdr1，包含seqidno:15的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:16的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:17的氨基酸序列，
[1183]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭，
[1184]
或
[1185]
(vii)vhcdr1，包含seqidno:23的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:24的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:25的氨基酸序列，
[1186]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫
特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1187]
或
[1188]
(viii)vhcdr1，包含seqidno:29的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:30的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:31的氨基酸序列，
[1189]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1190]
或
[1191]
(ix)vhcdr1，包含seqidno:35的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:36的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:37的氨基酸序列，
[1192]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1193]
或
[1194]
(x)vhcdr1，包含seqidno:43的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:44的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:45的氨基酸序列，
[1195]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1196]
或
[1197]
(xi)vhcdr1，包含seqidno:49的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:50的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:51的氨基酸序列，
[1198]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1199]
或
[1200]
(xii)vhcdr1，包含seqidno:55的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:56的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:57的氨基酸序列，
[1201]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1202]
或
[1203]
(xiii)vhcdr1，包含seqidno:63的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:64的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:65的氨基酸序列，
[1204]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1205]
或
[1206]
(xiv)vhcdr1，包含seqidno:69的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:70的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:71的氨基酸序列，
[1207]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1208]
或
[1209]
(xv)vhcdr1，包含seqidno:75的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:76的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:77的氨基酸序列，
[1210]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1211]
或
[1212]
(xvi)vhcdr1，包含seqidno:83的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:84的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:85的氨基酸序列，
[1213]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭，
[1214]
或
[1215]
(xvii)vhcdr1，包含seqidno:89的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:90的
氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:91的氨基酸序列，
[1216]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1217]
或
[1218]
(xviii)vhcdr1，包含seqidno:95的氨基酸序列；vhcdr2，包含seqidno:96的氨基酸序列；和vhcdr3，包含seqidno:97的氨基酸序列，
[1219]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
