抗CD73抗体及其应用的制作方法

抗cd73抗体及其应用
本技术是申请日为2020年8月20日、申请号为2020800059738、发明名称为“抗cd73 抗体及其应用”的中国专利申请的分案申请。


背景技术：

1.白细胞分化抗原73，cd73，也称为5'-核苷酸酶，是人体中由nt5e基因编码的酶。 cd73为由两个相同的70-kd亚基组成的二聚体，由一个糖基磷脂酰肌醇连接到质膜的外表面。
2.cd73将细胞外的单磷酸核苷酸(amp)脱磷酸化，产生腺苷。癌组织中细胞外腺苷的积累构成肿瘤免疫逃逸的重要机制。另外，肿瘤来源的腺苷通过腺苷酸环化酶激活的a2a受体很大程度上抑制浸润的效应t细胞(ohta等人,(2006)proc natl acad sci usa 103:13132
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13137)。研究表明cd73在多种肿瘤细胞表面高表达，包括白血病，膀胱癌，神经胶质瘤，成胶质细胞瘤，卵巢癌，黑色素瘤，前列腺癌，甲状腺癌，食道癌和乳腺癌(jin等人,cancer res2010；70:2245-55和stagg等人,pnas 2010；107:1547-52)。
3.已经证明cd73调节肿瘤细胞上的细胞-细胞和细胞-基质相互作用，cd73的表达和活性也与减少的t-细胞反应有关，并与耐药性有关。另一个问题是通常称为cd73抑制剂的抗体可能无法通过调节cd73的5'核苷酸外切酶活性来发挥作用。据报道一种抗体7g2(mlgg2 同种型，life technologies)抑制cd73，但是该抗体在流式细胞术中不结合细胞表面cd73，或至多仅以非常低的亲和力结合。另一种结合cd73的抗体，克隆ad2(小鼠igg1同种型) 据报道能引起受体聚集和内在化，但是对酶活性的影响最小。然而另一种试剂1e9(小鼠igg3 同种型，圣克鲁斯生物技术有限公司)可独立于酶促抑制而促进t细胞信号转导。据报道，还有一种mab，4g4(igg1同种型，novus biologicals)能诱导cd73从t细胞表面脱落。在使用重组cd73的试验中，仅一种试剂，尽管没有被进一步表征，但据报道具有部分阻断酶促作用的能力(sachsenmeier等人.(2012)j.biomed.screening 17:993-998)，后来被定义为能诱导细胞内化的抗体(rust等人，(2013)mol.cancer 12:11)。另外，一个更复杂因素是，文献中描述的抗体通常为具有能够被fcγ受体结合能力的鼠同种型，这使得难以将任何潜在的阻断作用与fc介导的作用分开。与fcγ受体结合的抗cd73抗体可以例如调节表达cd73 的肿瘤细胞(可能还有表达cd73的免疫抑制细胞)的耗竭(例如，通过adcc)，和/或可以诱导炎性细胞因子的产生，而不是任何真正的阻断作用。因此，尽管对靶向cd73研究的兴趣很大，但大部分有效的抗cd73抗体的特性仍有待确定。
4.需要开发针对cd73的新检验方法和抗体，以将其作为新型治疗靶标的潜能。


技术实现要素：

5.本技术涉及一种分离的抗原结合蛋白，包括以下一种或多种特性：a.能够以相当高的亲和力结合人cd73和食蟹猴的cd73；b.能够抑制cd73的5
′
外切核苷酸酶活性；c.能够调节cd73的内化；d.能够解除腺苷对t细胞增殖抑制作用；e.血清中浓度相对稳定；以及 f.能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。此外，本技术也提供了一种制备所述的分类的抗原
结合蛋白的方法以及所述的抗原结合蛋白在预防、减轻和/或治疗肿瘤中的药物用途。
6.一方面，本技术提供了一种分离的抗原结合蛋白，包括以下一种或多种特性：a.能够以相当高的亲和力同时结合人cd73和食蟹猴cd73；b.能够抑制cd73的5
′
外切核苷酸酶活性；c.能够调节cd73的内化；d.能够解除腺苷对t细胞增殖抑制作用；e.保持血清中相对稳定浓度至少15天；以及f.能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
7.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括来自于seq id no:168所示抗体重链可变区vh的hcdr1,hcdr2和/或hcdr3区中的任一个。
8.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括来自于seq id no:169所示抗体轻链可变区vl的lcdr1,lcdr2和/或lcdr3区中的任一个。
9.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体或抗原结合片段。
10.在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括fab，fab'，f(ab)2，fv片段，f(ab') 2，scfv，di-scfv和/或dab。
11.在某些实施方式中，所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
12.在某些实施方式中，所述的抗原结合蛋白包含来自于seq id no:152所示的重链可变区vh的hcdr1,hcdr2和/或hcdr3区中的任一个。
13.在某些实施方式中，所述vh包含seq id no:96,104,105,106和107中任一个所示的氨基酸序列。
14.在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含来自于seq id no:151所示的轻链可变区vl的lcdr1,lcdr2和/或lcdr3区中的任一个。
15.在某些实施方式中，所述vl包含seq id no:111和115任一个所示的氨基酸序列。
16.在某些实施方式中，所述hcdr3包含seq id no:154所示的氨基酸序列。
17.在某些实施方式中，所述的hcdr3包含seq id no:35,38和39中任一条所示的氨基酸序列。
18.在某些实施方式中，所述的hcdr2包含in seq id no:153所示的氨基酸序列。
19.在某些实施方式中，所述的hcdr2包含seq id no:18,23和24中任一个所示的氨基酸序列。
20.在某些实施方式中，所述的hcdr1包含seq id no:7所示的氨基酸序列。
21.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白，包含重链可变区vh，其中所述vh 包含seq id no:152所示的氨基酸序列。
22.在某些实施方式中，所述vh包含seq id 96,104,105,106和107中任一个所示的氨基酸序列。
23.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含抗体重链hc，所述hc包含seq id no:124,132,133,134,和135中任一个所示的氨基酸序列。
24.在某些实施方式中，所述的lcdr3包含seq id no:78所示的氨基酸序列。
25.在某些实施方式中，所述lcdr2包含seq id no:66所示的氨基酸序列。
26.在某些实施方式中，所述lcdr1包含seq id no:55所示的氨基酸序列。
27.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含轻链可变区vl，其中所述vl 包含seq id no:151所示的氨基酸序列。
28.在某些实施方式中，所述的vl包含seq id no:111和115中任一个所示的氨基酸序列。
29.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含抗体轻链lc，所述lc包含seqid no:139和143中任一个所示的氨基酸序列。
30.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含来自于seq id no:156所示的重链可变区vh的hcdr1,hcdr2和/或hcdr3区中的任一个。
31.在某些实施方式中，所述vh包含seq id no:95,99,100,101,102,和103中任一个所示的氨基酸序列。
32.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含来自于seq id no:155所示的轻链可变区vl的lcdr1,lcdr2和/或lcdr3区中的任一个。
33.在某些实施方式中，所述的vl包含seq id no:110,114,118,119,120,121,和122 中任一个所示的氨基酸序列。
34.在某些实施方式中，所述hcdr3包含seq id no:34所示的氨基酸序列。
35.在某些实施方式中，所述hcdr2包含seq id no:158所示的氨基酸序列。
36.在某些实施方式中，所述hcdr2选自包含seq id no:17，21和22中任一个所示的氨基酸序列。
37.在某些实施方式中，所述hcdr1包含seq id no:6所示的氨基酸序列。
38.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白，包含重链可变区vh，其中所述vh 包含seq id no:156所示的氨基酸序列。
39.在某些实施方式中，所述vh包含seq id no:95,99,100,101,102和103中任一个所示的氨基酸序列。
40.在某些实施方式中，所述的抗原结合蛋白包含抗体重链hc，其中所述hc包含seqid no:123,127,128,129,130和131中任一个所示的氨基酸序列。
41.在某些实施方式中，所述的lcdr3包含seq id no:157所示的氨基酸序列。
42.在某些实施方式中，所述的lcdr3包含seq id no:77,81,84,85,86,87和88中任一个所示的氨基酸序列。
43.在某些实施方式中，所述lcdr2包含seq id no:65所示的氨基酸序列。
44.在某些实施方式中，所述lcdr1包含seq id no:54所示的氨基酸序列。
45.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含轻链可变区vl，其中所述vl 包含seq id no:155所示的氨基酸序列。
46.在某些实施方式中，所述vl包含seq id nos:110,114,118,119,120,121和122 中任一个所示的氨基酸序列。
47.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含抗体轻链lc，其中所述lc包含seq id no:138,142,146,147,148,149和150任一项所示的氨基酸序列。
48.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含来自于seq id no:108所示的重链可变区vh的hcdr1，hcdr2和/或hcdr3区中任一个。
49.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含来自于seq id no:116所示的轻链可变区vl的lcdr1，lcdr2和/或lcdr3区中任一个。
50.在某些实施方式中，所述的hcdr3包含seq id no:40所示的氨基酸序列。
51.在某些实施方式中，所述的hcdr2包含seq id no:25所示的氨基酸序列。
52.在某些实施方式中，所述hcdr1包含seq id no:10所示的氨基酸序列。
53.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含重链可变区vh，所述vh包含 seq id no：108所示的氨基酸序列。
54.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含抗体重链hc，所述hc包含 seq id no:136所示的氨基酸序列。
55.在某些实施方式中，所述lcdr3包含seq id no:82所示的氨基酸序列。
56.在某些实施方式中，所述lcdr2包含seq id no:69所示的氨基酸序列。
57.在某些实施方式中，所述lcdr1包含seq id no:58所示的氨基酸序列。
58.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含轻链可变区vl，所述vl包含seq id no:116所示的氨基酸序列。
59.在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含抗体轻链lc，所述lc包含seqid no:144所示的氨基酸序列。
60.另一方面，本技术提供了编码所述分离的抗原结合蛋白的一种或多种分离的核酸分子。
61.另一方面，本技术提供可包含所述一种或多种分离的核酸分子的一种或多种载体。
62.另一方面，本技术提供了包括所述一种或多种分离的核酸分子、所述一种或多种载体的细胞。
63.另一方面，本技术提供了制备所述的分离的抗原结合蛋白的方法，包括在使得所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述的细胞。
64.另一方面，本技术提供了一种药物组合物，包含分离的抗原结合蛋白，一种或多种分离的核酸分子，一种或多种载体，细胞，以及任选地药学上可接受的载体。
65.另一方面，本技术提供了所述的分离的抗原结合蛋白，所述的一种或多种核酸分子，所述的一种或多种载体，所述的细胞和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
66.在某些实施方式中，所述的肿瘤包括实体瘤和/或血液肿瘤。
67.另一方面，本技术提供了预防、缓解和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本技术中的分离的抗原结合蛋白。
68.在某些实施方式中，所述的肿瘤包括实体瘤和/或血液肿瘤。
69.另一方面，本技术提供了抑制cd73的5'-核苷酸酶活性的方法，包括施用本技术的分离的抗原结合蛋白。
70.另一方面，本技术提供了调节cd73内化的方法，包括施用本技术的分离的抗原结合蛋白。
71.另一方面，本技术提供了用所述的分离的抗原结合蛋白，所述的一种或多种核酸分子，所述的一种或多种载体，所述的细胞和/或所述的药物组合物制备药物的用途，所述药物用于所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
72.在某些实施方式中，所述的肿瘤包括实体瘤和/或血液肿瘤。
73.另一方面，本技术提供了一种预防、缓解和/或治疗肿瘤的方法，包括向有需要的
受试者施用本技术的分离的抗原结合蛋白。
74.本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。将会被认知的是，本技术能够具有其他不同的实施例，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。相应地，附图和说明书本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。参引合并
75.本说明书中提及的所有出版物，专利和专利申请都以相同的程度通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物，专利或专利申请被明确地并单独地指出通过引用并入一样。
附图说明
76.本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考下面的详细说明，可以更好地理解本发明的特征和优点，所述详细说明阐述了采用本发明原理的说明性实施例以及附图，其中：
77.图1a和1b示出的是流式检测(facs)抗体和cho-k1-hcd73细胞系结合。
78.图2示出的是流式检测(facs)抗体与hek293-cynocd73细胞系结合。
79.图3示出的是是流式检测(facs)抗体和cho-k1-hcd73细胞系结合。
80.图4示出的是流式检测(facs)抗体和cho-k1-hcd73细胞系结合。
81.图5a和5b示出的是流式检测(facs)抗体与cho-k1-hcd73细胞系结合。
82.图6a和6b示出的是抗体抑制基于细胞的cd73酶活性。
83.图7a，7b，8a和8b示出的是不同时间处理的抗体抑制可溶性cd73酶活性。
84.图9a，9b，10和11示出的是抗体的内化活性。
85.图12a，12b，13a和13b示出的是抗体在原始t细胞增殖实验测定中的结果。
86.图14a，14b和14c示出的是各抗体的血清浓度-时间曲线pk结果，a:pr000506，b:pr000846和c:pr000497。
87.图15a，15b，16a和16b示出的是抗体在体内抑制肿瘤生长活性，其中，a：肿瘤体积；b：体重。
88.图17示出的是cd73+pr000846复合物(y轴上的正值)和单独的cd73(y轴上的负值)之间的氘摄取差异。
89.图18，19和20示出的是在包含区域1、2、3的肽中，氘的相对摄入量(道尔顿的质量变化)根据氘暴露时间的函数。
90.图21和图22示出的是cd73与pr000846结合的表位分析结果。详细说明
91.尽管本文已经示出和描述了本发明的各种实施例，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化，改变和替代。应当理解，可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。
92.除非上下文另外明确指出，否则本文所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”通常包括复数形式。
93.如本文所用，术语“cd73”也称为5
′
外切核苷酸酶，通常是指能够将细胞外核苷5
′
单磷酸转化为核苷，即单磷酸腺苷(amp)转化为腺苷的酶(核苷酸酶)。cd73的主要功能是将细胞外核苷酸(例如5'-amp)转化为高度免疫抑制分子腺苷。术语“cd73”包括细胞天然表达的cd73的任何变体或同工型。cd73或其任何变体和同工型可以从天然表达它们的细胞或组织中分离，或者可以使用本领域中熟知的技术和/或本文所述的技术重组产生。相应地，本文所述的抗原结合蛋白可以与人以外的物种(例如食蟹猴cd73)交叉反应。或者，抗体可以对人cd73具有特异性，并且可以不与其他物种表现出任何交叉反应性。人cd73的氨基酸序列在genbank中以登录号aah65937.1(5'-核苷酸酶，胞膜)，np_002517(同工型1前蛋白)或np_001191742(同工型2前蛋白)显示。
94.如本文所用，术语“tab1”或pr002078通常是指抗cd73抗体。tab1的重链氨基酸序列如seq id no.137所示，tab1的轻链氨基酸序列如seq id no.145所示。
95.如本文所用，术语“tab2”或pr000752通常是指抗cd73抗体。tab2的重链氨基酸序列如seq id no.126所示，tab2的轻链氨基酸序列如seq id no.141所示。
96.如本文所用，术语“tab3”或pr000690通常是指抗cd73抗体。tab3的重链氨基酸序列如seq id no.125所示，tab2的轻链氨基酸序列如seq id no.140所示。
97.如本文所用，术语“内在化”是指与分子从细胞的细胞外表面转移至细胞的细胞内表面的过程相关的分子，生化和细胞事件。该过程尤其可以涉及细胞外分子(例如激素，抗体和有机小分子)、膜相关分子(例如细胞表面受体)和与细胞外分子结合的膜相关分子的复合物(例如，与跨膜受体结合的配体或与膜相关分子结合的抗体)的内化；
98.如本文所用，术语“抗原结合蛋白”通常是指包含与抗原结合的部分以及任选地允许抗原结合部分获得促进与抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或框架部分的蛋白质。抗原结合蛋白的实例包括抗体，抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)，抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可以具有例如天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚体分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条轻链(lc)和一条重链(hc)。每条链的氨基末端部分包括约100至110个或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分定义一个恒定区，主要负责效应子功能。人类轻链被分类为κ或λ轻链。重链分类为μ，δ，γ，α或ε，并将抗体的同种型分别定义为igm，igd，igg，iga和ige。天然存在的免疫球蛋白链的可变区呈现的一般结构是四个相对保守的框架区(fr)由三个高度可变区(又叫互补决定区或cdr)连接。从n端到c 端，轻链和重链均包含域fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3和fr4。
99.如本文所用，术语“cdr”通常指抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列，是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中有三个重链和三个轻链cdr(或 cdr区)。对于本领域技术人员而言显而易见的是，存在用于cdr序列的各种编号系统，例如chothia(chothia等人(1989)nature 342：877-883)，kabat(kabat等人，免疫学的蛋白质序列，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1987和1991))。chothia编号系统用于编号本公开的抗体中的残基。表1各cdr区的氨基酸编号系统(可参见http://bioinf.org.uk/abs/)
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kabatchothiacombinedlcdr1l24-l34l24-l34l24-l34lcdr2l50-l56l50-l56l50-l56
lcdr3l89-l97l89-l97l89-l97hcdr1h31-h35h26-h32h26-h35hcdr2h50-h65h52-h56h50-h65hcdr3h95-h102h95-h102h95-h102
100.其中，laa-lbb可以指从抗体n端开始，第aa位至第bb位的氨基酸序列；例如， l24-l34可以指从抗体轻链从第24位至第34位的氨基酸序列；
101.术语“分离的”当用于核酸或蛋白时，表示核酸或蛋白质基本不含在自然状态下与其相关的其他细胞成分。
102.如本文所用，术语“k
d”或“kd”,通常是指解离常数，一种特定类型的平衡常数，用于测量较大的对象可逆地分离(解离)为较小成分的倾向，就像当复合物分解成其成分分子时一样。解离常数是缔合常数的倒数。在抗体结合抗原的特定情况下，通常术语亲和常数是指缔合常数。
