一种提高乳酸菌胞外囊泡产量的方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种提高乳酸菌胞外囊泡产量的方法及其应用。


背景技术：

2.益生菌是服用一定剂量时可以发挥有益作用的活的微生物，其中，乳酸菌是最具有代表性也是研究最为广泛的一种益生菌。乳酸菌对人体有益的生理功能主要是通过调节宿主肠道菌群组成、激活内源性菌群和调节免疫系统等几方面来直接或间接实现的。口服乳酸菌可治疗或缓解多种胃肠疾病，例如缓解乳糖不耐受、预防肠胃炎、便秘和腹泻等。
3.乳酸菌及其活性代谢产物与人类的健康密切相关，常常被应用于食品产品中，或自然地发生在食品中，从而使食品拥有较好的风味、结构、营养及健康的特征。最近几年，出于对益生菌活菌安全性的考虑，越来越多的研究开始关注非活性菌的益生菌成份对人体的有益作用，比如益生菌菌壁成份、热失活的益生菌菌体、益生菌代谢产物等。
4.随着有研究发现革兰氏阳性菌也可以分泌胞外囊泡，越来越多的研究开始关注乳酸菌源胞外囊泡。胞外囊泡在细菌与细菌之间、细菌与细胞之间的交流具有重要作用。乳酸菌胞外囊泡是一种纳米级囊泡，直径在20-400nm。乳酸菌胞外囊泡是由多种遗传物质(microrna[mirna]、信使rna[mrna]、小rna[srna]和dna)、蛋白质、脂质和代谢物组成的多功能化合物。而且乳酸菌胞外囊泡外围的双模层脂膜结构，可以很好地保护包裹在囊泡中的物质免受体内和体外的蛋白酶、dna/rna酶、ph等影响，同时乳酸菌胞外囊泡也可以作为一种天然的载体，用来递送乳酸菌分泌的具有益生作用的物质。在特定的培养环境和条件下，可以增加乳酸菌菌体表面会释放的胞外囊泡。乳酸菌胞外囊泡可广泛应用于食品微生物学、食品科学、功能食品、保健品和制药等领域。所以寻找一种可以提高乳酸菌胞外囊泡产量的方法至关重要。


技术实现要素：

[0005]
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种提高乳酸菌胞外囊泡产量的方法及其应用，通过在乳酸菌的发酵剂中添加可食用植物源胞外囊泡，以有效提高乳酸菌胞外囊泡的产量。
[0006]
第一方面，本发明提供一种提高乳酸菌胞外囊泡产量的方法，包括：在乳酸菌的发酵培养基中加入可食用植物源胞外囊泡5～50mg/l。
[0007]
进一步地，所述可食用植物源胞外囊泡包括：生姜源胞外囊泡和/或西柚源胞外囊泡。
[0008]
进一步地，所述生姜源胞外囊泡的添加量为5～20mg/l；和/或，所述西柚源胞外囊泡5～30mg/l。
[0009]
进一步地，所述乳酸菌的培养发酵剂包括：葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、吐温-80、磷酸氢二钾、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰、柠檬酸氢二胺。
[0010]
进一步地，以重量份计，所述乳酸菌的发酵培养基包括：葡萄糖10～30份、酵母提取物1～10份、蛋白胨5～20份、牛肉膏5～20份、乙酸钠1～10份、磷酸氢二钠1～5份、吐温-80 0.1～2份、无水硫酸镁0.1～1份、一水合硫酸锰0.1～1份和柠檬酸氢二铵1～5份。
[0011]
进一步地，所述乳酸菌的接种量为1～5
×
107cfu/ml；
[0012]
所述乳酸菌的发酵温度为：37～38℃。
[0013]
