一种真菌微生物组作为胃癌诊断的标志物的应用的制作方法

1.本发明属于微生物组或胃癌技术领域，具体涉及一种真菌微生物组作为胃癌诊断的标志物的应用。


背景技术：

2.胃癌(gc)是最常见的恶性肿瘤之一，gc在所有与癌症相关的死亡病例中排名第二，是第五大最广泛诊断的癌症。gc的发展通常经过萎缩性胃炎(ag)到肠化生(im)，最终发展为gc的多个过程。虽然胃癌的病因和发病机制尚不清楚，但已证实暴露于环境致癌物质(如有毒化学物质和幽门螺杆菌)会增加癌症风险，菌群也可通过改变其自身的组成和基因表达以应对不断变化的环境条件。胃一直被认为是细菌的“敌对场所”，因为强酸性的胃液不适合微生物生长。最近的证据表明，胃中微生物种群的改变与胃癌的发病和进展有关。自20世纪80年代至今，幽门螺杆菌(h.pylori，hp)被发现是13年来最常见的胃癌致病细菌。然而所有感染hp的案例中，最终只有1-3％的患者会发展为gc；同时，有15％的hp患者通过药物根除hp后仍然发展为gc，这表明其他微生物也可以寄生在胃中并在gc的发生和发展中发挥作用
3.高通量测序技术的进步为探索健康人和胃癌患者胃中微生物组成和丰度差异提供了有力的技术保障。一项研究证明，口腔细菌更有可能聚集在胃癌样本中，链球菌、奈瑟菌、嗜血杆菌和卟啉单胞菌是gc中最占优势的菌种。新出现或重新出现的真菌正在成为世界范围内与宿主的免疫调节密切相关的公共卫生威胁。最近的研究证实了结直肠腺瘤组织、克罗恩病和溃疡性结肠炎患者中真菌成分的改变，为发现宿主-真菌微生物组相互作用之间的新关系提供了机会。然而，理解胃真菌微生物群在gc中的功能作用的研究很少，特别是从真菌在gc筛查中的潜在诊断价值的角度。
4.我国是gc大国，目前gc的筛查仍依赖于胃镜检查：操作复杂，体验差，依从性低。gc的临床血清标志物主要有ca19-9、cea和ca72-4等，然而这些血清标志物对gc的敏感性和特异性不高。即血清学肿瘤指标正常，但部分肿瘤患者已经发展到较晚的阶段，甚至患者出现肿瘤的复发和转移，但肿瘤指标仍维持在正常水平。因此，寻找新的灵敏度和特异性更高的标志物是解决胃癌患者早期诊断并提供及时治疗建议的有效途径。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明通过全面分析了gc组织、gc癌旁组织和健康胃组织中的真菌微生物组，对胃中真菌微生物组的变化与gc发生发展的关系做出了解释。结果显示，gc患者胃部菌群特别是basidiomycota的丰度显著高于hc组，gc组中10种高丰度的真菌属可以作为gc预测和诊断的标志物。进一步的，首次提出了宿主真菌微生物群与gc发生发展的相互作用，为真菌在gc中的潜在作用提供了新的解释。
6.基于上述发明目的，本发明公开了一种真菌微生物组作为胃癌诊断的标志物的应用，所述真菌微生物组包含cystobasidium,cutaneotrichosporon,apodus,apiotrichum,
simplicillium,lecanactis,rhizopus,rhodotorula,exophiala和sarocladium中的任意一种或几种的组合，其中，真菌微生物为真菌中门水平、属水平以及种水平中的一种或以上。
7.其中，所述真菌微生物的筛选方法为：通过提取组织中的dna，进行its测序和读数分类学注释，判断胃癌患者与健康对照之间的所述真菌微生物的差异度和/或相似性，得到真菌微生物标志物。
8.具体地，所述组织包括胃癌组织、癌旁组织和健康胃组织。
9.所述its测序的过程为：
10.(1)提取组织中的dna；
11.(2)使用its引物进行建库和pcr扩增；
12.(3)使用nanodrop 2000紫外分光光度计和1％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物的浓度和纯度；
13.(4)利用illumina miseqpe 300测序仪进行测序。
14.具体地，步骤(2)中的its引物为：
15.上游引物its3f：gcatcgatgaagaacgcagc，
16.下游引物its4r：tcctccgcttattgatatgc。
17.所述的读数分类学注释过程为：
18.(1)删除错配、缺失和重复的序列，只允许2个核苷酸错配；
19.(2)使用uparse.7将相似性97％以上的分类单元(otu)聚集为相同otu；
20.(3)使用qiime计算α多样性，包括chao1、物种和pd_whole_tree；
