优化的玉米rZmG2基因及其在提高植物遗传转化效率中的应用

优化的玉米rzmg2基因及其在提高植物遗传转化效率中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种经密码子优化的玉米golden2基因(rzmg2)基因及其在提高植物遗传转化效率中的应用。


背景技术：

2.水稻(oryza sativa l.和玉米(zea mays l.)等作物是重要的粮食作物和模式植物，在粮食安全和植物基础研究中具有重要价值。在植物的遗传改良研究中，遗传转化是一种必不可少的手段。水稻和玉米的遗传转化技术日益成熟，但仍然存在基因型限制严重、转化效率偏低等问题，如籼稻的转化较粳稻难，且转化效率低，玉米的转化效率受遗传背景影响也很大。因此急需建立一套高效、稳定、广泛的适用不同基因型的水稻和玉米等植物的转化体系。
3.中国发明专利公开了一种玉米bbm1基因在提高遗传转化效率中的应用，将玉米bbm1基因构建到植物双元表达载体上，然后通过农杆菌介导法转化玉米，可以提高玉米的遗传转化效率，克服玉米转化基因型限制，拓宽了玉米转化的受体品种种类。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种新的适用于提高水稻、玉米等多种植物遗传转化效率的新体系。
5.一方面，提供优化的玉米rzmg2基因及其在提高植物遗传转化效率方面的应用。
6.另一方面，本发明提供一种在愈伤组织中导入和表达rzmg2基因，且在苗期即可实现rzmg2基因表达盒的自删除，对转基因植物生长不造成任何影响的提高植物遗传转化效率的方法。
7.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
8.本发明首先对玉米rzmg2基因进行水稻密码子优化，在植物愈伤组织中导入rzmg2基因，使用愈伤组织强启动子驱动zmg2表达，可促进水稻和玉米的愈伤组织向胚性愈伤组织分化和再生，提高遗传转化效率。本发明还在转化完成后，利用基因删除系统删除rzmg2基因和抗性筛选标记基因，在苗期即可实现rzmg2基因表达盒的自删除，有效避免转基因对植株后续生长发育的可能影响。该技术通过rzmg2基因提高遗传转化效率对其他多种作物同样有效。
9.因此本发明要求保护：
10.一种优化的玉米rzmg2基因，及其在提高植物遗传转化效率方面的应用，
11.以及包含所述优化的玉米rzmg2基因的重组载体、表达盒或重组菌，及其在提高植物遗传转化效率方面的应用。
12.所述优化的玉米rzmg2基因为如下任一所述dna分子：
13.(1)将玉米rzmg2基因经水稻密码子优化所得dna分子；
14.(2)在严格条件下与(1)限定的dna序列分子杂交，且能提高植物的遗传转化效率的dna分子序列；
15.(3)与(1)限定的dna序列具有90％以上的相似性，且能提高植物的遗传转化效率的dna分子序列；
16.(4)编码氨基酸序列如seq id no.1所示蛋白的dna分子。
17.具体优选地，上述(1)中所述dna分子核苷酸序列如seq id no.2所示。
18.一种基于异位表达优化的rzmg2基因提高植物遗传转化效率的方法，是将上述优化的玉米rzmg2基因通过植物表达载体以基因工程手段整合到植物染色体上。
19.使用任一种在愈伤组织高表达的启动子，优选地使用愈伤组织特异启动子p
csp
，构建由此启动子驱动rzmg2基因的表达盒，组装到植物双元表达载体上，然后通过农杆菌介导法转化水稻和玉米愈伤组织，以提高其遗传转化效率(愈伤组织再生出苗率)。
20.优选地，本发明所用的质粒有：pylmf-h和pyltac380gw。
21.优选地，rzmg2基因组装到载体pylmf-h的fse i与xba i酶切位点之间。
22.更具体，先将优化的玉米rzmg2基因构建到载体pylmf-h的fse i与xba i酶切位点之间，再通过gateway-bp重组反应构建到热激诱导的自删除重组载体pyltac380gw，最终重组载体为pyltac380h-pcsp::rzmg2，以基因工程手段整合到植物染色体上。
23.本发明提供的热激诱导的自删除重组载体pyltac380h-pcsp::rzmg2包含3个表达盒：p
csp
:rzmg2为愈伤组织特异启动子控制rzmg2；p
18.2
:cre为热激诱导重组酶cre删除两个lox p位点间的dna序列，p