103.如本文所用，术语“抗原结合蛋白”通常指免疫球蛋白分子的一部分。抗原结合片段可以包含一个轻链和具有单个抗原结合位点的重链的一部分。可以通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白分子获得抗原结合片段。例如，抗原结合可以由重链和轻链各自的一个恒定域和一个可变域组成。可变结构域可以在免疫球蛋白分子的氨基末端包含互补位(抗原结合位点)，该互补位包括一组互补决定区。木瓜蛋白酶可用于将免疫球蛋白分子切割成两个fab片段和一个fc片段。胃蛋白酶在铰链区下方切割，因此形成f(ab')2片段和pfc'片段。二价的 f(ab)2或f(ab')2片段具有两个通过二硫键连接的抗原结合区。f(ab)2或f(ab')2片段的还原产生2个单价fab或fab'片段，它们具有可与其他分子结合的游离巯基。
104.如本文所用，术语“fv片段”通常是指由igg和igm类抗体的酶促切割制成的最小片段。
105.如本文所用，术语“scfv”通常是指单链抗体片段。scfv可以是重组的单链多肽分子，其中抗体的轻链和重链可变区直接或通过肽接头连接。
106.如本文所用，术语“全人源化抗体”通常指具有完全人氨基酸序列来源的抗体区域的抗体，其中通过使用基因修饰的小鼠或通过结合筛选的抗体工程方法在体内进行抗原特异性的选择。
107.如本文所用，术语“一个或多个分离的核酸分子”通常是指从其天然环境分离或人工合成的任意长度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
108.如本文所用，术语“一种或多种载体”通常是指可以将编码蛋白质的多核苷酸插入并表达的核酸媒介物。载体中携带的遗传物质元件可以通过用载体转化，转导或转染宿主细胞而在宿主细胞中表达。载体的实例包括：质粒，噬菌粒，粘粒，人工染色体(例如酵母人工染色体(yac)，细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac))，噬菌体(例如λ噬菌体或m13噬菌体)和动物病毒。载体可包含多种控制表达的元件，包括启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报告基因。另外，载体还可以包含复制起点。载体也可能包含有助于其进入细胞的成分，例如病毒颗粒，脂质体或蛋白质壳，但不仅限于这些物质。
109.如本文所用，术语“细胞”通常是指可用于携带本技术的一种或多种载体，或用于表达或产生本技术的抗体，抗原结合片段或其变体的细胞。本技术的细胞可以是宿主细胞。
该细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌；或者真菌细胞，例如酵母细胞或曲霉细胞；昆虫细胞，例如s2果蝇细胞或sf9；或另一种细胞，例如cho细胞，cos细胞，nso 细胞或其他适合抗体表达的细胞。
110.如本文所用，术语“能够表达的条件”通常是指能够表达本公开的分离的抗原结合蛋白的条件。在一些实施方案中，这种条件可以包括但不限于孵育时间，温度和培养基，并且可以取决于细胞类型并且可以由熟练的技术人员容易地确定。
111.分离的抗原结合蛋白
112.在一方面，本公开提供了分离的抗原结合蛋白，其可以能够以相当的结合亲和力结合人cd73和食蟹猴cd73。如本文所用，术语“相当的结合亲和力”通常是指抗体的两个结合亲和力的比率为约0.01nm至约100nm，例如约0.02nm至约50nm，约0.05nm至约30nm。约0.1nm至约20nm，约0.1nm至约10nm，约0.2nm至约10nm，约0.5nm至约3nm。抗体和cd73的结合亲和力可以使用cd73稳转细胞系(例如cho-k1细胞系)来测评，例如在facs分析中。
113.分离的抗原结合蛋白能够抑制cd73的5
′
外切核苷酸酶活性。分离的抗原结合蛋白可抑制cd73介导的腺苷的产生，即抑制cd73介导的amp分解代谢为腺苷。可以通过测试抗体直接或间接阻断amp转化为腺苷的能力来评估。在某些情况下，分离的抗原结合蛋白可以抑制基于细胞的cd73的活性。可以通过构建稳定表达cd73的细胞系，例如cho-k1细胞系来测量。例如，分离的抗原结合蛋白可以如实施例中所述，以约0.01nm至约100nm，例如约0.02nm至约50nm，约0.001nm至约10nm，约0.001nm至约1nm，从约0.01nm至约 0.5nm，从约0.01nm至约0.3nm，从约0.05nm至约0.25nm的浓度抑制基于细胞的cd73的 50％的5'外核苷酸酶活性。在另一种情况下，分离的抗原结合蛋白可抑制可溶性重组cd73的活性。例如，通过定量酶促产物无机磷酸酯，分离的抗原结合蛋白可引起amp向腺苷的转化率至少降低40％，amp向腺苷的转化率至少降低50％。amp向腺苷的转化率至少降低60％， amp向腺苷的转化率至少降低70％，或amp向腺苷的转化率至少降低90％。
114.分离的抗原结合蛋白可能能够介导cd73内化。在某些情况下，可以通过用流式细胞术测量cd73在细胞表面例如nci-h292上的残留来评估内化的百分比。例如，在与抗体温育4小时后，约40％至约99％(例如，约40％至约90％，约40％至约80％，约40％至约70％，约40％至约60％，约40％至约55％，或约50％)cd73被内化到细胞内。在另一种情况下，可以通过如实例中所述的内在化试剂盒来测量内在化。与抗体孵育3天后，cho
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k1表面的cd73被内化，抗体介导的cd73内化的最大水平可能为至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或更多，取决于抗体的浓度。
115.分离的抗原结合蛋白的活性也可以在间接测定中测量其调节淋巴细胞活性的能力，例如缓解amp介导的淋巴细胞活性抑制能力或引起淋巴细胞增殖的能力。在某些情况下，可以通过间接测定法评估分离的抗原结合蛋白调节淋巴细胞增殖的能力。淋巴细胞可以是t细胞，包括辅助性t细胞(例如，cd4+t细胞)。例如，可以使用facs进行分析。
116.分离的抗原结合蛋白在血清中可具有相对稳定的浓度至少15天。如本文所用，“相对稳定”通常是指与参考浓度(例如，抗体的血清中的初始浓度)相比，血清中抗体的浓度变化不超过50％。抗体在血清中的稳定性可以通过药代动力学分析来确定。例如，如pk分析中所述，本公开的分离的抗原结合蛋白的t
1/2
为约15天。
117.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含来自seq id no：152的vh的至少一个 hcdr。
118.本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：152的重链可变区vh的hcdr3，并且该hcdr3可包含如seq id no：154所示的氨基酸序列：x1x2qwgsrldy(seq idno.154)；其中，x1＝d或e；x2＝g或a。例如，可以根据chothia定义确定序列。
119.在某些情况下，与抗原结合蛋白的dgqwgsrldy的hcdr3相比，hcdr3可以包含至少一个选自以下的氨基酸取代：x1和x2处的氨基酸取代，其中x1处的氨基酸可以被e取代，x2的氨基酸可以被a取代。
120.例如，hcdr3可包含如seq id no：35、38和39中任一个所示的氨基酸序列。
121.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含来自seq id no：152的重链可变区vh的 hcdr2，并且该hcdr2可以包含如seq id no.153：wyx3x4sf(seq id no.153)所示的氨基酸序列；其中，x3＝d或e；x4＝g或a。例如，可以根据chothia定义确定序列。
122.例如，hcdr2可包含如seq id no：18、23和24中任一个所示的氨基酸序列。
123.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：152的重链可变区vh的hcdr1，并且hcdr1可包含如seq id no.7：gftfsdy(seq id no.7)所示的氨基酸序列。例如可以根据chothia定义确定序列。
124.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr1，h-fr1的c端直接或间接连接至所述 hcdr1的n端，并且h-fr1可包含如：seq id no.2：qvqlvesgggvaqpgrslslscaas (seq id no.2)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
125.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含h-fr2，h-fr2位于所述hcdr1和所述hcdr2 之间，并且h-fr2可以包含如seq id no.12： gmhwvrqapgkglewvaliwvrqapgkglewva(seq id no.12)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
126.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含h-fr3，h-fr3位于所述hcdr2和所述hcdr3 之间，并且h-fr3可以包含如seq id no：28： eyyadsvkgrfsisrdnskntlylqmnslraedtavyycvr(seq id no.28)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
127.在本公开中，抗原结合蛋白可包含h-fr4，所述h-fr4的n端直接或间接连接至所述hcdr3的c端，并且h-fr4可包含氨基酸seq id no.43：wgqgtlvtvss(seq idno.43)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
128.在本公开中，抗原结合蛋白可包含vh，并且vh可包含seq id no.152： qvqlvesgggvaqpgrslslscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvaliwyx
54
x
55
sf eyyadsvkgrfsisrdnskntlylqmnslraedtavyycvrx
99
x
100
qwgsrldywgqgt lvtvss(seq id no.152)所示的氨基酸序列；其中，x
54
＝d或e；x
55
＝g或a；x
99
＝ d或e；x
100
＝g或a。例如，可以根据chothia定义来确定序列。
129.例如，vh可包含如seq id no：96、104、105、106和107中任一个所示的氨基酸序列。
130.在本公开中，抗原结合蛋白可包含抗体重链恒定区，并且抗体重链恒定区包含人igg 恒定区。在某些情况下，人igg恒定区可以衍生自人igg1恒定区。例如，抗体重链恒定区可以包含seq id no.167： astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssg lyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsv flfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynsty rvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtk nqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqg nvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no.167)所示的氨基酸序列。
131.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含抗体重链(hc)，并且hc包含如seq idno.162所示的氨基酸序列。例如，hc可以包含seq id no：124、132、133、134和135中任一个所示的氨基酸序列。
132.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含来自seq id no：151的vl的至少一个lcdr。
133.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：152的重链可变区vh的lcdr3，并且lcdr3可包含如seq id no.78：qqrsnwift(seq id no.78)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
134.在本公开中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no.152的重链可变区vh的lcdr2，并且lcdr2可包含seq id no.66：dasnrat(seq id no.66)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
135.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含来自seq id no.152的重链可变区vh的 lcdr1，并且lcdr1可以包含如seq id no.55：rasqsvsryla(seq id no.55)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
136.在本技术中，抗原结合蛋白可包含l-fr1，l-fr1的c端直接或间接连接至所述 lcdr1的n端，并且l-fr1可包含氨基酸seq id no.48：x1ivx4tqspatlslspgeratlsc (seq id no.48)所示的氨基酸序列；其中，x1＝k或e；x4＝m或l。例如，可以根据 chothia定义来确定序列。
137.在某些情况下，与如seq id no.47所示的抗原结合蛋白的l-fr1相比，l-fr1可包含至少一个选自以下的氨基酸取代：x1和/或x4，其中x1上的氨基酸可以被取代为e，并且x4上的氨基酸可以被取代为l。
138.例如，l-fr1可以包含如seq id no：48和51中任一个所示的氨基酸序列。
139.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含l-fr2，l-fr2位于所述lcdr1和所述lcdr2 之间，并且l-fr2可以包含如seq id no.61：wyqqkpgqaprlliy(seq id no.61)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
140.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含l-fr3，l-fr3位于所述lcdr2和所述lcdr3 之间，并且l-fr3可以包含如seq id no.72：giparfsgsgsgtgttltisslepedfavyyc (seq id no.72)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
141.在本技术中，抗原结合蛋白可包含l-fr4，所述l-fr4的n端直接或间接连接至所述lcdr3的c端，并且l-fr4可包含如seq id no.90：fgpgtkvdik(seq id no.90) 所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
142.在本公开中，抗原结合蛋白可以包含vl，并且vl可以包含如seq id no.151： x1ivx4tqspatlslspgeratlscrasqsvsrylawyqqkpgqaprlliydasnratgipar fsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsnwiftfgpgtkvdik(seq id no.151)所示的氨基酸序列，其中，x1＝k或e；x4＝m或l。例如，可以根据chothia定义确定序列。
143.例如，vl可包含如seq id no：111和115中任一个所示的氨基酸序列。
144.在本技术中，抗原结合蛋白可包含抗体轻链恒定区，并且抗体轻链恒定区包含人igκ恒定区。例如，抗体轻链恒定区可包含如seq id no.166： rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqds kdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:166)所示的氨基酸序列。
145.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含抗体轻链(lc)，并且lc包含如seq id no.159 所示的氨基酸序列。例如，lc可包含seq id no：139和143中任一个所示的氨基酸序列。
146.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含hcdr1-3。hcdr1可包含如seq id no.7 所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.153所示的氨基酸序列，并且hcdr3可包含如seq id no.154所示的氨基酸序列。
147.在某些实施方式中，抗原结合蛋白可包含hcdr1-3。hcdr1可包含如seq idno.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.18、23、24任一个所示的氨基酸序列，并且hcdr3可包含如seq id no.35、38和39中任一个所示的氨基酸序列。
148.例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.18所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.35所示的氨基酸序列。
149.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.23所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.38所示的氨基酸序列。
150.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.23所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.39所示的氨基酸序列。
151.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.24所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.38所示的氨基酸序列。
152.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.24所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.39所示的氨基酸序列。
153.在本技术中，抗原结合蛋白可包含lcdr1-3。lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seqid no.78所示的氨基酸序列。
154.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr1-4。h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含氨基酸序列 seq id no.28所示的氨基酸序列，并且h-fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列。
155.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含l-fr1-4。l-fr1可包含如seq id no.48所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seqid no.72所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列。
156.在某些情况下，l-fr1可包含如seq id no：51所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no：61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no：72所示的氨基酸序列，并且l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列。
157.在本技术中，抗原结合蛋白可包含hcdr1-3和lcdr1-3。hcdr1可包含如seqid no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.153所示的氨基酸序列，hcdr3 可包含如seq id no.154所示的氨基酸序列；lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.78 所示的氨基酸序列。
158.在某些情况下，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.18，23和24中任一各所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.35所示的氨基酸序列；lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列， lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.78所示的氨基酸序列。
159.例如，所述抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列， hcdr2可包含如seq id no.18所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.35所示的氨基酸序列；lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq idno.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.78所示的氨基酸序列。
160.又例如，所述抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列， hcdr2可包含如seq id no.23所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.38所示的氨基酸序列；lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq idno.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.78所示的氨基酸序列。