[1220]
85.抗体重链或其抗原结合部分，其中重链或其抗原结合部分包含vh，其包含：
[1221]
(i)氨基酸序列
[1222]
qvx21lkesgpgx22lqpsqtlsltcsfsgfslx23tx24gmgvgwx25rqx26sgkglewlahiwwddx27dkyyx28palksrltisx29x30x31sknqvflkix32nvx33tadx34atyycx35rigtaqatdaldywgqgtsvtvss(seqidno:101)，其中x21是t或n，x22是i或k，x23是n或s，x24是v或l，x25是s或i，x26是p或s，x27是e或不存在，x28是n或y，x29是k或r，x30是a或d，x31是t或s，x32是v或a，x33是g或d，x34是t，i或s且x35是t，s或a，
[1223]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1224]
或
[1225]
(ii)seqidno:1的氨基酸序列，
[1226]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭，
[1227]
或
[1228]
(iii)seqidno:21的氨基酸序列，
[1229]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)
抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1230]
或
[1231]
(iv)seqidno:41的氨基酸序列，
[1232]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1233]
或
[1234]
(v)seqidno:61的氨基酸序列，
[1235]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭，
[1236]
或
[1237]
(vi)seqidno:81的氨基酸序列，
[1238]
其中，可选的，包含抗体重链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
[1239]
86.项84或85的抗体重链或其抗原结合部分，其中抗体重链或其抗原结合部分包含人源的重链恒定区。
[1240]
87.项86的抗体重链或其抗原结合部分，其中重链或其抗原结合部分恒定区具有选自γ1、γ2、γ3和γ4的同种型。
[1241]
88.项85的抗体重链或其抗原结合部分，其中所述抗体重链或其抗原结合部分是人源化的。
[1242]
89.项88的抗体重链或其抗原结合部分，其中所述抗体重链或其抗原结合部分是人源化的形式的啮齿类重链。
[1243]
90.抗体重链缀合物，包含项84-89任一项的抗体重链或其抗原结合部分，其中所述抗体重链或其抗原结合部分缀合试剂。
[1244]
91.项90的抗体重链缀合物，其中试剂是显影剂或细胞毒性剂。
[1245]
92.抗体轻链或其抗原结合部分，其中轻链或其抗原结合部分包含vl，其包含：
[1246]
(i)(a)vlcdr1，包含氨基酸序列rsskslx4x5sngntyly(seqidno:106)，其中x4是r或l且x5是k或h，
[1247]
(b)vlcdr2，包含氨基酸序列ymsnlas(seqidno:107)，和
[1248]
(c)vlcdr3，包含氨基酸序列mqx6lex7plt(seqidno:108)，其中x6是g或s且x7是h或y，
[1249]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1250]
或
[1251]
(ii)(a)vlcdr1，包含氨基酸序列kslx11x12sngnty(seqidno:112)，其中x11是l或r且x12是h或k，
[1252]
(b)vlcdr2，包含氨基酸序列yms(seqidno:113)，和
[1253]
(c)vlcdr3，包含氨基酸序列x13lex14pl(seqidno:114)，其中x13是g或s且x14是h或y，
[1254]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭，
[1255]
或
[1256]
(iii)(a)vlcdr1，包含氨基酸序列kslx19x20sngnty(seqidno:118)，其中x19是v或l且x20是h或k，
[1257]
(b)vlcdr2，包含氨基酸序列yms(seqidno:119)，和
[1258]
(c)vlcdr3，包含氨基酸序列mqsleyplt(seqidno:120)，
[1259]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1260]
或
[1261]
(iv)vlcdr1，包含seqidno:6的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:7的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:8的氨基酸序列，
[1262]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1263]
或
[1264]
(v)vlcdr1，包含seqidno:12的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:13的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:14的氨基酸序列，
[1265]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式
的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1266]
或
[1267]
(vi)vlcdr1，包含seqidno:18的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:19的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:20的氨基酸序列，
[1268]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭，