35s
:hpt为潮霉素筛选标记。
24.获得的转基因植株，可通过热激诱导的cre/loxp基因删除系统自动删除rzmg2基因和潮霉素筛选标记基因hpt，从而避免转基因影响后续的生长发育。
25.植物遗传转化方法可为任一种植物遗传转化方法，优选为农杆菌介导法。
26.所述植物表达载体优选为双元表达载体。
27.优选地，所述植物表达载体的骨架载体为pylmf-h、pyltac380gw、pcambia1300或pyltac380h双元载体等，能用于植物遗传转化并得到转基因植株。
28.本发明技术适用植物包括水稻和玉米等，所述水稻材料包括籼稻(华光和华占)以及粳稻(dongjing和中嘉8号)；玉米材料包括b104。
29.本发明具有以下有益效果：
30.本发明创新地利用玉米rzmg2基因提高水稻等植物遗传转化效率，主要通过提高其分化效率来实现的(具体表现为使分化阶段的愈伤组织提前出现绿点，而且绿点数目变多，使得愈伤组织提前再生出芽，加快了分化成苗的速度，提高分化再生效率)，对籼稻和粳稻都有作用。同时本发明证实，rzmg2也提高了玉米等其他作物的转化效率。
31.本发明技术在完成转化后，表达盒中的rzmg2基因和抗性筛选基因，可通过热激处理进行自删除，避免转基因影响植株后续的生长发育。
附图说明
32.图1为本发明实施实例2中质粒pylmf-h的结构示意图。
33.图2为本发明实施实例2中质粒pyltac380gw的结构示意图。
34.图3为本发明实施实例2中重组质粒pyltac380h-p
csp
::rzmg2的结构示意图。
35.图4为本发明实施实例4中水稻转化rzmg2基因的分化阶段愈伤组织表型图。
36.图5为本发明实施实例5中水稻转基因材料的检测结果。
37.图6为本发明实施实例6中热激删除处理后的检测结果。
38.图7为本发明实施实例7中转化玉米转化rzmg2基因的分化阶段愈伤组织表型图。
具体实施方式
39.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
40.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
41.实施例1 zmg2基因的优化和克隆
42.根据玉米zmg2基因的编码蛋白(seq id no.1)，经水稻密码子优化得到rzmg2基因序列，如seq id no.2所示，再由金开瑞公司合成此基因。
43.实施例2 pyltac380h-p
csp
::rzmg2载体的构建
44.本发明采用的启动子能特异性的驱动目标基因在愈伤组织中表达，所述启动子为：以水稻品种中花11基因组dna为模板，用引物pcspf/pcsp g2 r(seq id no.5-6所示)直接pcr扩增水稻愈伤组织特异表达基因(基因号loc_os08g04210)获得的启动子。
45.本发明采用的终止子为tmas。用fse i与xba i酶切质粒pylmf-h(图1)，将p
csp-rzmg2-tmas表达盒通过gibson assembly方法组装到fse i与xba i之间得到pylmf-h-p
csp-rzmg2-tmas，再将其与受体载体pyltac380gw(图2，简称p380)发生gateway-bp重组反应，得到重组质粒pyltac380h-p
csp
::rzmg2(图3)。其中载体t-dna区设计的两个loxp位点及其之间的hpt//rzmg2//cre表达盒，是用于将植物转化体进行热激诱导cre/loxp系统表达，以删除hpt//rzmg2//cre表达盒序列。
46.szmg2、p
csp
、tmas的扩增均采用带有接头的引物扩增，扩增体系如下表1：
47.表1
[0048]2×
phanta max buffer10μldntp mix(10um)0.5μl引物(f)(10um)0.6μl引物(r)(10um)0.6μlphanta酶0.5μl模板(基因组或基因)0.5μlddh2o补足至20μl
[0049]
扩增szmg2的引物如下(5
’→3’
)：
[0050]
pcsp g2 f(seq id no.3)：
[0051]
ggcgccatccatgctggaggtttcaacattgagg
[0052]
g2 tmas r(seq id no.4)：
[0053]