第二方面，本发明提供一种发酵剂添加物，包括：可食用植物源胞外囊泡5～50mg/l。
[0014]
进一步地，所述可食用植物源胞外囊泡为生姜源胞外囊泡和/或西柚源胞外囊泡。
[0015]
本发明进一步提供所述方法和所述发酵剂添加物在促进乳酸菌胞外囊泡富集吲哚乳酸和/或吲哚3-醛中的应用。
[0016]
本发明进一步提供所述方法和所述发酵剂添加物在提高乳酸菌胞外囊泡的增强肠道屏障功能中的应用。
[0017]
本发明具备如下有益效果：
[0018]
本发明在乳酸菌的发酵剂中加入可食用植物源胞外囊泡，其可以有效提高乳酸菌胞外囊泡的生产效率，同时其可以增加乳酸菌胞外囊泡中吲哚类代谢产物的含量，可有效增加肠道的屏障功能。该方法可以用于工厂化大量生产乳酸菌胞外囊泡，在生产乳酸菌胞外囊泡的领域具有重要的价值。
附图说明
[0019]
图1为本发明实施例2提供的添加可食用植物源胞外囊泡对于乳酸菌胞外囊泡产量的影响。
[0020]
图2为本发明实施例3提供的可食用植物源胞外囊泡和植物乳杆菌结合情况示意图。
[0021]
图3为本发明实施例4提供的0、5、10、20、30和50mg/l的生姜或西柚源胞外囊泡对于乳酸菌胞外囊泡增产效果示意图。
[0022]
图4为本发明实施例5提供的可食用植物源胞外囊泡增加囊泡吲哚类代谢产物的含量示意图。
[0023]
图5为本发明实施例6提供的添加了可食用植物源胞外囊泡对于乳酸菌胞外囊泡对肠道屏障功能的影响示意图。
具体实施方式
[0024]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0025]
实施例1：产囊泡乳酸菌的初筛
[0026]
从实验室现有的20株乳酸菌中筛选出可以分泌胞外囊泡的菌株，得到4株可以产生囊泡的乳酸菌，从中选择1株植物乳杆菌lpl-1进行实验。
[0027]
实施例2乳酸菌胞外囊泡的生产
[0028]
1、改良培养发酵剂配比为：葡萄糖质量分数2％、酵母粉质量分数0.4％、蛋白胨质量分数1％、牛肉膏质量分数1％、吐温-80体积比1m l/l、磷酸氢二钾质量浓度2g/l、乙酸钠质量分数0.5％、硫酸镁质量浓度0.2g/l、硫酸锰质量浓度0.1g/l、柠檬酸氢二铵质量浓度
2g/l，添加蒸馏水定容至1l，121℃灭菌15min。其中最重要的是添加无菌的可食用植物源胞外囊泡，添加量为生姜源胞外囊泡5～20mg/l和/或西柚源胞外囊泡5～30mg/l。
[0029]
2、植物源生姜/西柚胞外囊泡的制备：
[0030]
(1)均质：山东产地的生姜/江西产地的西柚洗净去皮后放入高速搅拌机中，进行均质1分钟。
[0031]
(2)过滤：通过抽真空抽滤机过滤后去除生姜/西柚固体，得到生姜/西柚汁液。
[0032]
(3)离心：在4℃，将生姜/西柚汁液分别在2000g离心10分钟，5000g离,20分钟，10000g离心60分钟,然后在150000g条件下离心90分钟，加入无菌生理盐水重悬囊泡沉淀，-80℃储存备用。
[0033]
3、乳酸菌胞外囊泡的制备：
[0034]
(1)发酵：按2x10
7 cfu/ml接种量接种于改良培养发酵剂中，同时以不含有无菌的可食用植物生姜和/或西柚源胞外囊泡的改良培养发酵剂作为对照，37℃，48小时至od
600
＝1.5。
[0035]
(2)离心：在4℃，将发酵液分别在5000g离心10分钟，10000g离心20分钟,上清液使用0.45μm过滤器过滤，然后在150000g条件下离心90分钟，最后加入无菌生理盐水重悬囊泡沉淀。