21.(4)使用lefse方法对gc和hc组差异表达的真菌进行分析。
22.结果表明，basidiomycota的丰度高于ascomycota并显著富集在胃癌组织中，真菌微生物组的cystobasidium,cutaneotrichosporon,apodus,apiotrichum,simplicillium,lecanactis,rhizopus,rhodotorula,exophiala,sarocladium 10种真菌标志物均在gc组织中高表达。
23.本技术使用受试者工作曲线roc分析真菌标志物，分析工具为excel和graphpad 8.0。
24.本技术进一步提出了一种用于胃癌诊断的试剂盒，包含能够检测出权利要求1所述的标志物所属真菌的试剂。
25.有益效果：本发明阐述了胃部微环境中真菌群在gc发生发展中的作用，并发现gc组织中一种真菌微生物组的真菌含量可以作为gc有效的检测标志物，使用该标志物可以精准且可靠地筛查和诊断gc。例如，通过检测gc患者组织中cutaneotrichosporon的水平，可以准确的判定是否有发生癌症的可能或患有gc。
附图说明
26.下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
27.图1为真菌标志物筛选流程图及其与宿主免疫相关分析；
28.图2为胃癌中细菌微生物群多样性的改变，其中，gc为胃癌组，hc为正常组，(a、b和
c)chao1,observed_species和pd_whole_tree描述了gc和hc组间真菌的alpha多样性；(d和e)hc和gc样本中真菌组成的主成分分析；
29.图3为胃癌组与正常组真菌组成的变化，其中，gc为胃癌组，hc为正常组，(a)三组间out丰度的venn分析；(b)17类优势真菌门水平上的比较；(c)basidiomycota和ascomycota的相对丰度比较；(d)属水平上真菌的相对丰度比较；(e和f)gc和hc两组间属水平真菌的差异表达；
30.图4为真菌的种类可以作为gc诊断的标志物，(a)不同真菌类群的分支结果图，差异由最丰富类别的颜色表示(红色，hc；绿色，gc；黄色，无显著性)。每个圆圈的直径与分类单元的数量成正比。每个环代表下一级分类2级；(b)hc组和gc组间通过lefse分析的线性计算(lda)评分，lda得分》3，红色，健康组；绿色，胃癌组)；(c)前10中真菌属诊断gc的roc曲线图。
31.图5为真菌的功能预测。(a)群落水平上真菌的功能预测；(b)营养水平上真菌的功能预测。
32.图6为gc中cutaneotrichosporon的诊断价值分析。(a)cutaneotrichosporon在hc和gc中表达差异图；(b)cutaneotrichosporon诊断hc和gc的roc曲线图。
具体实施方式
33.为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面结合附图对本发明的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本发明。该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用试剂均可从商业渠道获得。
34.实施例1真菌微生物组的筛选。
35.1.1组织样本的收集与dna的提取：
36.选取临床确诊为胃癌的患者，收取其外科手术切除的胃癌组织(gc，22例)，同时收集其胃癌的癌旁组织(pc，22例)，立即使用无菌生理盐水清洗3次，加1ml组织保存液，置于-80℃冰箱储存。同时，收集健康人胃镜中刮取的健康胃组织(hc，11例)，经清洗和组织保存液处理，置于-80℃冰箱储存。使用soil dna抽提商用试剂盒提取三组组织中的总rna，储存于-80℃冰箱备用。实验的总体流程如图1所示。
37.1.2组织中真菌的its2测序：
38.使用nanodrop 2000紫外分光光度计和1％的琼脂糖凝胶电泳检测rna的浓度和纯度。按照its2 rrna pcr扩增的步骤：95℃初始变性3min；再经过95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，总共35个循环；最后经过72℃孵育10min和10℃保存至反应终止。反应的体系为：2
×