tcggatcaggttcatccagtagcgcctgttg
[0054]
扩增p
csp
的引物如下(5
’→3’
)：
[0055]
pcspf(seq id no.5)：
[0056]
gccgcggtaccagccggccggatgacatgtaaacaacgag
[0057]
pcsp g2 r(seq id no.6)：
[0058]
tgttgaaacctccagcatggatggcgccaattgctctc
[0059]
扩增tmas的引物如下(5
’→3’
)：
[0060]
g2 tmas f(seq id no.7)：
[0061]
gctactggatgaacctgatctcaaatcttggac
[0062]
tmasr(seq id no.8)：
[0063]
cgggccatggtgaatctagagatctgataatttatttg
[0064]
扩增反应程序采用常规热循环条件进行扩增。例如：预变性95℃3min，28～30个pcr循环(95℃30s，58℃30s，72℃1min/kb)，补充后延伸72℃2min。
[0065]
扩增得到的pcr产物进行纯化，纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司。
[0066]
用fse i与xba i酶切质粒pylmf-h，酶切试剂盒购自neb公司，酶切体系如下表2：
[0067]
表2
[0068]
10
×
buffer1μl酶fse i0.5μl酶xba i0.5μlpylmf-h8μl 合计10μl
[0069]
37℃条件下反应1h，进行酶切。
[0070]
65℃条件下反应20min，进行酶失活。
[0071]
将szmg2、p
csp
、tmas 3个片段通过gibson assembly连接到pylmf-h上，连接体系如下表3：
[0072]
表3
[0073]2×
gibson assembly反应液9μl片段szmg22μl片段pcsp2μl片段tmas2μlpylmf-h(已酶切)3μl 18μl
[0074]
连接反应：50℃条件下连接反应1h。
[0075]
将上述连接产物通过电击或热击转化至大肠杆菌dh10b，摇菌后涂布于amp抗性的lb培养基上过夜培养。对平板上的菌落进行菌落pcr鉴定，挑选阳性克隆菌株，提取质粒，得到pylmf-h-p
csp-szmg2-tmas。
[0076]
将供体载体pylmf-h-p
csp-szmg2-tmas与受体载体pyltac380gw发生gateway-bp重组反应，反应所需试剂盒为thermo fisher公司。反应体系如下表4：
[0077]
表4
[0078]
pylmf-h-pcsp-szmg2-tmas150ngp380gw150ng5×
bp clonaseⅱenzyme mix2μlddh2o补足至10μl
[0079]
25℃条件下过夜反应；加入1μl蛋白酶k在37℃条件下反应10min终止反应。
[0080]
将上述gateway-bp重组反应的产物转化至大肠杆菌dh10b中，摇菌后涂布于含有5％蔗糖的kan抗性lb培养基上过夜培养。对平板上的菌落进行菌落pcr鉴定，挑选阳性克隆菌株，提取质粒，得到重组质粒pyltac380h-p
csp
::rzmg2。
[0081]
实施例3重组质粒转入农杆菌eha105
[0082]
重组质粒pyltac380h-p
csp
::rzmg2转入农杆菌eha105的步骤如下：
[0083]
(1)取1μl质粒稀释10倍，4℃条件下透析30min；
[0084]
(2)透析好的质粒与50μl农杆菌感受态充分混合，加入已预冷的点击杯中，放入电击仪中进行电击转化，电击参数为:升压器电阻200ω，1650v。
[0085]
(3)加入1ml soc培养基并充分吹打，将菌体与培养基一同转入2ml离心管中；
[0086]
(4)37℃，200rpm条件下，复苏40min～60min；
[0087]
(5)涂布在含有kan抗性的lb培养基上，36h～48h。
[0088]
(6)对平板上的菌落进行菌落pcr鉴定，挑选阳性克隆菌株，加入等体积50％的甘油于-80℃保存。
[0089]
实施例4 rzmg2基因转化水稻粳稻和籼稻材料，并提高其遗传转化效率
[0090]
利用农杆菌介导的转化方法，将重组质粒pyltac380h-p
