用于制备治疗肝癌药物的新型代谢标志物及其应用

1.本发明涉及代谢物的功能和应用领域，具体涉及一种用于制备治疗肝癌药物的新型代谢标志物及其应用。


背景技术：

2.在癌症发展过程中，癌细胞通过代谢重编程持续生长和增殖提供燃料，已经成为癌症的一个新兴标志。代谢重编程包括有氧糖酵解“warburg效应”、谷氨酰胺分解代谢、大分子合成和氧化还原稳态。在肝癌代谢中，代谢重编程主要包括葡萄糖代谢，能量生成代谢及脂质代谢重编程。
3.甲基柠檬酸是柠檬酸合酶催化丙酰辅酶a和草酰乙酸合成。甲基柠檬酸可能作为丙酸代谢先天错误的生物标志物。甲基柠檬酸会诱导脑铵积累和细胞凋亡，促进由甲基丙二酸尿症引起的脑损伤。近年来，随着不断深入的研究，代谢重编程也成为肝癌的新型标志之一，甲基柠檬酸有可能在肝癌发生及调控中扮演着重要的角色。
4.索拉非尼作为治疗晚期肝细胞癌的一线治疗药物，虽然为提高肝细胞癌患者的生存率提供了药物选择，但是索拉非尼仅延长患者3个月的生存期，其治疗效果比较有限。索拉非尼的治疗效果存在异质性，同时还伴随着严重的副作用包括腹泻、高血压、厌食等。
5.在癌症的发生过程中，由于肿瘤异质性的存在，了解肝癌代谢重编程、挖掘代谢物进行早期诊断和靶向治疗对于提高癌症治愈率和预后非常重要。随着精准医学时代的到来，在癌症临床诊断和治疗中，对疾病和特定患者进行个性化精准治疗可以最大限度地提高疗效。多组学技术和大规模测序为此提供了强有力的支撑。但是，与癌症精准诊断和治疗相关的代谢标志物还有待挖掘和研究。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于制备治疗肝癌药物的新型代谢标志物及其应用，本发明中肝癌检测的代谢标志物甲基柠檬酸，可以预测肝癌的严重程度，提高肝癌早期诊断的效率和准确性。通过对肝癌组织样本检测这些代谢标志物，可以根据代谢物水平，对肝癌患者进行个性化精准治疗。本发明通过实验研究发现，甲基柠檬酸在肝癌中的代谢物水平与肝癌严重程度呈反比。
7.本发明提供一种用于制备肝癌标志物的代谢物及其应用，即甲基柠檬酸在肝癌检测肝癌治疗中的功能及应用，即作为新型药物在肝癌治疗中的应用。本发明通过实验研究发现，甲基柠檬酸在肝癌中发挥重要作用，发现可以显著抑制肝癌细胞的增殖速率，也可以抑制肝癌细胞皮下肿瘤形成的能力。
8.为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种用于制备治疗肝癌药物的新型代谢标志物，其特征在于：所述代谢物为甲基柠檬酸。
10.第二方面，一种用于制备治疗肝癌药物的新型代谢标志物的应用，其特征在于：甲
基柠檬酸作为肝癌代谢标志物，应用在肝癌治疗中。
11.作为优选方案之一，所述甲基柠檬酸作为肝癌代谢标志物，其代谢物水平与肝癌严重程度呈反比。
12.作为优选方案之二，所述甲基柠檬酸能显著抑制肝癌细胞增殖和皮下成瘤，可以显著增强索拉非尼对肝癌细胞增殖的抑制作用。
13.上述甲基柠檬酸在肝癌早期诊断和肝癌治疗中发挥重要作用。
14.本发明的优点及有益效果如下：
15.本发明在体外培养肝癌细胞，检测肝癌细胞增殖、迁移速率并检测细胞内代谢物水平，发现甲基柠檬酸的含量与肝癌增殖、迁移速率呈反比。本发明在小鼠体内通过高压尾静脉注射或腹腔注射构建肝癌模型，检测小鼠血清及肝癌组织中的代谢物水平，发现甲基柠檬酸的含量与小鼠血清alt、ast水平呈反比，与小鼠肝癌负荷呈反比。以上结果表明甲基柠檬酸含量与肝癌严重程度呈负相关，可用于作为肝癌早期诊断及严重程度的代谢标志物。
16.本发明通过将甲基柠檬酸钠添加至人源肝癌细胞中培养，发现可以显著抑制肝癌细胞增殖，增强索拉非尼抑制肝癌细胞增殖的作用。本发明还以hcclm9细胞注射至babl/c裸鼠皮下构建肿瘤模型，通过腹腔注射甲基柠檬酸钠进行治疗，结果发现甲基柠檬酸钠可以显著抑制皮下肿瘤形成速度。以上结果表明甲基柠檬酸以有效改善和治疗肝癌。
附图说明
17.图1中：
18.a：细胞内甲基柠檬酸的水平；
19.b：细胞增殖速率统计；
20.c：细胞迁移速率统计；
21.*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001；****,p《0.0001。
22.图2中：
23.a：代表性肝脏示意图。
24.b：血清检测甲基柠檬酸的水平；
25.c：小鼠肝癌结节数目统计；
26.d：血清检测alt,ast水平；