[1269]
或
[1270]
(vii)vlcdr1，包含seqidno:26的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:27的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:28的氨基酸序列，
[1271]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1272]
或
[1273]
(viii)vlcdr1，包含seqidno:32的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:33的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:34的氨基酸序列，
[1274]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭，
[1275]
或
[1276]
(vix)vlcdr1，包含seqidno:38的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:39的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:40的氨基酸序列，
[1277]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭，
[1278]
或
[1279]
(x)vlcdr1，包含seqidno:46的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:47的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:48的氨基酸序列，
[1280]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫
特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1281]
或
[1282]
(xi)vlcdr1，包含seqidno:52的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:53的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:54的氨基酸序列，
[1283]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1284]
或
[1285]
(xii)vlcdr1，包含seqidno:58的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:59的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:60的氨基酸序列，
[1286]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1287]
或
[1288]
(xiii)vlcdr1，包含seqidno:66的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:67的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:68的氨基酸序列，
[1289]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1290]
或
[1291]
(xiv)vlcdr1，包含seqidno:72的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:73的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:74的氨基酸序列，
[1292]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1293]
或
[1294]
(xv)vlcdr1，包含seqidno:78的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:79的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:80的氨基酸序列，
[1295]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1296]
或
[1297]
(xvi)vlcdr1，包含seqidno:86的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:87的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:88的氨基酸序列，
[1298]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1299]
或
[1300]
(xvii)vlcdr1，包含seqidno:92的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:93的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:94的氨基酸序列，
[1301]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭，
[1302]
或
[1303]
(xviii)vlcdr1，包含seqidno:98的氨基酸序列；vlcdr2，包含seqidno:99的氨基酸序列；和vlcdr3，包含seqidno:100的氨基酸序列，
[1304]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
[1305]
93.抗体轻链，其中轻链包含vl，其包含：
[1306]
(i)氨基酸序列
[1307]
