一株具有好氧砷甲基化和挥发功能的噬几丁质菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有好氧砷甲基化和挥发功能的噬几丁质菌及其应用。


背景技术：

2.砷是环境中普遍存在的有毒且致癌物质，是全球多个国家共同面临的环境问题。尤其是三价砷（亚砷酸或亚砷酸盐）在土壤与水体中的移动性更大，毒性更强。三价砷更容易被水稻等作物吸收，引发粮食砷超标等风险问题。因此，如何有效控制砷污染，是当前水污染治理与土壤修复的前沿问题，也是国家重大需求。研究表明，土壤中携带有砷甲基化功能基因的微生物，具有将无机砷转化为甲基砷等有机胂形态。由于产生的有机胂一方面毒性更弱，也更容易从土壤或水体挥发；此外，有机胂也更难被水稻等作物吸收，并进一步可降低稻米等农产品中无机砷的比例。因此，无机砷，特别是三价砷的甲基化过程是一种有效的砷解毒过程，有助于降低砷污染风险。已有研究表明，砷甲基化功能好氧菌生长速度快，其砷甲基化效率远大于厌氧菌。cn201510956127.5鉴定了一株嗜纤维菌科的好氧砷甲基化细菌sm-1，但该菌仅能在r2a培养基中生长，且无法在lb等培养基中生成，具有明显的局限性。此外，该菌的适应的砷浓度较低，不利于广泛应用。鉴于当前砷甲基化菌资源的极度短缺，亟需发掘新型的砷甲基化功能微生物菌种。因此，分离获得稻田土壤中好氧砷甲基化和挥发功能菌，对利用微生物技术解决我国环境具有重要的应用价值与意义，也有助于提升我国环境微生物治理技术的核心竞争力。


技术实现要素：

3.为解决相关问题，本发明的第一个目的在于提供一株具有好氧砷甲基化和挥发功能的噬几丁质菌。
4.本发明的第二个目的在于提供上述具有好氧砷甲基化和挥发功能的噬几丁质菌的应用。
5.本发明的目的通过如下技术方案实现：一株具有好氧砷甲基化和挥发功能的噬几丁质菌，名称为噬几丁质菌（chitinophaga filiformis）yt5，其于2021年12月31日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），保藏编号为：gdmcc no：62178。
6.所述的噬几丁质菌yt5的应用，将所述的噬几丁质菌yt5置于含有无机三价砷的环境中培养，实现砷甲基化。
7.进一步地，所述的甲基化为二甲基化和/或三甲基化。
8.进一步地，所述的无机三价砷为亚砷酸和/或亚砷酸盐。
9.进一步地，所述的无机三价砷在环境中的浓度范围为0～100μmol/l；优选为0～50μmol/l；更优选为0～12μmol/l；最优选为0～6μmol/l。
10.进一步地，所述的环境包括但不限于培养基、土壤和水体。
11.进一步地，所述的培养基为r2a培养基、lb培养基和tsb培养基中的任意一种。
12.进一步地，所述的r2a培养基的配方为：胰蛋白胨0.3～0.4g/l，酸水解酪蛋白0.4～0.6g/l，酵母浸粉0.4～0.6g/l，可溶性淀粉0.4～0.6g/l，磷酸氢二钾0.2～0.4g/l，硫酸镁0.05～0.15g/l，丙酮酸钠0.2～0.4g/l，蛋白胨0.2～0.3g/l，葡萄糖0.4～0.6g/l，余量为水，ph 7.2
ꢀ±ꢀ
0.2；优选为胰蛋白胨0.35g/l，酸水解酪蛋白0.5g/l，酵母浸粉0.5g/l，可溶性淀粉0.5g/l，磷酸氢二钾0.3g/l，硫酸镁0.1g/l，丙酮酸钠0.3g/l，蛋白胨0.25g/l，葡萄糖0.5g/l，余量为水，ph 7.2
ꢀ±ꢀ
0.2。
13.所述的lb培养基的配方为：9～11g/l蛋白胨，4～6g/l酵母粉，9～11g/l nacl，余量为水；优选为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l nacl，余量为水。
14.所述的tsb培养基的配方为：胰蛋白胨16～18g/l，大豆木瓜蛋白酶消化物2～4g/l，氯化钠4～6g/l，磷酸二氢钾2～3g/l，葡萄糖2～3g/l，余量为水，ph值7.3
ꢀ±ꢀ
0.2；优选为：胰蛋白胨17g/l，大豆木瓜蛋白酶消化物3g/l，氯化钠5g/l，磷酸二氢钾2.5g/l，葡萄糖2.5g/l，余量为水，ph值7.3
ꢀ±ꢀ
0.2。