161.在本技术中，所述抗原结合蛋白可包含h-fr1-4和l-fr1-4。h-fr1可包含如seqid no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列，并且h-fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列。l-fr1可包含如seq id no.48所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seqid no.90所示的氨基酸序列。
162.在某些情况下，h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如 seq id no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序，并且h
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fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列。l-fr1可包含如seq id no.51所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72 所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列。
163.在本技术中，所述抗原结合蛋白可包含vh和vl。vh可包含如seq id no：152 所示的氨基酸序列，vl可包含如seq id no：151所示的氨基酸序列。
164.在某些情况下，所述vh可包含如seq id no：96、104、105、106和107中任一个所示的氨基酸序列，所述vl可包含如seq id no：111和115中任一个所示的氨基酸序列。
165.在某些情况下，所述vh可包含如seq id no：96所示的氨基酸序列，所述vl可包含如seq id no：111所示的氨基酸序列。
166.在某些情况下，所述vh可包含如seq id no：104所示的氨基酸序列，所述vl 可包含如seq id no：111所示的氨基酸序列。
167.在某些情况下，所述vh可包含如seq id no：105所示的氨基酸序列，所述vl 可包含如seq id no：111所示的氨基酸序列。
168.在某些情况下，所述vh可包含如seq id no：106所示的氨基酸序列，所述vl 可包含如seq id no：111所示的氨基酸序列。
169.在某些情况下，所述vh可包含如seq id no：107所示的氨基酸序列，所述vl 可包含如seq id no：111所示的氨基酸序列。
170.在某些情况下，所述vh包含如seq id no：96所示的氨基酸序列，所述vl可包含如seq id no：115所示的氨基酸序列。
171.在某些情况下，所述vh可包含如seq id no：104所示的氨基酸序列，所述vl 可包含如seq id no：115所示的氨基酸序列。
172.在某些情况下，所述vh可包含如seq id no：105所示的氨基酸序列，所述vl 可包含如seq id no：115所示的氨基酸序列。
173.在某些情况下，所述vh可包含如seq id no：106所示的氨基酸序列，所述vl 可包含如seq id no：115所示的氨基酸序列。
174.在某些情况下，所述vh可包含如seq id no：107所示的氨基酸序列，所述vl 可包含如seq id no：115所示的氨基酸序列。
175.在本技术中，所述抗原结合蛋白可包含重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区可包含如seq id no：167所示的氨基酸序列，轻链恒定区可包含如seq id no：166所示的氨基酸序列。
176.在本技术中，所述抗原结合蛋白可包含重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区可包含如seq id no：162所示的氨基酸序列，轻链恒定区可包含如seq id no：159所示的氨基酸序列。
177.在某些情况下，所述hc包含如seq id no：124、132、133、134和135中任一个所示的氨基酸序列，所述lc可包含如seq id no：139和143中任一个所示的氨基酸序列。
178.在本技术中，抗原结合蛋白可包含hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh 可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.153所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.154所示的氨基酸序列。h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列，并且h-fr4可包含如 seq id no.33所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.152所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.162所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列， lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.78所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.48所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq idno.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.151所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.159所示的氨基酸序列。
179.在某些情况下，所述抗原结合蛋白可包含hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列， hcdr2可包含如seq id no.18、23和24中任一个所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如 seq id no id no.35、38和39中任一个所示的氨基酸序列。h-fr1可包含如seq id no.2 所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如 seq id no.28所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列。vh 可包含如seq id no.96、104、105、106和107任一个所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.124、132、133、134和 135中任一个所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq idno.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.78所示的氨基酸序列。l-fr1可包
含如seq id no.48和51所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列。vl可包含seq id no. 111和115所示的氨基酸序列，轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列，lc 可包含如seq id no.139和143所示的氨基酸序列。
180.例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000506相同的hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.18所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.35 所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seqid no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.96所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.124所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.78 所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seqid no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.111所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.139所示的氨基酸序列。
181.例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000843相同的hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.23所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.38 所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seqid no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.104所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.132所示的氨基酸序列。并且vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.78所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.111所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.139 所示的氨基酸序列。
182.例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000844相同的hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.23所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.39 所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seqid no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.105所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.133所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.78 所示的氨基酸序列；l-fr1可包
含如seq id no.48所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seqid no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.111所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.139所示的氨基酸序列。
183.例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000845相同的hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.24所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.38所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列，并且h-fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.106所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq idno.134所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.55 所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如 seq id no.78所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.48所示的氨基酸序列，l-fr2 可包含如seq id no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.111所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seqid no.139所示的氨基酸序列。
184.例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000846相同的hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.24所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.39所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列， h-fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.107所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq idno.135所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.55 所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如 seq id no.78所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.48所示的氨基酸序列，l-fr2 可包含如seq id no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.111所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seqid no.139所示的氨基酸序列。
185.例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000847相同的hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.23所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.38所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列，h
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.104所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.132 所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seqid no.78所示的氨基酸序列；l-fr1可包
含如seq id no.51所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列， l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.115所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq idno.143所示的氨基酸序列。
186.例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000848相同的hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.23所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.39 所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seqid no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.105所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.133所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.78 所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.51所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seqid no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.115所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.143所示的氨基酸序列。
187.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000849相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.24所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.38所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列， h-fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.106所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq idno.134所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.55 所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如 seq id no.78所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.51所示的氨基酸序列，l-fr2 可包含如seq id no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.115所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seqid no.143所示的氨基酸序列。
188.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000850相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.24所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.39所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列，h
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fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.107所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.135所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.78所示的氨基酸序列；l-fr1
可包含如seq id no.51所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.115所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.143 所示的氨基酸序列。
189.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000851相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.18所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.35所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.2所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.12所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.28所示的氨基酸序列，h
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.43所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.96所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.124所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.78所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.48所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.61所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.72所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.90所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.115所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.143 所示的氨基酸序列。
190.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：156的vh的至少一个hcdr。