csp
::rzmg2和对照质粒(ck,包含p380h载体)分别转化籼稻华占和华光，和粳稻dongjing(dj)和中嘉8号。转化过程中发现，转化rzmg2基因的愈伤组织在分化阶段较对照组出现提前变绿、变绿的愈伤数目变多、提前出芽等表型(图4)；进一步统计发现，转化rzmg2基因的愈伤组织分化效率明显提高，在受体材料华占中提高了19.73％，在华光中提高了28.23％，其转化效率也有明显的提高，在华占和华光中分别提高了6.7％和23.0％(表5)。在dj中，转化对照质粒的愈伤组织分化效率极低，平均为6.53％，而转化rzmg2基因的愈伤组织分化效率可达到对照的2.8倍(表5)，有显著的提高；其转化率也有显著的提高，转化rzmg2的转化率为对照载体的3.4倍。对转化材料中嘉8号进行分化效率统计，转化rzmg2基因的愈伤组织分化效率较对照比有显著提高，提高了48.69％(表5)。
[0091]
表5 rzmg2转化水稻统计数据
[0092][0093][0094]
注：对于每个水稻品系，通过方差分析分析不同载体之间的分化率和转化率的显着差异(p《0.01**，p《0.001***)。/，未统计。
[0095]
实施例5水稻转基因植株检测
[0096]
取2cm左右的中嘉8号t0代转基因植株叶片，提取dna，进行pcr扩增检测rzmg2基因，检测引物(5
’→3’
)为：
[0097]
pcsp-jc-f(seq id no.9)：atcactgcatgtctgcatgc
[0098]
g2-jc2-r(seq id no.10)：tatcatcaccgcaagtctgc。
[0099]
对转基因植株进行pcr检测，结果得到一条674bp大小的条带为阳性转基因植株。
[0100]
结果如图5所示：m：2kb dna marker。
[0101]
实施例6转基因水稻植株中rzmg2和hpt基因的删除处理和检测
[0102]
遗传转化完成后，rzmg2和hpt基因可以通过热激诱导cre的表达进行自删除。将转化pyltac380h-p
csp
::rzmg2载体的华光、华占、dj的t0代种子在水中室温(28℃)条件下浸泡一天以打破休眠，将其置于培养箱中，培养箱每天(24h)设置的参数为：42℃，2.5h(光照，光强为13000lx)；28℃，9.5h(光照，光强为13000lx)；42℃，2.5h(黑暗)；28℃，9.5h(黑暗)；连续处理7d。将热处理后萌发的小苗种植于华南农业大学的实验基地，取第3或4片叶提取dna，进行pcr扩增检测其删除情况，检测引物(5
’→3’
)为：
[0103]
p-f(seq id no.11)：aattaattcctaggccaccatgttg
[0104]
p-r1(seq id no.12)：gtgcttgacattggggagtt
[0105]
p-r2(seq id no.13)：gtgtgcaatgggatgatcagac
[0106]
扩增反应程序为：预变性95℃3min，30个pcr循环(95℃30s，57℃30s，72℃35s)，补充后延伸72℃1min。
[0107]
若两个loxp之间发生重组删除，p-f/p-r2引物可以扩增出一条～0.5kb大小的条带，若没有发生删除，则可以扩增出～1.3kb的条带。扩增结果如图6a所示，大部分被检测的植株都可以扩增出两条一大一小的条带，说明热激处理有效，大部分植株都发生了部分删除。对扩增出的～0.5kb的条带进行测序，测序序列结果如图6b所示，与预期结果一致。
[0108]
实施例7 rzmg2基因转化玉米b104，并提高其遗传转化效率
[0109]
将重组质粒pyltac380b-p
csp
::rzmg2和对照质粒p380b分别转化玉米b104，转化过程中发现，转化rzmg2基因的愈伤组织状态好于对照，且在分化阶段，转化rzmg2基因的愈伤较对照相比分化出芽变多(图7)；对转化数据进行统计发现，转化rzmg2基因的转化效率明显提高，对照组的平均转化效率为17.68％，而转化rzmg2组的平均转化效率可达30.86％，提高了13.18％，说明rzmg2对提高玉米的转化效率也同样有效。
[0110]
表6 rzmg2转化玉米统计数据
[0111][0112][0113]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。