15.进一步地，当所述的环境为培养基时，所述的噬几丁质菌yt5的接种量按细菌细胞密度od
600
=0.01计。
16.进一步地，所述的培养的条件为温度28～32℃、转速150～250rpm、时间60～80h；优选为温度30℃、转速200rpm、时间72h。
17.一种具有好氧砷甲基化和挥发功能的微生物制剂，含有培养基和所述的噬几丁质菌yt5。
18.进一步地，所述的培养基为r2a培养基、lb培养基和tsb培养基中的任意一种。
19.上述具有好氧砷甲基化和挥发功能的微生物制剂的制备方法，在培养基中接种所述的噬几丁质菌yt5，震荡培养，得到所述的具有好氧砷甲基化和挥发功能的微生物制剂。
20.所述的震荡培养的条件为温度28～32℃、转速150～250rpm、时间8～14h；优选为温度30℃、转速200rpm、时间10～12h。
21.上述具有好氧砷甲基化和挥发功能的微生物制剂在砷污染环境修复中的应用。
22.进一步地，所述的环境包括但不限于水体和土壤。
23.进一步地，所述的应用的具体操作为：将所述的具有好氧砷甲基化和挥发功能的微生物制剂置于待修复的环境中培养即可。
24.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供的噬几丁质菌yt5对无机三价砷具有明显的甲基化作用以及挥发甲基砷的能力，主要甲基砷产物为三甲基砷和二甲基砷，其中以毒性更低的三甲基砷占比为主。可见，噬几丁质菌yt5可以明显的降低剧毒无机砷的含量，产生毒性较低的有机胂和挥发性的砷，在砷污染环境治理和修复，尤其是砷污染土壤治理和修复中具有重要应用潜力。
25.本发明进一步确定了噬几丁质菌yt5调控砷甲基化的最佳培养底物。
附图说明
26.图1为砷甲基化功能噬几丁质菌yt5在r2a培养基中的菌落形态图。
27.图2为砷甲基化功能噬几丁质菌yt5对数期细胞形貌表征图；其中，a为sem图，b为tem图。
28.图3为砷甲基化功能噬几丁质菌yt5的16s rrna基因系统发育树图。
29.图4为砷甲基化功能噬几丁质菌yt5在含砷r2a、lb和tsb培养基中的生长曲线图。
30.图5为砷甲基化功能噬几丁质菌yt5在含砷r2a、lb和tsb培养基中的甲基砷产生效率分析结果图。
31.图6为砷甲基化功能噬几丁质菌yt5在含不同初始亚砷酸的tsb培养基中培养72小时后砷甲基化效果的分析结果图。
32.图7为砷甲基化功能噬几丁质菌yt5在含砷r2a、lb和tsb培养基中72小时内的砷挥发累积量分析结果图。
33.图8为砷甲基化功能噬几丁质菌yt5在土壤体系中转化无机砷的分析结果图。
具体实施方式
34.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
35.实施例1：砷甲基化功能噬几丁质菌yt5的分离和鉴定样品采集自湖南某地砷污染稻田土壤。称取经自然风干且过10目筛的土壤样品100g于250ml锥形瓶，加入灭菌超纯水100ml，用透气膜封住瓶口，于室温下静置培养15天对土壤微生物进行活化。用灭菌超纯水对土壤悬浊液进行梯度稀释，浓度梯度为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
和10-7
，分别取100μl浓度为10-4
、10-5
、10-6
和10-7
的稀释液涂布于含20μm亚砷酸的st10-1
固体培养基平板上。st10-1
固体培养基配方如下：胰蛋白胨0.5g，酵母提取液0.05g，葡萄糖0.5g，定容至1000ml，于121℃高温高压灭菌20min。用0.22μm孔径滤膜对12mm亚砷酸储备液过滤除菌后，添加1.7ml储备液至1000ml培养基中，使亚砷酸终浓度为20μm。将涂布后的平板倒置于30℃培养箱中培养72h，挑取形态特征有明显区别的单菌落接种于含10μm亚砷酸的100mlr2a培养基。r2a液体培养基配方如下：胰蛋白胨0.35g，酸水解酪蛋白0.5g，酵母浸粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.1g，丙酮酸钠0.3g，蛋白胨0.25g，葡萄糖0.5g，ph 7.2，加水定容至1000ml，于121℃高温高压灭菌20min。单菌落接种培养72h后，用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪（hplc-icp-ms，perkinelm）检测培养液中的一甲基砷、二甲基砷、三甲基砷、亚砷酸和砷酸含量，选择有甲基砷生成的菌液进行平板划线纯化，经三次纯化后获得一株具有砷甲基化功能的菌株。