191.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：156的重链可变区vh的 hcdr3，并且该hcdr3可包含如seq id no.34：ggdlltgpnafdi(seq id no.34)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
192.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：156的重链可变区vh的 hcdr2，并且该hcdr2可包含如seq id no.158：wyx3x4sk(seq id no.158)所示的氨基酸序列；其中，x3＝d或e；x4＝g或a。例如，可以根据chothia定义确定序列。
193.例如，hcdr2可包含如seq id no：17、21和22中任一个所示的氨基酸序列。
194.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：156的重链可变区vh的hcdr1，并且hcdr1可包含如seq id no.6：gftfssy(seq id no.6)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
195.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr1，h-fr1的c端直接或间接连接至所述 hcdr1的n端，并且h-fr1可包含如seq id no.1：qvqvvesgggvvqpgrslrlscaas (seq id no.1)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
196.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr2，h-fr2位于所述hcdr1和所述hcdr2 之间，并且h-fr2可包含如seq id no.11：dmhwvrqapgkglewvast(seq id no.11) 所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
197.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含h-fr3，h-fr3位于所述hcdr2和所述 hcdr3之间，并且h-fr3可包含如seq id no.27： kyyadsvkgrftisrdnskntlylkmnslrgddtavyycak(seq id no.27)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
198.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr4，所述h-fr4的n端直接或间接连接至所述hcdr3的c端，并且h-fr4可包含如seq id no.42：wgqgtmvtvss(seq idno.42)所示的氨基
酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
199.在本技术中，抗原结合蛋白可包含vh，并且vh可包含seq id no.156： qvqx4vesgggvvqpgrslrlscaasgftfssydmhwvrqapgkglewvastwyx5x6sk kyyadsvkgrftisrdnskntlylx7mnslrx8x9dtavyycakggdlltgpnafdiwgqg tmvtvss(seq id no.156)所示的氨基酸序列。其中，x4＝l或v，x5＝d或e；x6＝g或a；x7＝k或q；x8＝g或a；x9＝d或e。例如，可以根据chothia定义来确定序列。
200.例如，vh可包含如seq id no：95、99、100、101、102和103中任一个所示的氨基酸序列。
201.在本技术中，抗原结合蛋白可包含抗体重链恒定区，并且抗体重链恒定区包含人 igg恒定区。在某些情况下，人igg恒定区可以衍生自人igg1恒定区。例如，抗体重链恒定区可包含如seq id no.167：astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc dkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdg vevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakg qprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdg sfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no.167)所示的氨基酸序列。
202.在本技术中，抗原结合蛋白可包含抗体重链(hc)，并且hc包含如seq idno.161所示的氨基酸序列。例如，hc可包含如seq id no：123、127、128、129、130和 131中任一个所示的氨基酸序列。
203.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：155的vl的至少一个lcdr。
204.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：156的重链可变区vh的 lcdr3，并且lcdr3可包含如seq id no.157：qqydx5yx6nt(seq id no.157)所示的氨基酸序列；其中，x5＝m，n，q，s或t；x6＝e，k，s。例如，可以根据chothia 定义来确定序列。
205.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：156的重链可变区vh的 lcdr2，并且lcdr2可包含seq id no.65：kassles(seq id no.65)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
206.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：156的重链可变区vh的 lcdr1，并且lcdr1可包含如seq id no.54：rasqsisswla(seq id no.54)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
207.在本技术中，抗原结合蛋白可包含l-fr1，l-fr1的c端直接或间接连接至所述 lcdr1的n端，并且l-fr1可包含如seq id no.47：diqmtqspstlsasvgdrvtitc (seq id no.47)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
208.在本技术中，抗原结合蛋白可包含l-fr2，l-fr2位于所述lcdr1和所述lcdr2 之间，并且l-fr2可以包含如seq id no.60：wyqqkpgkapklliy(seq id no.60)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
209.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含l-fr3，l-fr3位于所述lcdr2和所述 lcdr3之间，并且l-fr3可以包含如seq id no.71： gvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyyc(seq id no.71)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
210.在本技术中，抗原结合蛋白可包含l-fr4，所述l-fr4的n端直接或间接连接至所述lcdr3的c端，并且l-fr4可包含如seq id no.89：fgqgtkleik(seq id no.89) 所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
211.在本技术中，抗原结合蛋白可以包含vl，并且vl可以包含seq id no.155： diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliykasslesgvpsrf sgsgsgteftltisslqpddfatyycqqydx1yx4ntfgqgtkleik(seq id no.155)所示的氨基酸序列：其中，x1＝m，n，q，s或t；x4＝e，k或s。例如，可以根据 chothia定义确定序列。
212.例如，vl可包含如seq id no：110、114、118、119、120、121和122中任一个所示的氨基酸序列。
213.在本技术中，抗原结合蛋白可包含抗体轻链恒定区，并且抗体轻链恒定区包含人igκ恒定区。例如，抗体轻链恒定区可包含seq id no.166: rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqds kdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:166)所示的氨基酸序列。
214.在本技术中，抗原结合蛋白可包含抗体轻链(lc)，并且lc包含如seq id no.160 所示的氨基酸序列。例如，lc可包含如seq id no：138、142、146、147、148、149和150 中任一个所示的氨基酸序列。
215.在本技术中，抗原结合蛋白可包含hcdr1-3。hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.158所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如 seq id no.34所示的氨基酸序列。
216.在某些情况下，抗原结合蛋白可包含hcdr1-3。hcdr1可包含如seq id no.6 所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.17、21、22中任一个所示的氨基酸序列， hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列。
217.例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.17所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列。
218.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2 可以包含如seq id no.21所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列。
219.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列。
220.在本技术中，抗原结合蛋白可包含lcdr1-3。lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seqid no.157所示的氨基酸序列。
221.例如，抗原结合蛋白的lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2 可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.77所示的氨基酸序列。
222.例如，抗原结合蛋白的lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2 可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.81所示的氨基酸序列。
223.例如，抗原结合蛋白的lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2 可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.84所示的氨基酸序列。
可包含如seq id no.21所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列；抗原结合蛋白的lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.77所示的氨基酸序列。
237.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列；抗原结合蛋白的lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.77所示的氨基酸序列。
238.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列；抗原结合蛋白的lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.81所示的氨基酸序列。
239.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列；抗原结合蛋白的lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.84所示的氨基酸序列。
240.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列；抗原结合蛋白的lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.85所示的氨基酸序列。
241.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含seq id no.34所示的氨基酸序列；抗原结合蛋白的lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如 seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.86所示的氨基酸序列。
242.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列；抗原结合蛋白的lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.87所示的氨基酸序列。
243.又例如，抗原结合蛋白的hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列；抗原结合蛋白的lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.88所示的氨基酸序列。
244.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr1-4和l-fr1-4。h-fr1可包含如seq idno.164所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.165所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列； l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.89 所示氨基酸序列。
245.在某些情况下，h-fr1可包含如seq id no.1和3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.27和31所示的氨基酸序列，
h-fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47 所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seqid no.71所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.89所示氨基酸序列。
246.在本技术中，抗原结合蛋白可包含vh和vl。vh可包含如seq id no：156所示的氨基酸序列，vl可包含如seq id no：155所示的氨基酸序列。
247.在某些情况下，vh可包含如seq id no：95、99、100、101、102和103中任一个所示的氨基酸序列，vl可包含如seq id no：110、114、118、119、120、121和122中任一个所示的氨基酸序列。
248.在某些情况下，vh可包含如seq id no：95所示的氨基酸序列，vl可包含如seqid no：110所示的氨基酸序列。
249.在某些情况下，vh可包含如seq id no：99所示的氨基酸序列，vl可包含如seqid no：110所示的氨基酸序列。
250.在某些情况下，vh可包含如seq id no：100所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：110所示的氨基酸序列。
251.在某些情况下，vh可包含如seq id no：101所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：110所示的氨基酸序列。
252.在某些情况下，vh可包含如seq id no：102所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：110所示的氨基酸序列。
253.在某些情况下，vh可包含如seq id no：103所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：110所示的氨基酸序列。
254.在某些情况下，vh可包含如seq id no：95所示的氨基酸序列，vl可包含如seqid no：114所示的氨基酸序列。
255.在某些情况下，vh可包含如seq id no：100所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：114所示的氨基酸序列。
256.在某些情况下，vh可包含如seq id no：102所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：114所示的氨基酸序列。
257.在某些情况下，vh可包含如seq id no：103所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：114所示的氨基酸序列。
258.在某些情况下，vh可包含如seq id no：102所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：118所示的氨基酸序列。
259.在某些情况下，vh可包含如seq id no：102所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：119所示的氨基酸序列。
260.在某些情况下，vh可包含如seq id no：102所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：120所示的氨基酸序列。
261.在某些情况下，vh可包含如seq id no：102所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：121所示的氨基酸序列。
262.在某些情况下，vh可包含如seq id no：102所示的氨基酸序列，vl可包含如 seq id no：122所示的氨基酸序列。
263.在本技术中，抗原结合蛋白可包含重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区可包含
如seq id no：167所示的氨基酸序列，轻链恒定区可包含如seq id no：47所示的氨基酸序列。
264.在本技术中，抗原结合蛋白可包含重链(hc)和轻链(lc)。hc可包含如seqid no：161所示的氨基酸序列，lc可包含如seq id no：160所示的氨基酸序列。
265.在某些情况下，hc可包含如seq id no：123、127、128、129、130和131中任一个所示的氨基酸序列，lc可包含如seq id no：138、142、146、147、148、149和150 中任一个所示的氨基酸序列。
266.在本技术中，抗原结合蛋白可包含hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh 可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.158所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.164所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.27所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seqid no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.156所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.161所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列， lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.77所示的氨基酸序列。l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq idno.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.155所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.160所示的氨基酸序列。
267.在某些情况下，抗原结合蛋白可包含hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。 vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.17、21、22中任一个所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列。h-fr1可包含如seq id no.1和3中任一个所述的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.27所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no： 95、99、100、101、102和103中任一个所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167 所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.123、127、128、129、130和131中任一个所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.77所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.10、114、118、 119、120、121和122中任一个所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.138、142、146、147、148、149和150中任一个所示的氨基酸序列。
