调控月季花瓣颜色的基因RcGT、蛋白、重组载体、重组转化体、应用和方法

调控月季花瓣颜色的基因rcgt、蛋白、重组载体、重组转化体、应用和方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种调控月季花瓣颜色的基因rcgt、蛋白、重组载体、重组转化体、应用和方法。


背景技术：

2.月季(rosa chinensis)，被称为花中皇后，又称“月月红”，是常绿、半常绿低矮灌木，四季开花﹐一般为红色﹐或粉色、偶有白色和黄色﹐花期较长，从夏季至秋季，都可看到其曼妙的美丽，适合慢慢品味，因此受到人们的追捧，可作为观赏植物，也可作为药用植物，且国内很多城市都将月季列为市花，可见其受欢迎的程度。因此受到广大科研工作者的研究，其分子生物学研究是目前研究月季育种的热点之一。
3.基于目前的研究，寻找合适的基因手段对月季进行育种，培育出颜色种类更加丰富的月季受到了广大科研工作者越来越多的关注。


技术实现要素：

4.本发明提供一种调控月季花瓣颜色的基因rcgt，通过基因工程的手段调控月季花瓣颜色的深浅，从而丰富花瓣颜色的种类，为今后改良花卉颜色提供了理论依据和新的思路。
5.本发明还提供一种调控月季花瓣颜色的蛋白、重组载体、重组转化体、应用和方法。
6.本发明第一方面提供一种调控月季花瓣颜色的基因rcgt，所述基因rcgt具有seq id no.1所示的核苷酸序列。
7.本发明第二方面提供一种调控月季花瓣颜色的蛋白，所述蛋白由上述基因rcgt编码得到。
8.本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体包含上述的核苷酸序列。
9.进一步地，所述重组载体为trv2病毒质粒。
10.本发明第四方面提供一种重组转化体，所述重组表达转化体包含上述重组载体。
11.进一步地，所述重组表达转化体为根瘤农杆菌gv3101。
12.本发明第五方面提供上述基因rcgt在调控月季花瓣颜色中的应用。
13.本发明第六方面提供一种调控月季花瓣颜色的方法，所述方法包括：下调所述月季花瓣中基因rcgt的表达。
14.进一步地，下调所述月季花瓣中基因rcgt的表达，具体包括：
15.将基因rcgt连接到trv2病毒质粒上，构建得到重组载体；
16.构建含所述重组载体的根瘤农杆菌gv3101；
17.将含所述重组载体的根瘤农杆菌gv3101侵染月季，得到基因rcgt表达下调的月季。
18.进一步地，所述月季为蓝色狂想曲月季或仙境月季。
19.本发明通过基因工程的手段培育得到具有花瓣颜色偏浅的月季，从而丰富了月季花瓣颜色的种类，使其具有独特的观赏价值，并为今后定向改良花卉颜色提供理论依据和新的思路。
附图说明
20.图1为本发明一实施例提供的rcgt基因在蓝色狂想曲月季不同组织部位的表达量；
21.图2为本发明一实施例提供的蓝色狂想曲月季在转入trv2-rcgt，15天后对照组和突变组的花瓣表型；
22.图3为本发明一实施例中提供的蓝色狂想曲月季在转入trv2-rcgt，15天后对照组和突变组的rcgt的表达量；
23.图4为本发明一实施例中提供的仙境月季在转入trv2-rcgt，10天后对照组和突变组的花瓣表型；
24.图5为本发明一实施例中提供的仙境月季在转入trv2-rcgt，10天后对照组和突变组的rcgt的表达量；
25.图6为本发明一实施例中提供的蓝色狂想曲月季在转入trv2-rcgt，15天后与花青素合成相关基因的表达量；
26.图7为本发明一实施例中提供的仙境月季在转入trv2-rcgt，10天后与花青素合成相关基因的表达量。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验手册(new york：cold spring harbor labortary press，1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
29.实施例1月季rcgt基因的提取