36.形态特征分析：该菌株为革兰氏阴性菌，无内生孢子，无游动性。如图1所示，该菌株在r2a上30℃好氧生长3天，菌落圆形，凸起，表面光滑，边缘整齐，金黄色，菌落直径为0.5-1.0mm。扫描电镜（sem，图2中的a）显示该菌株整体呈杆状，菌体末端钝圆；透射电镜（tem，图2中的b）显示菌株yt5呈椭圆，无芽孢，无菌毛，核区有电子致密体，细胞平均长约1.5μm
±
0.4μm，宽0.4μm
±
0.1μm。
37.生理生化特征分析：该菌株可在37℃条件下生长，不能在厌氧条件下生长。接触酶（过氧化氢酶试验）呈阴性，说明该菌株不具有催化过氧化氢分解为分子态氧从而解毒的能力。氧化酶呈阳性，说明菌株具备细胞色素氧化酶，其使细胞色素c氧化为氧化型细胞色素c，后者氧化苯二胺从而显色。该菌株能水解七叶灵，生成葡萄糖和七叶甙原。明胶液化呈阳性，说明该菌株具有明胶酶，具备使明胶液化的功能。2-硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷（onpg）实验阳性，表明该菌株具有β-半乳糖苷酶活性，分解onpg生成黄色的邻-硝基酚，可
发酵乳糖。吲哚产生阴性，即菌株不能分解蛋白胨中的色氨酸，无法产生靛基质（吲哚）；也不具备葡萄糖产酸的能力。精氨酸双水解酶和脲酶阴性，表明该菌株无精氨酸脱酰酶和瓜氨酸酶活性，和无水解尿素的活性。硝酸盐还原呈阳性，菌株具有硝酸还原酶，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。对于糖类利用能力，该菌株可利用葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖和鼠李糖，还具有利用水杨苷和蜜二糖的能力，但不能利用核糖、丝氨酸、甘露醇和柠檬酸盐。
38.16s rrna基因序列分析：采用细菌dna提取试剂盒（dneasy blood & tissue kit, qiagen, valencia, ca）提取该菌株的基因组dna，将获得的dna作为模板，用引物27f（agagtttgatcmtggctcag）和1492r（ggttaccttgttacgactt）对其16s rrna基因进行扩增，将pcr产物送至上海生工生物有限公司进行sanger测序。该菌株的16s rrna基因片段序列长度为1354bp，具体序列如seq.id no.1所示。利用blast在genbank数据库中与已登录的序列进行核苷酸同源性比较，结果表明该好氧砷甲基化功能菌株yt5与chitinophaga filiformis的同源性达99.48%（曾用名flexibacter filiformis）。将该菌株的16s rrna基因序列与和chitinophaga属其他菌株该基因序列，在mega软件中通过muscle算法进行多重比对，删除比对后序列前后空位，通过邻接法构建系统发育树。从图3中树的拓扑结构可以看出，该菌株与模式菌株chitinophaga filiformis ifo 15056
t
同源性最高。
39.综合形态特征、生理生化特征、16s rrna基因序列分析结果，初步判断该菌株为噬几丁质菌chitinophaga，将该菌株命名为噬几丁质菌（chitinophaga filiformis）yt5，并于2021年12月31日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），保藏编号为：gdmcc no：62178。