protaq缓冲液10μl，5μm的正向引物0.8μl，5μm的反向引物0.8μl，加入10ng/μl的模板dna，最后添加ddh2o至20μl，组成pcr反应混合物。使用axyprep dna凝胶提取试剂盒(axygen生物，美国)纯化pcr产物，使用illumina miseqpe 300平台进行两端测序。原始的测序结果存储在美国国家生物技术信息中心(ncbi)的序列读取档案(sra)数据库中(登录码：prjna797736)。
39.1.3测序结果的分类学注释：
40.对原始its2 rrna测序数据进行如下操作：在50bp的移动窗口上，截断平均质量分
数小于20的300bp读数，丢弃小于50bp的截断读数，丢弃读数模糊的字符；根据重叠序列，只组装超过10bp的重叠序列。重叠区域的最大错配比例为0.2。丢弃无法组装的读数；根据条形码和引物对样本进行区分，调整序列方向，对条形码进行精确匹配，引物匹配时只允许个核苷酸错配。使用uparse 7.1将相似度为97％的操作分类单元(otu)聚集为同一otu，鉴定并去除嵌合序列；基于测序精度，用qiime计算alpha多样性，包括observed_species指数、chao1和pd_whole_tree，按照疾病表型和组间差异对样本点着色，按照bray-curtis距离进行主成分分析(pca)；按照unite数据库对鉴定到的真菌otus进行分类和注释。如图2所示，hc组在observed_species指数、chao1和pd_whole_tree三个水平上显著高于对gc组，表明hc中真菌的alpha多样性高于gc组，说明hc组中真菌的物种丰度更高。pca结果说明，hc和gc组真菌明显分为两组，表明相同类型组织中真菌的组成高度统一。
41.1.4 gc组差异真菌的筛选与诊断效能分析：
42.使用venn分布分析了3组中outs的差异，如图3所示，有64个outs是3组共有，hc、gc和para-gc分别有869、213和339个outs独有。与hc组相比，gc组中basidiomycota丰度最高，其次是ascomycota。进一步发现gc组中apiotrichum、cutaneotrichosporon、sarocladium和malassezia相比hc组显著高表达，而hc组中的rhizopus、rhodotorula、apodus和cytobasidium相比于gc组显著低表达。最后我们使用lefse分析hc和gc中真菌的各类组成，如图4所示，从中挑选到gc组10种真菌：cystobasidium(auc＝0.8760)、cutaneotrichosporon(auc＝1.000)、apodus(auc＝0.9421)、apiotrichum(auc＝0.9793)、simplicillium(auc＝0.8182)、lecanactis(auc＝0.8636)、rhizopus(auc＝0.8884)、rhodotorula(auc＝0.9525)、exophiala(auc＝0.8926)、sarocladium(auc＝0.9318)，其中，auc为曲线下面积，这10种属的真菌对gc具有较好的诊断价值，作为本发明的一组真菌微生物组。
43.1.5 gc中真菌的功能分析与注释
44.如图5所示，我们分别分析了gc中真菌在种群和营养两方面的功能，结果显示分布最广泛的是腐生菌(64.3％)，gc中分布最广泛的是土壤腐生菌(54.9％)，而两组间最多样化的是动物病原体，这些表明hc和gc中真菌的功能存在明显的差异。说明真菌在胃癌发展中独特的共生关系，表明真菌群落是维持胃稳态所必须因素。
45.1.6胃癌中cutaneotrichosporon的诊断价值
46.如图6所示，以cutaneotrichosporon为例，我们使用实时荧光定量pcr在44例胃癌和20例健康组织中验证了cutaneotrichosporon的表达水平，使用β-actin作为内参基因。cutaneotrichosporon在hc和gc间的表达具有极显著差异(
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p《0.0001)，当cutaneotrichosporon作为胃癌的诊断工具时，其roc曲线下面积为0.9476，敏感性为100％，特异性为90％。本次结果表明当cutaneotrichosporon的表达量超过11.54时，即可诊断为胃癌。这些结果表明，我们鉴定所得的真菌微生物组具有良好的胃癌诊断潜力。
47.本发明提供了一种用于胃癌诊断的标志物的筛选思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。