divmtqaapsx36x37vtpgesvsiscrsskslx38x39sngntylywflqrpgqspqrliyymsnlasgvpdrfsgrgsgtdftlx40isrveax41dvgvyycmqx42lex43pltfgggtkleik(seqidno:102)，其中x36是i或v，x37是p或s，x38是r或l，x39是k或h，x40是r或k，x41是e或g，x42是s或g且x43是y或h，
[1308]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)
抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1309]
或
[1310]
(ii)seqidno:2的氨基酸序列，
[1311]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1312]
或
[1313]
(iii)seqidno:22的氨基酸序列，
[1314]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1315]
或
[1316]
(iv)seqidno:42的氨基酸序列，
[1317]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1318]
或
[1319]
(v)seqidno:62的氨基酸序列，
[1320]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭；
[1321]
或
[1322]
(vi)seqidno:82的氨基酸序列，
[1323]
其中，可选的，包含抗体轻链或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段(i)免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seqidno:133；(ii)不能免疫特异性结合重组表达第二形式的muc16的细胞，其第二形式是未糖基化的，且其中第二形式的氨基酸序列是seqidno:139；并(iii)抑制重组表达所述第一形式的muc16的细胞的体外基质胶侵袭。
[1324]
94.项92或93的抗体轻链或其抗原结合部分，其中抗体轻链或其抗原结合部分包含人源的轻链恒定区。
[1325]
95.项94的抗体轻链或其抗原结合部分，其中轻链或其抗原结合部分恒定区具有
选自κ和λ的同种型。
[1326]
96.项92的抗体轻链或其抗原结合部分，其中所述抗体轻链或其抗原结合部分是人源化的。
[1327]
97.项96的抗体轻链或其抗原结合部分，其中所述抗体轻链或其抗原结合部分是人源化的形式的啮齿类抗体。
[1328]
98.抗体轻链缀合物，包含缀合至试剂的项92-97任一项的抗体轻链或其抗原结合部分。
[1329]
99.项98的抗体轻链缀合物，其中试剂是显影剂或细胞毒性剂。
[1330]
100.融合蛋白，包含通过肽接头缀合至scfv的项92-99任一项的抗体轻链。
[1331]
101.项100的融合蛋白，其中scfv结合cd3。
[1332]
102.重组表达项83的car的t细胞。
[1333]
103.一种多核苷酸，其包含编码项80的scfv的核酸序列。
[1334]
104.一种多核苷酸，其包含编码项81或82的scfv缀合物的核酸序列。
[1335]
105.一种多核苷酸，其包含编码项83的car的核酸序列。
[1336]
106.一种多核苷酸，其包含编码项84-89任一项的抗体重链的核酸序列。
[1337]
107.一种多核苷酸，其包含编码项90或91的抗体重链缀合物的核酸序列。
[1338]
108.一种多核苷酸，其包含编码项92-97任一项的抗体轻链的核酸序列。
[1339]
109.一种多核苷酸，其包含编码项98或99的抗体轻链缀合物的核酸序列。
[1340]
110.一种多核苷酸，其包含编码项100或101的融合蛋白的核酸序列。
[1341]
111.一种多核苷酸，其包含编码(a)项84-89任一项的抗体重链或项90或91的抗体重链缀合物；和(b)项92-97任一项的抗体轻链，项98或99的抗体轻链缀合物或项100或101的融合蛋白的核酸序列。
[1342]
112.载体，其包含可操作地连接启动子的项103-110任一项的多核苷酸。
[1343]
113.载体，其包含(a)可操作地连接第一启动子的项106或107的多核苷酸和(b)可操作地连接第二启动子的项108-110任一项的多核苷酸。
[1344]
114.离体细胞，包含可操作地连接启动子的项103-105任一项的多核苷酸。
[1345]
115.离体细胞，包含可操作地连接启动子的项106或107的多核苷酸。
[1346]
116.离体细胞，包含可操作地连接启动子的项108-110任一项的多核苷酸。
[1347]
117.离体细胞，包含项112的载体。
[1348]
118.离体细胞，包含项113的载体。
[1349]
119.离体细胞，包含可操作地连接启动子的一种或多种编码项1-72任一项的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
[1350]
120.一种生产抗体重链的方法，包括在细胞表达多核苷酸以产生多核苷酸编码的抗体重链或抗体重链缀合物的条件下培养项115的细胞。
[1351]
121.一种生产抗体轻链的方法，包括在细胞表达多核苷酸以产生多核苷酸编码的抗体轻链，抗体轻链缀合物或融合蛋白的条件下培养项116的细胞。
[1352]
122.一种生产抗体或其抗原结合片段的方法，包括在细胞表达可操作地连接第一启动子的多核苷酸和可操作地连接第二启动子的多核苷酸以产生(i)多核苷酸编码的抗体重链或抗体重链缀合物和(ii)多核苷酸编码的抗体轻链、抗体轻链缀合物或融合蛋白
的条件下培养项118的离体细胞。
[1353]
123.药物组合物，包含：治疗有效量的项1-72任一项的抗体或其抗原结合片段， 项73或74的抗体缀合物，项75-77任一项的双特异性抗体，项78或79的双特异性抗 体缀合物，项80的scfv，项81或82的scfv缀合物，项83的car，项84-89任一项 的抗体重链，项90或91的抗体重链缀合物，项92-97任一项的抗体轻链，项98或99 的抗体轻链缀合物，项100或101的融合蛋白或项102的t细胞；和药学上可接受的载 体。
[1354]
124.在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括对所述患者施用项123的药物组合 物。
[1355]