30.使用试剂盒rnaplant(市售)提取月季花瓣总rna，利用反转录试剂盒(市售)将总rna反转录成cdna；根据转录组测序结果设计引物，采用rt-pcr方法从cdna中扩增出一条1449bp的条带。pcr产物回收，获取基因rcgt，其核苷酸序列如seq id no.1所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq id no.2所示，由482个氨基酸残基组成，分子量为53.27千道尔顿。
31.实施例2 rcgt在蓝色狂想曲月季的不同组织部位的表达谱验证
32.根据蓝色狂想曲基因rcgt的cds序列设计q-pcr引物，提取蓝色狂想曲不同器官(嫩叶(l1)、老叶(l2)、茎(s)、开花期1(f1)、开花期2(f2)、开花期3(f3)、开花期4(f4))的
rna，反转录成cdna，以此为模板进行q-pcr验证基因rcgt在不同器官上的表达模式。
33.验证结果如图1所示，蓝色狂想曲的不同器官(嫩叶、老叶、茎、开花期1、开花期2、开花期3、开花期4)中基因rcgt的表达量不同，在开花期3中表达量最高。
34.实施例3利用trv2病毒诱导rcgt基因沉默
35.(1)以基因rcgt为模板，设计vigs引物，并将此部分序列连接到trv2病毒载体上，形成重组载体。
36.(2)以重组载体转根瘤农杆菌gv3101，培养获得包括gv3101的菌液，利用抽真空的方式将菌液抽进蓝色狂想曲月季花苞和仙境月季花苞，通过病毒诱导基因沉默(virus induced gene silence,vigs)方式沉默基因rcgt，同时，设置对照组gfp，即将不包括基因rcgt的病毒trv2载体转化到根瘤农杆菌gv3101中。
37.(3)抽真空后，将实验组和对照组的花苞连带着枝条于10℃条件下避光放置3d。
38.(4)23℃培养，10-20天左右等开花后进行表型观察和q-pcr验证花瓣中rcgt的下调以及花青素合成相关基因上调或者下调。
39.图2为本发明一实施例提供的蓝色狂想曲月季在转入trv2-rcgt，15天后对照组和突变组的花瓣表型，图3为本发明一实施例中提供的蓝色狂想曲月季在转入trv2-rcgt，15天后对照组和突变组的rcgt的表达量，如图2-3所示，通过vigs顺利的降低了蓝色狂想曲花瓣中基因rcgt的表达量，并且在基因rcgt下调后，与trv2-gfp相比，实验组trv2-rcgt的花瓣红色减弱、蓝色也相对减弱。
40.图4为本发明一实施例中提供的仙境月季在转入trv2-rcgt，10天后对照组和突变组的花瓣表型，图5为本发明一实施例中提供的仙境月季在转入trv2-rcgt，10天后对照组和突变组的rcgt的表达量，如图4-5所示，和蓝色狂想曲中一样，通过vigs顺利的降低了仙境花瓣中基因rcgt的表达量，并且在基因rcgt下调后，与trv2-gfp相比，实验组trv2-rcgt的花瓣红色减弱、蓝色也相对减弱。
41.图6为本发明一实施例中提供的蓝色狂想曲月季在转入trv2-rcgt，15天后与花青素合成相关基因的表达量，其中，a为基因rcchs的表达量，b为基因rcf3’h的表达量，c为基因rcans的表达量，d为基因rcchi的表达量，上述四种基因均为花青素合成相关基因，根据图6可知，vigs下调蓝色狂想曲基因rcgt后，花青素合成通路相关的基因rcchs、rcf3’h和rcans的表达量均降低，而基因rcchi的表达量升高。
42.图7为本发明一实施例中提供的仙境月季在转入trv2-rcgt，10天后与花青素合成相关基因的表达量，其中，a为基因rcchs的表达量，b为基因rcf3’h的表达量，c为基因rcans的表达量，d为基因rcchi的表达量，上述四种基因均为花青素合成相关基因，根据图7可知，vigs下调仙境rcgt后，花青素合成通路相关基因rcf3’h、rcans表达量降低，而rcchs、rcchi表达量升高。
43.根据图6-7可知，基因rcgt的表达量下调，导致月季花瓣中花青素的类型和含量不一样，从而呈现出与自然界不同的颜色。
44.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。