268.例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000497相同的hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.17所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.34 所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.1所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seqid no.11所示的氨
基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.27所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.95所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.123所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.77 所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seqid no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.110所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.138所示的氨基酸序列。
269.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000815相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.21所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.1所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.27所示的氨基酸序列，h
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fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.99所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.127所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.77所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.110所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.138 所示的氨基酸序列。
270.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000816相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.1所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.27所示的氨基酸序列，h
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fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.100所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.128所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.77所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.110所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.138 所示的氨基酸序列。
271.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000817相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.21所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示
的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.31所示的氨基酸序列，h
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.101所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.129所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.77所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.110所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no. 138所示的氨基酸序列。
272.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000818相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.31所示的氨基酸序列，h
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.102所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.130所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.77所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.110所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no. 138所示的氨基酸序列。
273.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000819相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.17所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.31所示的氨基酸序列，h
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fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.103所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.131所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可以包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seqid no.77所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列， l-fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.110所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no. 138所示的氨基酸序列。
274.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000820相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.17所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.1所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示
的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.27所示的氨基酸序列，h
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.95所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.123所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.81所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.114所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no. 142所示的氨基酸序列。
275.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000822相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.1所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.27所示的氨基酸序列，h
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.100所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.128所示的氨基酸序列。vl可以包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seqid no.81所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列， l-fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.114所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq idno.142所示的氨基酸序列。
276.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000824相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.31所示的氨基酸序列，h
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fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.102所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.130所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.81所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.114所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no. 142所示的氨基酸序列。
277.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000825相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.17所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示
的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.31所示的氨基酸序列，h
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fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.103所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.131所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.81所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.114所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.142 所示的氨基酸序列。
278.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr000832相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.31所示的氨基酸序列，h
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fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.102所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.130所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.84所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.118所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no. 146所示的氨基酸序列。
279.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr003833相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.31所示的氨基酸序列，h
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fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.102所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.130所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.85所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
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fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.119所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no. 146所示的氨基酸序列。
280.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr003834相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示
的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.31所示的氨基酸序列，h
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.102所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.130所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.86所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.120所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.148 所示的氨基酸序列。
281.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr003835相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.31所示的氨基酸序列，h
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.102所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.130所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.87所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.121所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.149 所示的氨基酸序列。
282.又例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr003836相同的hc和lc。hc可包含vh 和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.22所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq idno.34所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.11所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.31所示的氨基酸序列，h
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.42所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.102所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.130所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq idno.88所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.47所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.71所示的氨基酸序列，l
‑ꢀ
fr4可包含如seq id no.89所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.122所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no. 150所示的氨基酸序列。
283.本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：108的vh的至少一个hcdr。
284.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：108的重链可变区vh的hcdr3，并且该hcdr3可包含如seq id no.40：ersssfyyyygmdv(seq id no.40)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
285.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：108的重链可变区vh的hcdr2，并且该hcdr2可包含如seq id no.25：wydgsn(seq id no.25)所示的氨基酸序列。
286.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：108的重链可变区vh的hcdr1，并且该hcdr1可包含如seq id no.10：gftfysy(seq id no.10)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
287.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr1，h-fr1的c末端直接或间接连接至所述 hcdr1的n末端，并且h-fr1可包含如seq id no.3：qvqlvesgggvvqpgrslrlscaas(seq id no.3)所示的氨基酸序列。例如，可以根据 chothia定义确定序列。
288.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr2，h-fr2位于所述hcdr1和所述hcdr2 之间，并且h-fr2可包含如seq id no.15：gmhwvrqtpgkglewvali(seq id no.15) 所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
289.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr3，h-fr3位于所述hcdr2和所述hcdr3 之间，并且h-fr3可包含如seq id no.32： nyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycat(seq id no.32)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
290.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr4，所述h-fr4的n端直接或间接连接至所述hcdr3的c端，并且h-fr4可包含如seq id no.45：wgqgttvtvss(seq id no.45) 所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