125.项124的方法，其中所述癌症是肺癌，胰腺癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌 或原发性腹膜癌的癌症。
[1356]
126.项124或125的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
[1357]
127.项124-126任一项的方法，其中所述患者是人患者。
[1358]
128.项124-127任一项的方法，其中该方法进一步包括对患者施用治疗有效量的 另外的治疗剂。
[1359]
129.项128的方法，其中药物组合物包含治疗有效量的第一抗体，所述第一抗体 是项1-72任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段识别muc16中 的表位，所述表位包含n-糖基化的seq id no:150的asn1806但不包含n-糖基化的seqid no:150的asn1800，其中另外的治疗剂是第二抗体或其抗原结合片段，其中第二抗 体或其抗原结合片段识别muc16中的表位，所述表位包含n-糖基化的seq id no:150 的asn1806，也包含n-糖基化的seq id no:150的asn1800。
[1360]
130.项129的方法，其中第一抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其 免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞的能力，其第一形式的muc16是 糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)其不能免疫特异性结 合重组表达第三形式的muc16的细胞，该第三形式是糖基化的，其中第三形式的氨基 酸序列是seq id no:139；和(iii)其免疫特异性结合重组表达第四形式的muc16的细 胞的能力，其第四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是seq id no:152且 其中重组表达第一形式的muc16的细胞、重组表达第三形式的muc16的细胞和重组 表达第四形式的muc16的细胞是相同细胞类型和
[1361]
其中第二抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组 表达第一形式的muc16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨 基酸序列是seq id no:133和(ii)其不能免疫特异性结合重组表达第五形式的muc16 的细胞，其第五形式是糖基化的，且其中第五形式的氨基酸序列是seq id no:172，其 中重组表达第一形式的muc16的细胞与重组表达第五形式的muc16的细胞是相同细 胞类型。
[1362]
131.项128的方法，其中药物组合物包含治疗有效量的第一抗体或其抗原结合片 段，其是项1-72任一项的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段识别
[1363]
muc16中的表位，所述表位包含n-糖基化的seq id no:150的asn1806但不包含n
‑ꢀ
糖基化的seq id no:150的asn1800、其中另外的治疗剂是治疗有效量的第二抗体或其 抗原结合片段，其中第二抗体或其抗原结合片段识别muc16中的表位，所述表位包含 n-糖基化的seq id no:150的asn1800但不包含n-糖基化的seq id no:150的 asn1806。
[1364]
132.项131的方法，其中第一抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其 免疫特异性结合重组表达第一形式的muc16的细胞的能力，其第一形式的muc16是 糖基化的，且其中第一形式的氨基酸序列是seq id no:133；(ii)其不能免疫特异性结 合重组表达第三形式的muc16的细胞，该第三形式是糖基化的，且其中第三形式的氨 基酸序列是seq id no:139；和(iii)其免疫特异性结合重组表达第四形式的muc16的 细胞的能力，其第四形式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是seq id no:152， 其中重组表达第一形式的muc16的细胞、重组表达第三形式的muc16的细胞和重组 表达第四形式的muc16的细胞是相同细胞类型，和
[1365]
其中第二抗体或其抗原结合片段通过下述进行鉴定：(i)其免疫特异性结合重组 表达第一形式的muc16的细胞的能力，其第一形式是糖基化的，且其中第一形式的氨 基酸序列是seq id no:133；(ii)其免疫特异性结合重组表达第三形式的muc16的细 胞的能力，该第三形式的muc16是糖基化的，且其中第三形式的氨基酸序列是seq idno:139；和(iii)其不能免疫特异性结合重组表达第四形式的muc16的细胞，其第四形 式是糖基化的，且其中第四形式的氨基酸序列是seq id no:152且其中重组表达第一形 式的muc16的细胞、重组表达第三形式的muc16的细胞和重组表达第四形式的 muc16的细胞是相同类型的细胞。
[1366]
133.免疫原性糖肽，包含一个或多个糖基化位点，其中(i)免疫原性糖肽是10-60 个氨基酸残基、10-30个氨基酸残基、15-25个氨基酸残基、15-20个氨基酸残基或15-18 个氨基酸残基长；且(ii)该一个或多个糖基化位点的至少一个连接碳水化合物。
[1367]
134.项133的免疫原性糖肽，其包含1、2或3个糖基化位点。
[1368]
135.项133的免疫原性糖肽，其包含连接碳水化合物的糖基化位点。
[1369]
136.项133的免疫原性糖肽，其包含两个分别连接碳水化合物的糖基化位点。
[1370]
137.项133-136任一项的免疫原性糖肽，其中碳水化合物是n或o连接的碳水 化合物。
[1371]
138.项133-137任一项的免疫原性糖肽，其中碳水化合物是单糖、二糖、三糖、 四糖或五糖。
[1372]
139.项133-137任一项的免疫原性糖肽，其中碳水化合物是二糖。
[1373]
140.项139的免疫原性糖肽，其中二糖是壳二糖。
[1374]
141.项133-140任一项的免疫原性糖肽，其中免疫原性糖肽的n端是乙酰化的。
[1375]
142.项133-141任一项的免疫原性糖肽，其中糖肽的c端是n-甲基甲酰胺衍生 物的形式。
