USP11在抑制细胞因子IL6降解中的应用

usp11在抑制细胞因子il6降解中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术，具体公开了usp11在抑制细胞因子il6 降解中的应用。


背景技术：

2.il6是一种重要的细胞因子，在抗感染，肿瘤免疫，免疫细胞发育等过程中发挥着重要的作用，因此维持一定的il6水平，使其免于过早被降解在上述过程中显得非常重要。usp11是参与机体泛素化过程的基因，研究发现其在多种肿瘤中表达异常，未见其参与il6降解的研究。


技术实现要素：

3.现有技术针对il6降解的研究较少，本发明公开了usp11新的功能-保护il6避免降解的作用，为抗感染和肿瘤的治疗提供新的靶点与思路。
4.本发明采用如下技术方案：usp11在抑制细胞因子il6 降解中的应用。
5.usp11在制备抑制细胞因子il6 降解药物中的应用。
6.过表达usp11的试剂在抑制细胞因子il6 降解中的应用，或者在制备抑制细胞因子il6 降解药物中的应用。
7.本发明中，usp11以病毒载体或者质粒的形式作为药物，比如慢病毒、腺病毒等常规病毒载体。
8.本发明分别取usp11基因敲除c57小鼠为实验组，对照组为usp11野生型c57小鼠。皮下注射5mg/kg lps，特定时间点取小鼠血清，elisa检测il-6含量，证实usp11能避免il6过早降解，为抗感染和肿瘤治疗提供更有效的治疗策略及思路。
附图说明
9.图1为lps（5mg/kg）处理后小鼠血清内il-6表达水平。
10.图2为人重组腺病毒感染293细胞。
11.图3为ad-usp11和ad-nc组细胞il-6 mrna表达水平差异。
12.图4为ad-usp11和ad-nc细胞上清液内il-6表达差异。
13.图5为慢病毒感染293细胞。
14.图6为sh-usp11和sh-nc组细胞il-6 mrna表达水平差异。
具体实施方式
15.c57bl/6小鼠(h-2b)为雌性小鼠，周龄为6-8周，体重为17-22 克，购买上海斯莱克实验动物公司。c57bl/6 遗传背景的 usp11-/-小鼠、人293细胞源自苏州大学医学部放射医学与防护学院。小鼠的饮用水、饲料和垫料均经过灭菌处理。所有小鼠均饲养于spf级别的隔离笼内。所有动物实验均按照苏州大学实验与动物伦理委员要求操作。
16.超净台消毒灭菌，快速复苏293细胞。用10%血清dmem培养基（青霉素+链霉素）于无菌培养皿内培养。定期观察。在超净台内用无菌pbs将lps粉末溶解，配制为1mg/kg的试剂。分装置于-80℃冰箱内待用。
17.elsia检测细胞因子。
18.血清获得方法。摘眼球取小鼠外周血至于于无热源和内毒素的试管内，室温下静置2h，离心，1000g，30min。取上清液于-80℃待用。
19.细胞上清液获得方法。观察细胞状态，取细胞融合度约为80%时进行实验。加入胰蛋白酶消化细胞。用预冷的pbs洗涤细胞。加入细胞裂解液（临用前一秒加入蛋白酶抑制剂）进行细胞重悬。离心，4℃ ，10000
×
g ，10min。取细胞上清，-80℃保存，避免反复冻融。
20.elsia测试。预先进行标号，a1-a6为标准品孔，其他为样品孔，每个样品加3个复孔。按照说明书进行操作，分别加入标准品和样品5ul,样品稀释液45ul。加入酶标抗体100ul,37℃ 30min。洗涤，每次1分钟，洗涤5次。加入显色液a液和b液于37℃孵育15分钟，加入终止液。在酶标仪上于450nm检测各组od值。
21.rt-pcr检测mrna水平。总rna的获取，小鼠外周血静置2h后进行离心，上层为血清，下层为单核细胞。将上层血清吸取掉后向剩余组织内加入1ml trizol溶液室温下颠倒混匀15min。加入200ul氯仿，震动1min后静置5min，离心,12000rpm,15min,4℃。将上层吸取至新ep管内，加入500ul异丙醇，冰上30min。离心。弃上清，加1ml 75%乙醇，离心。弃上清液，于通风橱中冰上30min，加入25ul的depc水溶解置于-20℃冰箱。rna浓度的测定，将rna于-20℃冰箱取出，于震动涡旋器上震荡，吸取2ul的depc水做空白对照，其余样品吸取2ul于板上，使用全自动酶标仪进行检测。
22.本发明具体操作方法以及测试方法为常规技术，graphpad prism 8.0作图，spss 20统计分析。p《0.05定义为有显著性差异。
23.实施例一小鼠分组及腹腔注射lps诱导脓毒血症模型。实验小鼠分组：wt小鼠（usp11野生型）和ko小鼠（usp11基因敲除）各10只，分别接受lps腹腔注射剂量为5mg/kg。
24.1.分别取usp11基因敲除c57小鼠为实验组，对照组为usp11野生型c57小鼠，皮下
注射5mg/kg lps。
25.2. 特定时间点取小鼠血清，行elisa检测il-6含量。
26.3. usp11基因敲除后，小鼠血液中il-6含量，在lps刺激4小时后，明显低于未敲除小鼠。说明，usp11有效降低il-6的降解速度，参见图1。
27.实施例二重组腺病毒ad-usp11转染293细胞。显微镜下观察293细胞细胞融合至70%后，消化细胞，离心。分为实验组（ad-usp11）和对照组（nc-usp11）弃掉上清液，向每个孔内一次加入病毒稀释液和细胞培养基，混匀，培养24h后更换正常培养基，观察细胞状态。48h后，胰蛋白酶消化细胞，离心，重悬细胞观察状态，用于后续实验。取上述培养好的细胞，加入lps（1ug/ml）刺激293细胞产生il-6。
28.实施例三慢病毒sh-usp11转染293细胞。293细胞融合度为70%时，使用胰酶将细胞下滑下来，计数，调整细胞浓度。使用培养基重悬细胞，滴加慢病毒试剂。实验组为（sh-usp11），对照组为（sh-nc）。慢病毒用量：病毒体积=（moi
×
细胞数）/病毒滴度。12h后更换为正常培养基，继续培养，观察细胞状态。感染72小时后，qrt-pcr检测感染效率用于后续实验。取上述培养好的细胞，加入lps（1ug/ml）刺激293细胞产生il-6。
29.观测lps（1ug/ml）处理实施例二及实施例三细胞后il-6表达水平的变化，在细胞水平验证usp11和il-6的相关性。使用lps刺激过表达usp11和对照组的293细胞，测il-6的表达量。从图2可以看到usp11过表达成功，图3看到高表达usp11组il-6的mrna水平较正常对照组增高（p《0.05），同时图4看到elsia检测细胞上清液测高表达usp11组的il-6水平明显高于对照组（p《0.05）。同样的，取293细胞进行慢病毒包装，设置usp11低表达组（sh-usp11）和对照组（sh-nc），从图5可以得出慢病毒下调usp11表达量模型建立成功，图6可以看到下调usp11后il-6的mrna表达水平随之下降（p《0.05）。
30.il-6 可由多种细胞分泌，其负责协调t细胞扩增和分化，usp11作为一种重要的去泛素化酶，在免疫细胞的活化起着重要作用；脂多糖(lps)诱导的细胞分泌il-6等，本发明通过实验公开了usp11新的功能-保护il6，避免过早降解。