291.在本技术中，抗原结合蛋白可包含vh，且vh可包含如seq id no.108： qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfysygmhwvrqtpgkglewvaliwydgsnn yyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycatersssfyyyygmdvwgqgt tvtvss(seq id no.108)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
292.在本技术中，抗原结合蛋白可包含抗体重链恒定区，并且抗体重链恒定区包含人 igg恒定区。在某些情况下，人igg恒定区可以衍生自人igg1恒定区。例如，抗体重链恒定区可包含如seq id no.167：astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswns galtsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscd kthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgv evhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgq prepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgs fflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no.167)所示的氨基酸序列。
293.在本技术中，抗原结合蛋白可包含抗体重链(hc)，hc包含如seq id no.136所示的氨基酸序列。
294.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：116的vl的至少一个lcdr。
295.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：108的重链可变区vh的lcdr3， lcdr3可包含如seq id no.82：qqlnsypyt(seq id no.82)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
296.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：108的重链可变区vh的lcdr2，并且lcdr2可包含seq id no.69:aastlqs(seq id no.69)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
297.在本技术中，抗原结合蛋白可包含来自seq id no：108的重链可变区vh的lcdr1，
并且lcdr1可包含如seq id no.58：rasqgissyla(seq id no.58)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
298.在本技术中，抗原结合蛋白可包含l-fr1，l-fr1的c端直接或间接连接至所述 lcdr1的n端，并且l-fr1可包含如seq id no.52：diqltqspsflstsvgdrvtitc(seqid no.52)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
299.在本技术中，抗原结合蛋白可包含l-fr2，l-fr2位于所述lcdr1和所述lcdr2 之间，并且l-fr2可包含如seq id no.60：wyqqkpgkapklliy(seq id no.60)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
300.在本技术中，抗原结合蛋白可包含l-fr3，l-fr3位于所述lcdr2和所述lcdr3 之间，并且l-fr3可包含如seq id no.75：gvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyyc (seq id no.75)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
301.在本技术中，抗原结合蛋白可包含l-fr4，所述l-fr4的n端直接或间接连接至所述lcdr3的c端，并且l-fr4可包含如seq id no.93：fgqgteleik(seq id no.93) 所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
302.在本技术中，抗原结合蛋白可包含vl，vl可包含如seq id no.116： diqltqspsflstsvgdrvtitcrasqgissylawyqqkpgkapklliyaastlqsgvpsrfs gsgsgteftltisslqpedfatyycqqlnsypytfgqgteleik(seq id no.116)所示的氨基酸序列。例如，可以根据chothia定义确定序列。
303.在本技术中，抗原结合蛋白可包含抗体轻链恒定区，并且抗体轻链恒定区包含人igκ恒定区。例如，抗体轻链恒定区可包含如seq id no.166： rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqds kdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no:166)所示的氨基酸序列。
304.在本技术中，抗原结合蛋白可包含抗体轻链(lc)，并且lc包含如seq id no.144 所示的氨基酸序列。
305.在本技术中，抗原结合蛋白可包含hcdr1-3。hcdr1可包含如seq id no.10所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.25所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如 seq id no.40所示的氨基酸序列。
306.在本技术中，抗原结合蛋白可包含lcdr1-3。lcdr1可包含如seq id no.58所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.69所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seqid no.82所示的氨基酸序列。
307.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr1-4。h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.15所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq idno.32所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seq id no.45所示的氨基酸序列。
308.在本技术中，抗原结合蛋白可包含l-fr1-4。l-fr1可包含如seq id no.52所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq idno.75所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.93所示的氨基酸序列。
309.在本技术中，抗原结合蛋白可包含hcdr1-3和lcdr1-3。hcdr1可包含如seqid no.10所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.25所示的氨基酸序列，hcdr3 可包含如seq id no.40所示的氨基酸序列；lcdr1可包含如seq id no.58所示的氨基酸序列，
lcdr2可包含如seq id no.69所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.82所示的氨基酸序列。
310.在本技术中，抗原结合蛋白可包含h-fr1-4和l-fr1-4。h-fr1可包含如seq idno.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.15所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.32所示氨基酸序列，h-fr4可包含如seq id no.45所示的氨基酸序列。l-fr1 可包含如seq id no.52所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包如seq id no.75所示的含氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.93所示的氨基酸序列。
311.在本技术中，抗原结合蛋白可包含vh和vl。vh可包含如seq id no：108所示的氨基酸序列，vl可包含如seq id no：116所示的氨基酸序列。
312.在本技术中，抗原结合蛋白可包含重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区可包含如 seq id no：167所示的氨基酸序列，轻链恒定区可包含如seq id no：166所示的氨基酸序列。
313.在本技术中，抗原结合蛋白可包含重链(hc)和轻链(lc)。hc可包含如seqid no：136所示的氨基酸序列，lc可包含如seq id no.144所示的氨基酸序列。
314.在本技术中，抗原结合蛋白可包含hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh 可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.10所示的氨基酸序列，hcdr2 可包含如seq id no.25所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.40所示的氨基酸序列；h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seq id no.15所示的氨基酸序列，h-fr3可包含seq id no.32所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seq idno.45所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.108所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.136所示的氨基酸序列。 vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.58所示的氨基酸序列，lcdr2 可包含如seq id no.69所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.82所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.52所示的氨基酸序列，l-fr2可包含seq id no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含seq id no.75所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq idno.93所示的氨基酸序列；vl可包含如seq id no.116所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.144所示的氨基酸序列。
315.例如，抗原结合蛋白可包含与抗体pr001408相同的hc和lc。hc可包含vh和重链恒定区。vh可包含hcdr1-3和h-fr1-4，hcdr1可包含如seq id no.10所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.25所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.40 所示的氨基酸序列。h-fr1可包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，h-fr2可包含如seqid no.15所示的氨基酸序列，h-fr3可包含如seq id no.32所示的氨基酸序列，h-fr4可包含如seq id no.45所示的氨基酸序列；vh可包含如seq id no.108所示的氨基序列；重链恒定区可包含如seq id no.167所示的氨基酸序列；hc可包含如seq id no.136所示的氨基酸序列。vl可包含lcdr1-3和l-fr1-4，lcdr1可包含如seq id no.58所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.69所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.82 所示的氨基酸序列；l-fr1可包含如seq id no.52所示的氨基酸序列，l-fr2可包含如seqid no.60所示的氨基酸序列，l-fr3可包含如seq id no.75所示的氨基酸序列，l-fr4可包含如seq id no.93所示的氨基酸
序列；vl可包含如seq id no.116所示的氨基酸序列；轻链恒定区可包含如seq id no.166所示的氨基酸序列；lc可包含如seq id no.144所示的氨基酸序列。特定抗-cd73抗体
316.在本技术中，抗原结合蛋白可以与某特定抗cd73抗体竞争结合cd73。在一些实施方案中，本技术的抗原结合蛋白可包含抗体，该抗体包含与特定抗cd73抗体相同的氨基酸序列。
317.在某些实施方式中，特定抗cd73抗体可包含来自seq id no：152的重链可变区 vh的至少一个hcdr区和来自seq id no：151的轻链可变区vl的至少一个lcdr区。
318.在本技术中，特定抗cd73抗体可包含hcdr1-3。hcdr1可包含如seq id no.7 所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.153所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.154所示的氨基酸序列。在某些情况下，特定抗cd73抗体可包含lcdr1-3。 lcdr1可包含如seq id no.55所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.66所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.78所示的氨基酸序列。
319.在本技术中，特定抗cd73抗体可以包含vh和vl。vh可包含如seq id no： 152所示的氨基酸序列，vl可包含如seq id no：151所示的氨基酸序列。
320.在本技术中，特定抗cd73抗体可包含重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区可包含如seq id no：167所示的氨基酸序列，轻链恒定区可包含如seq id no：166所示的氨基酸序列。
321.在本技术中，特定抗cd73抗体可包含重链(hc)和轻链(lc)。hc可包含如 seq id no：162所示的氨基酸序列，lc可包含如seq id no：159所示的氨基酸序列。
322.在某些情况下，特定抗cd73抗体可包含来自seq id no：156的重链可变区vh 的至少一个hcdr和来自seq id no：155的轻链可变区vl的至少一个lcdr。
323.在本技术中，特定抗cd73抗体可包含hcdr1-3。hcdr1可包含如seq id no.6 所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.158所示的氨基酸序列，hcdr3可包含 seq id no.34所示的氨基酸序列。在某些情况下，特定抗cd73抗体可包含lcdr1-3。 lcdr1可包含如seq id no.54所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.65所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.157所示的氨基酸序列。
324.在本技术中，特定抗cd73抗体可包含vh和vl。vh可包含如seq id no：156 所示的氨基酸序列，vl可包含如seq id no：155所示的氨基酸序列。
325.在本技术中，特定抗cd73抗体可包含重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区可包含如seq id no：167所示的氨基酸序列，轻链恒定区可包含如seq id no：166所示的氨基酸序列。
326.在某些情况下，特定抗cd73抗体可包含重链(hc)和轻链(lc)。hc可包含如 seq id no：161所示的氨基酸序列，lc可包含如seq id no：160所示的氨基酸序列。
327.在某些情况下，特定抗cd73抗体可包含来自seq id no：108的重链可变区vh 的至少一个hcdr区和来自seq id no：116的轻链可变区vl的至少一个lcdr区。
328.在本技术中，特定抗cd73抗体可包含hcdr1-3。hcdr1可包含如seq id no.10 所示的氨基酸序列，hcdr2可包含如seq id no.25所示的氨基酸序列，hcdr3可包含如seq id no.40所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，特定抗cd73抗体可包含lcdr1-3。 lcdr1可包
含如seq id no.58所示的氨基酸序列，lcdr2可包含如seq id no.69所示的氨基酸序列，lcdr3可包含如seq id no.82所示的氨基酸序列。
329.在本技术中，特定抗cd73抗体可以包含vh和vl。vh可包含如seq id no： 108所示的氨基酸序列，vl可包含如seq id no：116所示的氨基酸序列。
330.在本技术中，特定抗cd73抗体可包含重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区可包含如seq id no：167所示的氨基酸序列，轻链恒定区可包含如seq id no：166所示的氨基酸序列。
331.在本技术中，特定抗cd73抗体可包含重链(hc)和轻链(lc)。hc可包含如 seq id no：136所示的氨基酸序列，lc恒定区可包含如seq id no：144所示的氨基酸序列。
332.本公开的抗原结合蛋白还可以包括与其具有基本相同的功能/特性的同源物或其变体。在某些实施方式中，同源物或变体可以是与抗原结合蛋白至少有一个氨基酸不同的多肽。例如，同源物或变体可以是在抗原结合蛋白基础上进行了一个或多个(例如1-50、1-40、1
‑ꢀ
30、1-20、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2 个)氨基酸的添加，缺失或取代获得的多肽。
333.在某些情况下，可以通过胚系化和ptm去除操作进一步优化抗原结合蛋白。术语“胚系化”是指将抗体的超体细胞突变逆转为相应胚系序列的过程。术语“ptm去除”是指使 ptm基序突变以降低序列不稳定性风险的过程。
334.在哺乳动物细胞中表达的蛋白质中广泛观察到翻译后修饰(ptm)，这可能导致了分子的不稳定性和异质性。为了减少序列不稳定性，可以通过突变去除ptm基序。ptm去除位点可以是异构化基序，例如cdr中的dg。在一些情况下，ptm去除位点可包括一个或多个选自hcdr中的d54，g55，d99和/或g100的位点。在某些情况下，d54中的ptm 去除可以是d54e。在某些情况下，g55中的ptm去除可以是g55a。在某些情况下，d99 中的ptm去除可以是d99e。在某些情况下，g100中的ptm去除可以是g100a。
335.ptm去除后的抗体可以具有相似或更高的化学稳定性或生物活性。在某些情况下，去除ptm后的抗体可能具有相似或更高的结合亲和力，酶活性，t细胞活化活性，肿瘤抑制活性和/或血清稳定性。例如，ptm去除抗体(例如，pr000844，pr000846)与ptm抗体(例如，pr000506)具有相当的结合亲和力。
336.某些情况下，同源物或变体可以是与抗原结合蛋白具有至少80％序列同一性的多肽。例如，同源物或变体可以是与抗体或抗原结合蛋白具有至少具有80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高)的序列同一性的多肽。
337.如对本文所鉴定的多肽序列进行表述的上下文中所用，术语“序列同一性百分比(％)”通常是指在比对序列后，查询序列中氨基酸残基或核苷酸与第二参考多肽序列或其部分中相同的残基所占百分比，必要时引入空位(gaps)以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸/核苷酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域已知的各种方式来实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如blast， blast-2，align，needle或megalign(dnastar)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。同一性百分比可以在整个确定的多肽/多核苷酸序列的长度上测定，或者可以在较短的长度上，
例如在从较大的确定的多肽/多核苷酸序列中获得的片段的长度上测定。应当理解，在表，附图或序列表中，本文所示的序列所支持的任何片段长度可用于作为可测量同一性百分比的长度。核酸，载体和细胞
338.在另一方面，本技术提供了编码分离的抗原结合蛋白的一种或多种分离的核酸分子。
339.分离的核酸可以包含一种或多种核酸分子，每种核酸分子编码抗原结合蛋白。例如，分离的核酸可以包含至少两种核酸分子，其中一种编码抗体重链或其片段，而另一种编码抗体轻链或其片段。
340.分离的一种或多种核酸可以使用本领域众所周知的重组技术合成。例如，分离的一种或多种核酸可以用自动化dna合成仪合成。标准的重组dna和分子克隆技术记载于文献 sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis,t.molecular cloning:a laboratory manual；cold springharbor laboratory press:cold spring harbor,(1989)(maniatis)和t.j.silhavy,m.l.bennan, 和l.w.enquist,experiments with gene fusions,cold spring harbor laboratory,cold springharbor,n.y.(1984)和ausubel,f.m.等人.,current protocols in molecular biology,pub.bygreene publishing assoc.和wiley-interscience(1987).简言之，目标核酸可以从基因组dna 片段，cdna和rna制备，所有这些都可以直接从细胞中提取或通过各种扩增方法重组产生，包括但不限于pcr和rt-pcr。