[1376]
143.项133-142任一项的免疫原性糖肽，其缀合免疫原性载体蛋白。
[1377]
144.项143的免疫原性糖肽，其中免疫原性载体蛋白是钥孔戚血蓝素。
[1378]
145.项133-144任一项的免疫原性糖肽，其是15-18个氨基酸残基长。
[1379]
146.项145的免疫原性糖肽，其包含连接壳二糖的糖基化位点。
[1380]
147.项145的免疫原性糖肽，其包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
[1381]
148.项133-144任一项的免疫原性糖肽，其是18个氨基酸残基长。
[1382]
149.项148的免疫原性糖肽，其包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
[1383]
150.项133-144任一项的免疫原性糖肽，其是15个氨基酸残基长。
[1384]
151.项150的免疫原性糖肽，其包含连接壳二糖的糖基化位点。
[1385]
152.项133-151任一项的免疫原性糖肽，其包含seq id no:150的氨基酸序列的 至少10个氨基酸的部分，其中该一个或多个糖基化位点的至少一个位于所述氨基酸序 列部分之内。
[1386]
153.项152的免疫原性糖肽，其包含seq id no:129的氨基酸序列。
[1387]
154.项153的免疫原性糖肽，其包含位于seq id no:129第30个残基(asn)的糖 基化位点，其连接壳二糖。
[1388]
155.项153的免疫原性糖肽，其包含位于seq id no:129第30个残基(asn)的糖 基化位点，其连接man3glcnac2部分。
[1389]
156.项152的免疫原性糖肽，其包含seq id no:130的氨基酸序列。
[1390]
157.项156的免疫原性糖肽，其包含位于seq id no:130第4个残基(asn)和第 10个残基(asn)的两个糖基化位点，其分别连接壳二糖。
[1391]
158.项152的免疫原性糖肽，其包含seq id no:131的氨基酸序列。
[1392]
159.项158的免疫原性糖肽，其包含位于seq id no:131第7个残基(asn)的糖 基化位点，其连接壳二糖。
[1393]
160.产生特异性结合糖蛋白的抗体或其抗原结合片段的方法，包括用包含一个或 多个糖基化位点的免疫原性糖肽来免疫对象，其中(i)免疫原性糖肽是10-60个氨基酸残 基、10-30个氨基酸残基、15-25个氨基酸残基、15-20个氨基酸残基或15-18个氨基酸 残基长，(ii)免疫原性糖肽包含糖蛋白氨基酸序列的至少10个氨基酸的部分，(iii)该一个 或多个糖基化位点的至少一个连接碳水化合物，且(iv)该一个或多个糖基化位点的至少 一个位于所述氨基酸序列部分之内。
[1394]
161.项160的方法，其中抗体或其抗原结合片段不能特异性结合非糖基化形式的 糖蛋白。
[1395]
162.项160或161任一项的方法，其中对象是山羊、绵羊、驴、鸡、豚鼠、大鼠、 兔或小鼠。
[1396]
163.项160或161任一项的方法，其中对象是大鼠、兔或小鼠。
[1397]
164.项160或161任一项的方法，其中对象是小鼠。
[1398]
165.项160-164任一项的方法，其中免疫原性糖肽包含1、2或3个糖基化位点。
[1399]
166.项160-164任一项的方法，其中免疫原性糖肽包含连接碳水化合物的糖基化 位点。
[1400]
167.项160-164任一项的方法，其中免疫原性糖肽包含两个分别连接碳水化合物 的糖基化位点。
[1401]
168.项160-167任一项的方法，其中碳水化合物是n或o连接的碳水化合物。
[1402]
169.项160-168任一项的方法，其中碳水化合物是单糖、二糖、三糖、四糖或五 糖。
[1403]
170.项160-168任一项的方法，其中碳水化合物是二糖。
[1404]
171.项170的方法，其中二糖是壳二糖。
[1405]
172.项160-171任一项的方法，其中免疫原性糖肽的n端是乙酰化的。
[1406]
173.项160-172任一项的方法，其中糖肽的c端是n-甲基甲酰胺衍生物的形式。
[1407]
174.项160-173任一项的方法，其缀合免疫原性载体蛋白。
[1408]
175.项174的方法，其中免疫原性载体蛋白是钥孔戚血蓝素。
[1409]
176.项160-175任一项的方法，其中免疫原性糖肽是15-18个氨基酸残基长。
[1410]
177.项176的方法，其中免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。
[1411]
178.项176的方法，其中免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
[1412]
179.项160-175任一项的方法，其中免疫原性糖肽是18个氨基酸残基长。
[1413]
180.项179的方法，其中免疫原性糖肽包含分别连接壳二糖的两个糖基化位点。
[1414]
181.项160-175任一项的方法，其中免疫原性糖肽是15个氨基酸残基长。
[1415]
182.项181的方法，其中免疫原性糖肽包含连接壳二糖的糖基化位点。
[1416]
183.项160-182任一项的方法，其中糖蛋白包含seq id no:150的氨基酸序列。
[1417]
184.项183的方法，其中免疫原性糖肽包含seq id no:129的氨基酸序列。
[1418]
185.项184的方法，其中免疫原性糖肽包含位于seq id no:129第30个残基(asn) 的糖基化位点，其连接壳二糖。
[1419]
186.项184的方法，其中免疫原性糖肽包含位于seq id no:129第30个残基(asn) 的糖基化位点，其连接man3glcnac2部分。
[1420]
187.项183的方法，其中免疫原性糖肽包含seq id no:130的氨基酸序列。
[1421]
188.项187的方法，其中免疫原性糖肽包含位于seq id no:130第4个残基(asn) 和第10个残基(asn)的两个糖基化位点，其分别连接壳二糖。
[1422]
189.项183的方法，其中免疫原性糖肽包含seq id no:131的氨基酸序列。
[1423]
190.项189的方法，其中免疫原性糖肽包含位于seq id no:131第7个残基(asn) 的糖基化位点，其连接壳二糖。