[0036]
(3)胞外囊泡定量：使用nanosight ns300纳米颗粒分析仪对囊泡进行定量分析。
[0037]
结果显示(如图1)：与空白对照组(nps)相比，添加可食用植物-生姜源胞外囊泡组(gnps)、西柚源胞外囊泡组(fnps)和生姜+西柚源胞外囊泡组(g+fnps)都可显著提高植物乳杆菌lpl-1胞外囊泡产量，分别提高了180％、150％和196％。
[0038]
实施例3乳酸菌与生姜/西柚源胞外囊泡结合的鉴定
[0039]
1、pkh26荧光染料试剂盒荧光标记生姜或西柚源胞外囊泡
[0040]
(1)在500ul无菌生理盐水重悬的生姜或西柚源胞外囊泡溶液中加入4ul sigma公司的pkh26荧光染料，室温避光染色30分钟，再加入500ul diluent c溶液室温避光反应10分钟。13000g离心5分钟，加入500ul无菌生理盐水重悬沉淀。
[0041]
2、植物乳杆菌lpl-1与生姜或西柚源胞外囊泡结合鉴定
[0042]
(1)1
×
107个植物乳杆菌lpl-1与1mgpkh26标记的生姜或西柚源胞外囊泡一起室温培养30分钟，经无菌生理盐水清洗2遍后，在共聚焦显微镜下进行荧光拍摄。
[0043]
结果显示(如图2)：与空白对照组相比，添加pkh26标记的生姜和西柚源胞外囊泡组的植物乳杆菌lpl-1上的荧光显著增加，证明生姜和西柚源胞外囊泡可以被植物乳杆菌摄取并结合在一起。
[0044]
实施例4改良培养发酵剂中植物源囊泡添加量及植物乳杆菌lpl-1胞外囊泡增产效果的确定
[0045]
1、分别以0、5、10、20、30和50mg/l的生姜或西柚源胞外囊泡添加量进行实验，对比植物乳杆菌lpl-1胞外囊泡的产量。
[0046]
结果显示(如图3)：生姜源胞外囊泡最小的有效添加量为5mg/l,最大有效添加量为20mg/l；西柚源胞外囊泡最小的有效添加量为10mg/l,最大有效添加量为30mg/l。
[0047]
实施例5改良培养发酵剂增加囊泡吲哚类代谢产物的鉴定
[0048]
1、分别以0、20mg/l生姜源胞外囊泡和30mg/l西柚源胞外囊泡添加到改良培养基
中，同实施例2方法的到植物乳杆菌lpl-1胞外囊泡，经过反复冻融裂解后，取50ul上清液进行高效液相色谱仪上样分析，分析吲哚乳酸和吲哚3-醛的信号强度。
[0049]
结果显示(如图4)：与空白对照组相比，生姜源胞外囊泡能显著增加植物乳杆菌lpl-1胞外囊泡中吲哚乳酸和吲哚3-醛的信号强度。西柚源胞外囊泡不能增加植物乳杆菌lpl-1胞外囊泡中吲哚乳酸或吲哚3-醛的信号强度。
[0050]
实施例6添加植物源胞外囊泡后的乳酸菌胞外囊泡对肠道屏障功能的鉴定
[0051]
1、测定肠上皮细胞的单层细胞跨膜电阻值(teer)
[0052]
(1)选用肠上皮细胞caco-2细胞，以2x105个/ml密度进行铺板，培养2周形成单层细胞。连续培养5天，每天以1x108个/ml浓度添加植物乳杆菌胞外囊泡gnps、fnps和g+fnps到caco-2细胞中，然后测量teer电阻阻值。
[0053]
结果显示(如图5)：与空白对照组相比，添加植物源胞外囊泡后的植物乳杆菌胞外囊泡可以显著增加caco-2细胞的teer电阻阻值，其中g+fnps组的teer电阻阻值最高，表明添加植物源胞外囊泡后的植物乳杆菌胞外囊泡具有增强肠道屏障功能的能力。
[0054]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。