341.核酸的直接化学合成通常涉及将3'封闭和5'封闭的核苷酸单体顺序添加到生长的核苷酸聚合物链的末端5'-羟基上，其中每次加成是通过在所加单体(通常是磷衍生物，例如磷酸三酯，亚磷酰胺等)的3
′‑
位置进行生长链末端5
′‑
羟基的亲核攻击而实现的。例如参见， matteuci等人，tet.lett.521:719(1980)；美国专利4,500,707，caruthers等人；和美国专利 5,436,327和5,700,637，southern et等人。
342.在另一方面，本公开提供了一种或多种载体，其包含一个或多个分离的核酸分子。
343.载体可以是任何线性核酸，质粒，噬菌粒，粘粒，rna载体，病毒载体等。病毒载体的非限制性实例可包括逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒。在一些实施方案中，载体是表达载体，例如质粒。
344.表达载体可能适用于特定类型的宿主细胞，而不适用于其他宿主细胞。例如，可以将表达载体引入宿主生物中，然后监测宿主生物的活力和载体中所含任何基因/多核苷酸的表达。
345.表达载体还可包含一种或多种可选择的标记基因，其在表达后赋予一种或多种表型性状，其可用于选择或以其他方式鉴定携带表达载体的宿主细胞。真核细胞的合适选择标记的非限制性例子包括二氢叶酸还原酶和新霉素抗性。
346.目标载体可以通过多种已建立的技术稳定地或瞬时地转入宿主细胞。例如，一种方法涉及氯化钙处理，其中通过钙沉淀物引入表达载体。其他盐，例如磷酸钙，也可以按照类似的步骤使用。另外，可以使用电穿孔(即，施加电流以增加细胞对核酸的渗透性)技术。转化方法的其他实例包括显微注射，deae葡聚糖介导的转化和在乙酸锂存在下的热激。脂质复合物，脂质体和树状聚合物也可以用于转染宿主细胞。
347.在另一方面，本技术提供了一种细胞(例如，分离的细胞，例如宿主细胞)，其包含本技术的一种或多种分离的核酸分子或本技术的一种或多种载体。细胞可以表达本技术的抗原结合蛋白。该细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的细胞可被本技术的核酸或载体转化或转染，并用于表达和/或分泌抗原结合蛋白。例如，细胞可以是hek293细胞，其他细菌宿主细胞，酵母细胞或各种更高级的真核细胞。
348.另一方面，本公开提供了一种产生本公开的抗原结合蛋白的方法，包括在能够表达抗原结合蛋白的条件下培养本公开的细胞。所述方法任选地可以进一步包括收获本公开的抗原结合蛋白。药物组合物，用途和方法
349.在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含分离的抗原结合蛋白，一个或多个核酸分子，一个或多个载体，和/或细胞，以及药学上可接受的载体。
350.如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序以及通过添加各种抗菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚山梨酸等来防止微生物的存在。还可在组合物中添加等渗剂，例如糖，氯化钠等。此外，可通过添加延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
351.药物组合物通常必须在生产和储存条件下是无菌的和稳定的。可以将组合物配制为溶液，微乳剂，脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。如，可以通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇，山梨醇或氯化钠。可通过在组合物中添加延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
352.本文公开的药物组合物可以包括用于治疗癌症的其他化合物，药物和/或药剂。这种化合物，药物和/或药剂可以包括例如刺激对给定癌症的免疫应答的化学疗法药物，小分子药物或抗体。在一些情况下，药物组合物可以包括例如在联合疗法部分中列出的一种或多种试剂。例如，联合疗法可以包括本文所述的抗cd73抗体与至少一种其他抗癌和/或t细胞刺激 (例如，活化)剂的组合。可在联合疗法中使用的治疗剂的实例在下文关于本文所述抗体的用途的部分中进行更详细地描述。
353.分离的抗原结合蛋白和/或药物组合物可以用于预防，减轻和/或治疗肿瘤。肿瘤为实体瘤和/或血液肿瘤。
354.在另一方面，本公开进一步提供了一种用于肿瘤的方法，该方法包括预防，缓解和 /或治疗肿瘤，该方法包括向有此需要的受试者施用分离的抗原结合蛋白，从而治疗该受试者，例如，从而抑制或减少了肿瘤的生长和/或使肿瘤消退。分离的抗原结合蛋白可单独用于抑制癌性肿瘤的生长。或者，分离的抗原结合蛋白可以与本领域已知的另一种试剂例如其他免疫原性试剂，标准癌症治疗或其他抗体结合使用。因此，本技术提供了用于例如通过抑制受试者中的肿瘤细胞的生长来预防，缓解和/或治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的抗原结合蛋白或其抗原结合部分。
355.本公开还公开了如下实施方案：
1.所述的分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：a.能够以相当的亲和力结合人cd73和食蟹猴的cd73；b.能够抑制cd73的5
′
外切核苷酸酶活性；c.能够介导cd73的内化；d.能够解除腺苷对t细胞增殖抑制作用；e.保持血清中相对稳定浓度至少15天；以及f.能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。2.实施方案1的分离的抗原结合蛋白，其包含来自seq id no：152的重链可变区vh 的至少一个hcdr区。3.实施方案1-2中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含来自seq id no：152的重链可变区vh的hcdr3。4.实施方案1-3中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含来自seq id no：152的重链可变区vh的hcdr2。5.实施方案1-4中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含来自seq id no：152的重链可变区vh的hcdr1。6.实施方案1-5中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述vh包含seq id no：96、 104、105、106和107中任一个所示的氨基酸序列。7.实施方案1-6中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含来自seq id no：151的轻链可变区vl的至少一个lcdr区。8.实施方案1-7中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含来自seq id no：151的轻链可变区vl的lcdr3。9.实施方案1-8中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含来自seq id no：151的轻链可变区vl的lcdr2。10.实施方案1-9中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含来自seq id no：151的轻链可变区vl的lcdr1。11.实施方案1-10中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述vl包含seq id no：111 和115中任一个所示的氨基酸序列。12.实施方案1-11中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体或其抗原结合片段。13.实施方案12的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包含fab，fab
′
，f (ab)2，fv片段，f(ab
′
)2，scfv，di-scfv和/或dab。14.实施方案1-13中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自单克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体和全人源抗体。15.实施方案3-14中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述hcdr3包含seq idno：35、38和39中任一个所示的氨基酸序列。16.实施方案4-15中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述hcdr2包含seq idno：18、23和24中任一项所示的氨基酸序列。17.实施方案1-16中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区vl，其中所述抗原结合蛋白的所述vl包含框架区l-fr1，l-fr2，l-fr3和l-fr4。
18.实施方案17的分离的抗原结合蛋白，其中所述l-fr1的c端直接或间接连接至所述 lcdr1的n端，并且所述l-fr1包含如seq id no：163所示的氨基酸序列。19.实施方案17-18中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述l-fr1包含如seq idno：48和51中任一个所示的氨基酸序列。20.实施方案17-19中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述l-fr2位于所述lcdr1 和所述lcdr2之间，并且所述l-fr2包含如seq id no：61所示的氨基酸序列。21.实施方案17-20中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述l-fr3位于所述lcdr2 和所述lcdr3之间，并且所述l-fr3包含如seq id no：72所示的氨基酸序列。22.实施方案17-21中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述l-fr4的n-末端直接或间接连接至所述lcdr3的c-末端，并且所述l-fr4包含如seq id no：90所示的氨基酸序列。23.实施方案1-22中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的所述vl 包含如seq id no：151所示的氨基酸序列。24.实施方案1-23中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的所述vl 包含如seq id no：111和115中任一个所示的氨基酸序列。25.实施方案1-24中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链恒定区，并且所述抗体轻链恒定区包含人igκ恒定区。26.实施方案25的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体轻链恒定区包含如seq id no： 166所示的氨基酸序列。27.实施方案1-26中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链lc，并且所述lc 包含如seq id no：159所示的氨基酸序列。28.实施方案1-27中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链lc，并且所述lc 包含seq id no：139和143中任一项所示的氨基酸序列。29.实施方案1-28中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中包含重链可变区vh，其中所述抗原结合蛋白的vh包含框架区h-fr1，h-fr2，h-fr3和h-fr4。30.实施方案29的分离的抗原结合蛋白，其中所述h-fr1的c末端直接或间接连接至所述hcdr1的n末端，并且所述h-fr1包含如seq id no：2所示的氨基酸序列。31.实施方案29-30中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述h-fr2位于所述hcdr1 和所述hcdr2之间，并且所述h-fr2包含如seq id no：12所示的氨基酸序列。32.实施方案29-31中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述h-fr3位于所述hcdr2 和所述hcdr3之间，并且所述h-fr3包含如seq id no：28所示的氨基酸序列。33.实施方案29-32中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述h-fr4的n-末端直接或间接连接至所述hcdr3的c-末端，并且所述h-fr4包含如seq id no：43所示的氨基酸序列。34.实施方案1-33中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的vh包含如seq id no：152所示的氨基酸序列。35.实施方案1-34中任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的vh包含如seq id no：96、104、105、106和107中任一个所示的氨基酸序列。36.实施方案1-35中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链恒定区，并且
所述抗体重链恒定区包含人igg恒定区。37.实施方案1-36中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链恒定区，并且所述抗体重链恒定区包含人igg1恒定区。38.实施方案37的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含如seq id no： 167所示的氨基酸序列。39.实施方案1-38中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链hc，并且所述hc 包含如如seq id no：162所示的氨基酸序列。40.实施方案1-39中任一项的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链hc，并且所述hc 包含如seq id no：124、132、133、134和135中任一个所示的氨基酸序列。41.一种或多种分离的核酸分子，其编码1-40中任一项实施方案的所述分离的抗原结合蛋白。42.一种或多种载体，包含实施方案41的所述分离的一种或多种分离的核酸分子。43.一种细胞，其包含所述分离的实施方案41的核酸分子或分子，或所述实施方案42的一种或多种载体。44.一种产生实施方案1-40中任一项的分离的抗原结合蛋白的方法，其包括在能够表达实施方案1-40中任一项的分离的抗原结合蛋白的条件下培养实施方案43的细胞。45.一种药物组合物，其包含实施方案1-40中任一项的分离的抗原结合蛋白，实施方案 41的一个或多个核酸分子，实施方案42的一种或多种载体和/或实施方案43的细胞，和任选地，药学上可接受的佐剂。46.实施方案1-40中任一项的所述分离的抗原结合蛋白，实施方案41的所述分离的一种或多种核酸分子，实施方案42的所述一种或多种载体，实施方案43的细胞和/或实施方案45的所述药物组合物的用于生产预防，减轻和/或治疗肿瘤的药物。47.实施方案46的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或血液肿瘤。48.一种预防，缓解和/或治疗肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用实施方案1-40 中任一项的分离的抗原结合蛋白。本公开还公开了如下实施方案：1.分离的抗原结合蛋白，其包含来自于seq id no:168所示抗体重链可变区vh的 hcdr1,hcdr2和/或hcdr3区中的任一个。2.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其进一步包含包含来自于seq idno:169所示抗体轻链可变区的lcdr1,lcdr2和/或lcdr3区中的任一个。3.根据实施方案1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：a.能够以相当的亲和力结合人cd73和食蟹猴的cd73；b.能够抑制cd73的5
′
外切核苷酸酶活性；c.能够调节cd73的内化；d.能够促进t细胞增殖；e.保持血清中相对稳定浓度至少15天；以及f.能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。4.根据实施方案1-3任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结
合片段。5.根据实施方案4所述的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合片段包括fab， fab'，f(ab)2，fv片段，f(ab')2，scfv，di-scfv和/或dab。6.根据实施方案4-5任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中选择所述抗体来自单克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体和完全人源抗体。7.根据实施方案1-6任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含来自于seq id no: 152所示的重链可变区vh的hcdr1,hcdr2和/或hcdr3区中的任一个。8.根据实施方案7所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述vh包含seq id no:96, 104,105,106和107中任一个所示的氨基酸序列。9.根据实施方案7-8任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含来自于seq id no: 151所示的轻链可变区vl的lcdr1,lcdr2和/或lcdr3区中的任一个。10.根据实施方案9所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述vl包含seq id no:111 和115种任一个所示的氨基酸序列。11.根据实施方案7-10任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述hcdr3包含 seq id no:154所示的氨基酸序列。12.根据实施方案7-11任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述hcdr3包含seq id no:35,38和39中任一个所示的氨基酸序列。13.根据实施方案7-12任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述hcdr2包含 seq id no:153所示的氨基酸序列。14.根据实施方案7-13任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述hcdr2包含 seq id no:18,23和24中任一个所示的氨基酸序列。15.根据实施方案7-14任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述hcdr1包含 seq id no:7所示的氨基酸序列。16.根据实施方案7-15任一项所述的分离的抗原结合蛋白，包含重链可变区vh，其中所述vh包含seq id no:152所示的氨基酸序列。17.根据实施方案16所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述vh包含seq id 96,104, 105,106和107中任一个所示的氨基酸序列。18.根据实施方案7-17任一项所述的分离的抗原结合蛋白，包含抗体重链hc，所述 hc包含seq id no:124,132,133,134,和135中任一个所示的氨基酸序列。19.根据实施方案9-18任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述lcdr3包含 seq id no:78所示的氨基酸序列。20.根据实施方案9-19任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述lcdr2包含 seq id no:66所示的氨基酸序列。21.根据实施方案9-20任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述lcdr1包含 seq id no:55所示的氨基酸序列。22.根据实施方案9-21任一项所述的分离的抗原结合蛋白，包含轻链可变区vl，所述vl包含seq id no:151所示的氨基酸序列。23.根据实施方案9-22任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述vl包含seq idno:111和115中任一个所示的氨基酸序列。