27.*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001；****,p《0.0001。
28.图3中：
29.a：hcclm9细胞经甲基柠檬酸钠(0，20，100μm)处理，rtca检测细胞增殖；甲基柠檬酸钠显著抑制hcclm9的细胞增殖速率。
30.b：mhcc97l细胞经甲基柠檬酸钠(0，50，100μm)处理，rtca检测细胞增殖；甲基柠檬酸钠显著抑制mhcc97l的细胞增殖速率。
31.c：huh7细胞经甲基柠檬酸钠(50μm)和索拉非尼(1μm)处理，rtca检测细胞增殖；甲基柠檬酸钠显著抑制huh7的细胞增殖速率，与索拉非尼联合用药可以显著增强对细胞增殖的抑制作用。
32.d：hcclm9细胞经甲基柠檬酸钠(10μm)和索拉非尼(0.5μm)处理，rtca检测细胞增
殖；甲基柠檬酸钠与索拉非尼联合用药可以显著增强对细胞增殖的抑制作用。
33.图4中：
34.a：皮下肿瘤图片，在空白组(vehicle)，甲基柠檬酸钠组(mca-na)在实验终点，甲基柠檬酸钠组肿瘤大小显著低于空白组的肿瘤大小。
35.b：皮下肿瘤体积统计图。在不同时间点测量小鼠皮下肿瘤的体积，甲基柠檬酸钠组肿瘤体积显著低于空白组的肿瘤体积。
具体实施方式
36.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
37.实施例1：体外构建肝癌细胞模型
38.1、肝癌细胞培养，包括hcclm9、hek293t人源肝癌细胞，在37℃，5％co2培养箱培养，细胞传代及操作均在无菌细胞间生物安全柜中进行。细胞培养于dmem培养基，10％
39.胎牛血清，1％双抗的培养条件。
40.2、构建aldh6a1过表达稳转细胞系：
41.(1)慢病毒包装：使用293t细胞，转染质粒比例为phage-aldh6a1：pmd2g:pspax2＝2:2:1。转染48h后，收集培养基上清，0.45μm滤膜过滤后保存至-80℃冰箱。
42.(2)慢病毒感染hcclm9细胞：提前一天接种hcclm9细胞于6孔板，加入2ml病毒液和polybrene(终浓度10μg/ml)。10h后换为新鲜完全培养基。
43.(3)抗性筛选：加入相应抗性筛选48h,将存活细胞验证表达后即为构建好的aldh6a1过表达的稳转细胞系。
44.3、细胞内代谢物检测：取107个细胞，pbs洗三次，3000转/分钟离心1min,去上清。经液相色谱-质谱联用(hplc-mc)检测甲基柠檬酸代谢物水平。
45.4、rtca检测细胞增殖：xcelligence cell functionanalyzer(dp system)用于检测细胞增殖。贴壁细胞经胰酶消化后重悬于完全dmem培养基中，密度约为4.0
×
104/ml。然后用50μl完整dmem培养基填充e-plate view 16以执行基线检查(细胞指数应小于0.063)。之后，每孔加入100μl细胞悬液，再向每孔加入不同药物处理，开始进行实时检测约96小时。
46.5、rtca检测细胞迁移：xcelligence cell functionanalyzer(dp system)用于检测细胞迁移。贴壁细胞经胰酶消化后重悬于无血清dmem培养基中，密度约为4.0
×
105/ml。cim-plate下室加入165μl完全培养基，将上室安装在下室上，向上室加入30μl无血清dmem培养基。装配好的cim-plate在37℃，5％co2培养箱平衡1h后以执行基线检查(细胞指数应小于0.063)。之后，每孔加入100μl细胞悬液，开始进行实时检测约96小时。
47.本发明以hcclm9人源肝癌细胞，构建aldh6a1过表达构建肝癌细胞模型，结果发现aldh6a1过表达后，抑制细胞增殖、迁移速率，细胞内甲基柠檬酸的水平升高。以上结果表明甲基柠檬酸可以作为肝癌严重程度的代谢标志物。
48.实施例2：小鼠体内通过高压尾静脉注射构建肝癌模型
49.1、实验用动物及饲养：实验动物种属，性别，周龄及来源：c57bl/6(wt)小鼠和c57bl/6背景aldh6a1 knockout(aldh6a1-/-)小鼠，雄性，8周龄。
50.2、动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学生命科学学院spf级
动物房。每12小时交替照明，温度24
±
2℃，湿度40-70％，小鼠自由饮水进食。