108所示的重链可变区vh的hcdr1，hcdr2和/或hcdr3区中任一个。44.根据实施方案43所述的分离的抗原结合蛋白，包含来自于seq id no:116所示的轻链可变区vl的lcdr1，lcdr2和/或lcdr3区中任一个。45.根据实施方案43-44任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述hcdr3包含 seq id no:40所示的氨基酸序列。46.根据实施方案43-45任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述hcdr2包含 seq id no:25所示的氨基酸序列。47.根据实施方案43-46任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述hcdr1包含 seq id no:10所示的氨基酸序列。48.根据实施方案43-47任一项所述的分离的抗原结合蛋白，包含重链可变区vh，所述vh包含seq id no：108所示的氨基酸序列。49.根据实施方案43-48任一项所述的分离的抗原结合蛋白，包含抗体重链hc，所述 hc包含seq id no:136所示的氨基酸序列。50.根据实施方案44-49任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述lcdr3包含 seq id no:82所示的氨基酸序列。51.根据实施方案44-50任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述lcdr2包含 seq id no:69所示的氨基酸序列。52.根据实施方案44-51任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述lcdr1包含 seq id no:58所示的氨基酸序列。53.根据实施方案44-52任一项所述的分离的抗原结合蛋白，包含轻链可变区vl，所述vl包含seq id no:116所示的氨基酸序列。54.根据实施方案43-53任一项所述的分离的抗原结合蛋白，包含抗体轻链lc，所述 lc包含seq id no:144所示的氨基酸序列。55.一种或多种分离的核酸分子，其编码实施方案1-54任一项所述的分离的抗原结合蛋白。56.一种或多种载体，其包含实施方案55所述的一种或多种分离的核酸分子。57.细胞，其包含实施方案55所述的一种或多种分离的核酸分子或实施方案56所述的一种或多种载体。58.制备实施方案1-54任一项所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得实施方案1-54任一项所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养实施方案57 所述的细胞。59.药物组合物，其包含实施方案1-54任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案 55所述的一种或多种分离的核酸分子，实施方案56所述的载体，和/或实施方案57 所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。60.实施方案1-54任一项所述的分离的抗原结合蛋白，实施方案55所述的一种或多种核酸分子，实施方案56所述的一种或多种载体，实施方案57所述的细胞和/或实施方案59所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。61.实施方案60所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或血液肿瘤。62.预防、缓解和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用实施
(eppendorf，5810r)4℃离心，将缓冲液与dpbs进行500倍以上的交换，最后浓缩至合适的体积。纯化的抗cd73抗体的浓度通过在280nm(nanodrop)处的uv吸光度确定。通过 sec-hplc和sds-page测定抗体纯度。重组抗体pr000506被成功表达并纯化用于表征。
363.实施例3抗体工程
364.抗cd73抗体pr000506的vh和vl序列通过胚系化和ptm去除操作进行了进一步优化。
365.在胚系化程序中，抗体vh或vl序列首先通过例如ncbi/ig-blast的算法比对到最接近的人类胚系序列，然后将框架区的具有不同于胚系序列的残基反转为胚系序列中的对应残基。然后通过成熟的分子生物学技术重组产生胚系化后的由序列变体组成的抗体。
366.在哺乳动物细胞中表达的蛋白质中广泛观察到翻译后修饰(ptm)。除了抗体中保守的ptm位点(例如igg1抗体ch2结构域上的n-糖基化保守位点)外，在抗体抗原结合位点(即cdr区)内发生的其他ptm位点可能会降低抗原结合活性或降低化学稳定性。例如，脱酰胺或异构化可以使分子变得不稳定和异质化。为了减少序列不稳定性，可以通过突变去除ptm基序。查找vh或vl序列的ptm基序，例如异构化基序(例如dg)。然后将“热点”残基(例如，dg基序中的d或g)突变为胚系序列中的对应残基或具有类似生物物理特性的其他残基。然后，通过成熟的分子生物学技术重组产生由ptm去除后的序列变体组成的抗体。
367.表2显示了pr000506，pr000497和pr001408的序列分析结果。表3显示了 pr000506通过胚系化和ptm去除设计的变体。抗cd73抗体的氨基酸序列示于表4，其中 pr000815-pr000820，pr000822，pr000824，pr000825和pr003832-pr003836是从pr000497 衍生的ptm去除的抗体。pr002078是tab1，pr000752是tab 2，pr000690是tab3。表2抗cd73抗体胚系基因分析表3 pr000506-衍生的变体设计
表4本技术中抗cd73抗体的seq id no
实施例4抗cd73抗体与cd73的结合
368.通过流式细胞术表征抗体与稳转细胞系中表达的人cd73和猴cd73结合。将细胞与各种浓度的抗体(最高浓度为50nm，8个点，稀释系数3)一起孵育，然后在4℃孵育1小时。用pbs洗涤两次，然后加入二抗山羊抗人igg(h+l)(thermo fisher，a11013)，在 4℃孵育30分钟。通过facs机器(bd facs cantoii)读取荧光强度。用graphpad prism 5 拟合并计算抗原抗体结合的荧光强度中位平均值和抗体浓度的关系图，并计算结合ec50。结果示于图1-5和表5-8。
369.图1和图3显示了抗cd73抗体与cho-k1-hcd73稳转细胞系的结合活性。表5 和表6显示了ptm去除抗体针对cho-k1-hcd73稳转细胞系的ec50。表7显示了ptm去除抗体的ec50与pr000506的ec50的比例。图2显示了抗cd73抗体与hek293-cynocd73 稳转细胞系的结合活性。表8显示了ptm去除抗体针对hek293-cynocd73稳转细胞系的ec50。图4和图5显示了抗cd73抗体对cho-k1-hcd73稳转细胞系的结合活性。结果表明所有抗体与基于细胞的cd73具有相当高的亲和力。表5 ptm去除抗体针对cho-k1-hcd73稳转细胞系的ec50
ꢀꢀ
pr000506pr000843pr000844pr000845pr000846pr000851ec 50(nm)0.73421.8550.83580.85270.74990.7997表6 ptm去除抗体针对cho-k1-hcd73稳转细胞系的ec50
ꢀꢀ
tab1pr000506pr000847pr000848pr000849pr000850ec 50(nm)2.1721.0473.0261.5281.0790.8790表7与pr000506ec50的比值抗体名抗体ec50/pr000506 ec50tab12.074pr0008432.527pr0008441.138pr0008451.161
pr0008461.021pr0008472.890pr0008481.459pr0008491.031pr0008500.840pr0008511.089表8 ptm去除抗体与hek293-cynocd73稳转细胞系结合的ec50
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tab1pr000506pr000844pr000846pr000849pr000850ec 50(nm)0.62290.32250.47500.30710.51460.3467实施例5抗cd73抗体对5
′
核苷酸外切酶的抑制作用5.1抗cd73抗体抑制基于细胞的cd73酶活性
370.通过在体外实验中，在cho-k1-hcd73稳转细胞系中，测定抗体对cd73催化的 amp水解为腺苷的抑制程度来确定抗cd73抗体的功能活性。通过胰蛋白酶-edta消化细胞，然后1000rpm离心5分钟，将细胞重悬于无血清的f12k培养基中，使用细胞计数器 (thermofisher，countess
tm ii自动细胞计数器)对细胞计数，然后以每100ul 5000个细胞的浓度接种至96孔平板(corning，3599)，并向平板中加入4倍稀释的抗体(8个浓度点，用无血清培养基1：5稀释)，在37℃下孵育30分钟。然后将50μl 4
×
amp(终浓度为200μm) 加入板中，然后在37℃下孵育1小时。将板子以1500rpm离心3分钟，然后将50μl培养物上清液转移至黑色96孔板(perkinelmer，6005225)中，然后加入2
×
atp(终浓度为65μm)。按照制造商的说明添加100μl/孔的cell titer-glo(promega，g7573)，并通过pe enspire 工作站读取记录发光值。阻断活性用下式计算：阻断％＝[(最大发光值-样品发光值)/(最大发光值-最小发光值)]
×
100。注意：在最大发光孔中加入amp，atp与细胞。最小发光孔中添加了amp，atp，无细胞。
[0371]
通过graphpad prism分析制作ec 50图。结果显示在图6中。图6a-6b显示了抗 cd73抗体对cho-k1表面的cd73酶活性的抑制。表9和表10显示了抗体与cho-k1
‑ꢀ
hcd73稳转细胞系结合ec50。可以看出，所有抗体都具有阻断细胞表面的cd73酶活性的能力。并且pr000506的阻断活性优于tab1。表9抗cd73抗体针对cho-k1-hcd73的ec50
ꢀꢀ
tab1pr000506pr000844pr000846ec50(nm)0.12180.073760.20730.1514表10抗cd73抗体针对cho-k1-hcd73的ec50
ꢀꢀ
tab1pr000849pr000850ec50(nm)0.073300.22430.10915.2抗cd73抗体抑制可溶性cd73酶的活性
[0372]
使用孔雀石绿测定法测量可溶性重组cd73活性，在384孔板(corning，3799)中加入12.5μl用实验缓冲液配置的1nm重组cd73蛋白和12.5μl用实验缓冲液配置的1nm抗体，测定缓冲液成分为25mm tris ph 7.5，5mm mgcl2、0.005％tween-20，室温孵育1小时。加入25μl的amp(最高浓度200μm，用测定缓冲液中按1：2稀释8个浓度点)，并将样品在室温下孵育
15分钟。按照制造商的说明，使用孔雀绿测定法测定无机磷酸盐的浓度。利用pe envision工作站记录在620nm处的光密度值。通过graphpad prism分析作图。结果显示在图7和图8中。可以看出，所有抗体均具有阻断可溶性cd73的酶活性并抑制cd73 使amp脱去腺苷的能力。实施例6通过抗cd73抗体内化cd736.1流式细胞术检测抗体介导的cd73内化试验
[0373]
将nci-h292细胞在50nm抗体或阴性对照同种型igg1的存在下于37℃温育4小时或30分钟。用pbs洗涤平板两次，然后向同型对照孔igg1中加入50nm 100μl抗体，将平板在4℃孵育1小时，用pbs洗涤平板两次。吸出洗涤缓冲液，并每孔加入100μl含二抗山羊抗人igg(h+l)(thermofisher，a-21445)的facs缓冲液。在4℃下孵育30分钟。用pbs洗涤平板两次，并用100μl pbs悬浮细胞。然后用facs machine(bd facs cantoii) 读取中值荧光强度，通过以下公式计算表面残留％＝[抗体4h/(同种型4h+抗体)]
×
100
[0374]
结果显示在图9a和图11中。本技术的抗体可以在4小时后介导cd73内在化。6.2内化试剂盒检测抗体介导的cd73内化试验
[0375]
通过胰蛋白酶-edta消化细胞cho-k1-hcd73，然后以1000rpm离心5分钟，将细胞重悬于含10％fbs的f12k培养基中。使用细胞计数器(thermofisher，countess tm ii 自动细胞计数器)进行细胞计数，然后以每90μl 5000个细胞接种到96孔平黑tc板 (perkinelmer，6005225)中。在37℃，5％co2的培养箱中孵育过夜。将10
×
稀释的抗体(最高浓度10nm，6个浓度点，用完全的f12k培养基1:5稀释)加入平板中，制备浓度为50μg/ ml的hu-zap缓冲液(50
×
)。加入2μl到孔中，最终浓度为1μg/ml。在5％co2培养箱中于 37℃孵育3天。按照制造商的说明添加100ul/孔的cell titer-glo(promega，g7573)。并通过pe enspire工作站记录发光。结果通过cd73内化％计算。注意：对照孔仅接种细胞后并用培养基补至与抗体孔相同的体积。通过graphpad prism分析制图。
[0376]
结果显示在图9b和图10中。本技术的抗体可以在3天后介导cd73内化抑制细胞的生长。实施例7抗体抑制amp介导的cd4+t细胞增殖抑制试验7.1从新鲜的人pbmc中分离出cd4+t细胞
[0377]
通过在4℃下以300
×
g离心10分钟，将pbmc用预冷的pbs洗涤两次。丢弃上清液，并将细胞悬浮在20ml预冷的pbs中。用细胞计数仪确定细胞数和细胞活率，然后以300
×
g 离心7分钟。完全弃去上清液。按照制造商的方案(miltenyi，130-045-101)分离cd4+t细胞。7.2 cfse标记
[0378]
即用即配celltrace
tm
储备溶液(invitrogen，c34554)，通过向一小瓶celltrace
tm
试剂(组分a)中添加适量的dmso(组分b)并充分混合，在预热的(37℃)磷酸盐缓冲盐水(pbs)或其他不含蛋白质的缓冲液中稀释celltrace
tm dmso储备溶液(5mm)至1μm (5000倍)，按照制造商的说明标记细胞。7.3 t细胞活化和扩增
[0379]
使用温的完全培养基将来自每个供体的cd4+t细胞洗涤两次，并以每毫升2
×
106个细胞的量悬浮。免疫磁珠人t细胞激活剂cd3/cd28(life，11131d)以1
×
106/ml悬浮。以1：1的比例混合细胞和免疫磁珠。加入100μl/孔的细胞和珠子混合物到96孔平底平板中。
7.4加入4
×
抗体
[0380]
加入4
×
抗体50μl，抗体浓度：6个点(最高浓度为20nm，用rpmi1640完全培养基按1/10比例稀释6个点)。在37℃，5％co2下孵育平板30分钟。7.5加入4
×
amp
[0381]
加入50μl的4
×
amp(sigma)(终浓度为650μm或800μm)，将平板在37℃， 5％co2下孵育96h。7.6流式细胞仪分析
[0382]
在350g离心5分钟使细胞沉淀，用200μlpbs洗涤一次，最后用200μl pbs重悬细胞，在bd facs canto ii上进行流式细胞术分析。
[0383]
结果显示在图12和图13中。抗体可以解除amp介导的cd4
+
t细胞增殖的抑制。抑制效果呈现出剂量依赖的方式。实施例8 pk分析8.1平板包被
[0384]
用pbs将抗原cd73稀释至5μg/ml。以50μl/孔加入elisa板。密封板子并在 4℃下孵育过夜。用300μl洗涤缓冲液洗涤平板3次。加入200μl/孔的封闭缓冲液，并在室温下孵育1-3小时。用300μl洗涤缓冲液洗涤板子3次。8.2制备标准品，质控品，测试样品和样品孵育
[0385]
标准品：用5％混合小鼠血清1：2稀释标准品。八个标准品的浓度范围为50至 0.391ng/ml。灵敏度为0.391ng/ml。质控品制备：在5％混合小鼠血清中制备两组质控品。hqc(40ng/ml)，mqc(10ng/ml)和lqc(2ng/ml)。样品制备：首先将所有血清样品在实验稀释液中稀释20倍。在5％混合小鼠血清中进行进一步的稀释。将50μl标准液，质控品和样品添加到elisa板中。将板密封并在37℃下孵育约1小时。8.3检测试剂反应
[0386]
用300μl洗涤缓冲液洗涤板3次。制备结合hrp的检测抗体工作溶液：将抗体溶液以1：5000的比例稀释在实验稀释液中。按100μl/孔将检测抗体工作溶液添加到测定板中。将板子密封并在37℃下孵育30分钟。8.4底物反应和读板
[0387]
用300μl洗涤缓冲液洗涤板子3次。准备tmb工作溶液：使用前将底物置于室温 30分钟。混合等体积的底物a和底物b。加入100μl/孔的预混合tmb底物，并在室温下孵育约6分钟。添加100μl/孔的elisa终止溶液。混匀并使用spectramax m2在450/630nm 波长读取数值。使用soft max pro gxp做数据处理。使用系数为1/y的4-pl模型拟合标准曲线。
[0388]
图14a和表11显示了pr000506在雌性c57bl/6小鼠中以5mg/kg的iv剂量给药后的抗体浓度-时间曲线(n＝6/时间点)。图14b和表12示出了pr000846在雌性c57bl /6小鼠中以10mg/kg的iv剂量给药后的抗体浓度-时间曲线(n＝3/时间点)。血清中 pr000506的t
1/2
为17.4天，pr000846为18.1天。图14c和表13示出了pr000497在雌性 c57bl/6小鼠中以5mg/kg的iv剂量给药后的抗体浓度-时间曲线(n＝6/时间点)。表11 5mg/kg剂量，雌性c57bl/6小鼠(n＝6/时间点)pr000506
表12 10mg/kg剂量，雌性c57bl/6小鼠(n＝3/时间点)pr000846 pk参数单位均值sdcv(％)clml/day/kg3.230.45414.4vssml/kg81.79.379.04terminal t
1/2
day18.11.5412.9auc
last
day*μg/ml132913714.3auc
inf
day*μg/ml309843015.5表13 5mg/kg剂量，雌性c57bl/6小鼠(n＝6/时间点)pr000497 pk parameters单位均值sdcv(％)clml/day/kg4.830.2835.87vssml/kg80.74.595.70terminal t
1/2
day12.31.098.89auc
last
day*μg/ml59121.03.55auc
inf
day*μg/ml103960.25.79实施例9体内肿瘤抑制
[0389]
在第0天,用nci-h292细胞和pbmcs皮下接种ncg小鼠获得肿瘤模型。荷瘤小鼠分为以下几组：同种型对照组，tab1组，pr000506组，tab3组，pr000846组和pr000497 组。在每组中，每周两次，连续3周用10mpk剂量的抗体治疗小鼠。在选定的时间测量肿瘤的体积和小鼠体重。
[0390]
结果显示在图15和16中。可以看出，抗cd73抗体具有抑制肿瘤生长的作用。实施例10测定pr000846结合的cd73的表位
[0391]
在该实施例中，通过氢氘交换质谱法(hdx-ms)确定了抗cd73抗体pr000846 与cd73结合的表位，并且通过对cd73重组蛋白的丙氨酸突变扫描确认了该表位的关键氨基酸。氢氘交换质谱(hdx-ms)
[0392]
通过genechem(吉凯基因)进行hdx-ms实验，方法如以下文献所述(park ih等人.,j.chem.inf.model.；55(9):1914-1925(2015)；chalmers mj,等人,anal.chem.；78(4):1005
‑ꢀ
14(2006))。在4℃下过夜孵育制备抗体抗原复合物，使用1：1的摩尔比。
[0393]
取2μl的0.5mg/ml重组人cd73蛋白(novoprotein，c446)，分别加入2ul pbs 或2μl等摩尔当量的待测抗体，然后添加到36μl的d2o缓冲液中。在室温下进行30s，120s， 600s，
1800s，7200s交换后，加入40μl 4℃预冷的quench buffer(0.5m tcep,4m盐酸胍， ph＝2.5)混匀中止反应。样品经pepsin在线酶切柱酶切后，用lc-ms进行氢氘交换数据采集。色谱梯度同覆盖率测试。氢氘交换数据分析：用proteomediscoverer2.1进行肽段文库构建，采用hdexaminer进行氢氘交换数据分析。图17-20描述了氢氘交换ms(hdx-ms)分析的结果，表明cd73和cd73+pr000846氢氘交换实验中各个肽段氘吸收值的差异。
[0394]
图17：每个数据点指示cd73+pr000846复合物(y轴上的正值)和单独的cd73 (y轴上的负值)之间的氘摄取差异。垂直条表示整个暴露时间-点的摄取差异之和。水平轴对应于从n-至c-末端(从左至右)分析的肽。比较游离的和复合的cd73之间的交换动力学，发现当结合pr000846时，位于scd73的n-末端结构域内的3个区域(区域1：aa115
–
164；区域2：aa168
–
191；区域3：aa222-254)减少了氘的吸收量。
[0395]
图18-20所示，在区域1、2、3的肽中，氘的相对摄入量(道尔顿的质量变化)在不同时间点的变化。为了使包含显示氢交换变化的序列区域变窄从而可以预测表位，比较了重叠肽的相对质量变化。例如，在区域2中，跨越168-186位的肽段显示出氘差异交换，而跨越168-181位的肽段没有差异。因此，可以推断出182上游的残基没有被氘差异标记。从而推断出pr000846结合cd73的这3个肽段区域可缩小为(氨基酸(aa)132-146 (ylpykvgdevvg)和182-189(ktlnvnki)和240-254(ivtsddgrkvpvvqa))，表现出氘的吸收降低。实施例11 cd73的丙氨酸点突变
[0396]
为了获得更精确的表位图谱，对cd73的这3个区域进行丙氨酸点突变扫描。正对 cd73的这3个区域进行丙氨酸点突变构建质粒，转染hek293细胞并表达。然后使用elisa 检测cd73丙氨酸点突变体与抗体的结合，确认抗原结合表位的关键氨基酸，如下：包被0.5ug /ml的抗his抗体(vendor transgen，ht501-02)，在37℃下用3％牛奶pbs封闭2小时，加入100ul cd73突变体上清液，在37℃下孵育30分钟，重复3次使cd73突变体上清液的结合饱和；然后在37℃下加入系列稀释的pr000846(起始浓度为100nm)1h；加入抗cd73 抗体与0.5％封闭缓冲液1：5000，然后在37℃孵育1h；用pbst(0.05％tween 20)洗涤3 次，加入100ul tmb(kpl)，在室温下孵育约5min，然后加入50ul终止溶液。用读板器读取每个孔的吸光度(450nm处的光密度)。
[0397]
图21和22：elisa结合数据显示区域1中的k136，v137，l138，d142，e143， v144以及区域2中的k180，v186，n187，k188以及第3区域中或附近的y223，p238，i240 是cd73结合pr000846的主要表位残基。并且区域1中的v137，d142是关键表位残基。 n185是cd73与medi9447(tab1)结合的关键表位残基，但不是cd73与pr000846结合的表位残基。
[0398]
尽管在此已经示出和描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅以示例的方式提供。不应将本发明限制于说明书内提供的特定实例。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文中的实施例的描述和图示并不意味着以限制性的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化，改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的具体描述，构造或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此，可以预期的是，本发明还将涵盖任何这样的替代，修改，变化或等同形式。以下权利要求书定义了本发明的范围，并且由此涵盖了这些权利要求书范
围内的方法和结构及其等同物。