51.3、sleep beauty高压尾静脉小鼠肝癌模型构建：
52.选择wt雄性小鼠及aldh6a1-/-雄性小鼠，8周龄。将pt3-myr-akt-ha、pcmv(cat)t7-sb100和pt/caggs-nrasv12置于生理盐水中，高压注射到小鼠尾静脉。进入肝脏的akt和nras可以在转座酶的作用下整合到小鼠基因组中并稳定表达，最终诱发肝脏癌变。注射需要在5-7秒内完成。注射后，每周记录小鼠状态及体重变化。注射后6-8周取材。全血置于4度过夜，2500转/分钟，4度，离心3min，上清即为血清，液氮速冻。取出小鼠肝脏拍照，分离小鼠肝脏癌及癌旁组织，液氮速冻。
53.4、血清代谢物水平检测：全血置于4度过夜，2500转/分钟，4度，离心3min，上清即为血清，取50μl液氮速冻。经液相色谱-质谱联用(hplc-mc)检测甲基柠檬酸代谢物水平。
54.5、alt检测(njjc，c009-2-1)在测定孔和对照孔各加入37℃预热的丙氨酸氨基转移酶底物溶液20μl，测定孔加入待测样品5μl，移液混匀，置于37℃水浴中30分钟。然后在每个测量孔和对照孔中加入20μl 2,4-二硝基苯肼液体，在对照孔中加入5μl样品。移液混匀，置于37℃水浴中20分钟。最后在每个孔中加入200μl400mm naoh。轻轻摇动，静置15分钟，在510nm处测量吸光度。
55.6、ast(njjc,c010-2-1)的检测，在测定孔和对照孔各加入37℃预热的天冬氨酸转氨酶底物溶液20μl，加入待测样品5μl进行测定用移液管混匀，置于37℃水浴中30分钟。然后在每个测量孔和对照孔中加入20μl 2,4-二硝基苯肼液体，在对照孔中加入5μl样品。移液混匀，置于37℃水浴中20分钟。最后在每个孔中加入200μl400mm naoh。轻轻摇动，静置15分钟，在510nm处测量吸光度。
56.本发明以sleep beauty高压尾静脉，在wt及aldh6a1-/-雄性小鼠中构建akt/nras肝癌模型，结果发现aldh6a1敲除后，肝癌负荷增强，肿瘤结节数、血液alt水平、血液ast水平上升，小鼠血清中的甲基柠檬酸水平显著降低，与肝癌负荷呈反比。以上结果表明甲基柠檬酸可以作为肝癌严重程度的代谢标志物。
57.实施例3：甲基柠檬酸钠、索拉非尼添加至人源肝癌细胞中培养试验
58.1、肝癌细胞培养，包括hcclm9，mhcc97l，huh7等人源肝癌细胞，在37℃，5％co2培养箱培养，细胞传代及操作均在无菌细胞间生物安全柜中进行。细胞培养于dmem培养基，10％胎牛血清，1％双抗的培养条件。
59.2、rtca检测细胞增殖：xcelligence cell functionanalyzer(dp system)用于检测细胞增殖。贴壁细胞经胰酶消化后重悬于完全dmem培养基中，密度约为4.0
×
104/ml。然后用50μl完整dmem培养基填充e-plate view 16以执行基线检查(细胞指数应小于0.063)。之后，每孔加入100μl细胞悬液，再向每孔加入不同药物处理，开始进行实时检测约96小时。
60.本发明以hcclm9，mhcc97l，huh7等人源肝癌细胞，将甲基柠檬酸钠(mca-na)、索拉非尼(sorafenib)、甲基柠檬酸钠与索拉非尼联合用药添加到细胞培养基中，构建肝癌细胞模型，结果发现甲基柠檬酸钠可以显著抑制细胞增殖速率，与索拉非尼联合使用可以显著增强索拉非尼对肝癌细胞增殖的抑制作用。以上结果表明甲基柠檬酸钠可以有效改善和治疗肝癌。
61.实施例4：通过腹腔注射甲基柠檬酸钠构建小鼠皮下肿瘤模型
62.1、bablc-nude裸鼠皮下成瘤：将4周龄的balb/c-nude裸鼠在spf级动物房饲养。将
裸鼠随机分为四组，取对数生长期的hcclm9细胞，pbs重悬细胞至7
×
107/ml。将4℃解冻的基质胶按1:1体积加入细胞悬液混匀。在超净台内于将细胞悬液200ul接种于裸鼠皮下，定期测量接种部位肿瘤大小。皮下注射7天后，将生理盐水-空白组(vehicle)，甲基柠檬酸钠(mca-na)腹腔注射，每隔一天注射一次。约14天后，待vehicle组肿瘤长至大约1000mm3，断颈处死裸鼠，取出肿瘤块拍照。
63.本发明以hcclm9细胞皮下注射至babl/c裸鼠，通过腹腔注射甲基柠檬酸钠构建小鼠模型，结果发现发现甲基柠檬酸钠可以显著抑制皮下肿瘤的形成。以上结果表明甲基柠檬酸钠可以有效改善和治疗肝癌。