40.16s rrna基因序列（seq.id no.1）：caggtagcaatactgggtggcgaccggcaaacgggtgcggaacacgtacgtaaccttcctttaagtgggagatagcccgaagaaattcggattaataccccataagatcatggagtggcatcactcagtgattaaagaatttcgcttaaagatgggcgtgcggctgattaggtagttggtgaggtaacggctcaccaagccaacgatcagtaactggcgtgagagcgcgaccagtcacacgggcactgagacacgggcccgactcctacgggaggcagcagtaaggaatattggtcaatggacggaagtctgaaccagccatgccgcgtgaaggatgaaggtcctctggattgtaaacttcttttatatgggaagaaaccacttttttctaaaggtgttgacggtaccataggaataagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttatccggattcactgggtttaaagggtgcgtaggcggattagtaagtccgtggtgaaatctccgagcttaactcggaaactgccgtggatactattaatcttgaatgctgtggaggttagcggaatatgtcatgtagcggtgaaatgcatagatatgacatagaacaccaattgcgaaggcagctggctacacagagattgacgctgaggcacgaaagcgtggggatcaaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgattactcgacatttgcgatatacagtaagtgtctgagcgaaagcattaagtaatccacctgggaagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggtccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgatacgcgaggaaccttacctgggctagaatgctgggggactggatctgaaagggtcctttgtagcaatacaccgccagtaaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgccgtgaggtgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatctttagttgccaacaggtcaagctgggaactctaaagaaactgccgtcgtaagacgcgaggaaggaggggatgatgtcaagtcatcatggcctttatgcccagggctacacacgtgctacaatggtaggaacaaagggctgctacctggtaacaggatgctaatctcaaaaatcctatctcagttcgaattgagggctgcaactcgccctcatgaagctggaatcgctagtaatcgtatatcagcaatgatacggtgaatacgttcccggaccttgtacacaccgcccgtcaagccatgaaagccggggggacctgaag 。
41.实施例2：砷甲基化功能噬几丁质菌yt5在含砷r2a、lb和tsb培养基中的生长曲线和砷甲基化效率用r2a、lb和tsb三种液体培养基对yt5进行扩大培养与砷甲基化效率验证。具体如下：配制灭菌r2a液体培养基500ml，将划线平板中单菌落接种至培养基中震荡培养（30℃，200rpm）10小时-12小时，其od600为0.4-0.5，处于对数期中期。扩大培养的菌液在5000rpm条件下离心10min进行菌体收集。取0.55ml yt5菌液（od600=1.8）分别接种在含12μm亚砷酸的100ml灭菌r2a、lb和tsb液体培养基中。lb液体培养基配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l nacl，余量为水；tsb液体培养基配方为：胰蛋白胨17.0 g/l，大豆木瓜蛋白酶消化物3.0 g/l，氯化钠5.0 g/l，磷酸二氢钾2.5 g/l，葡萄糖2.5 g/l，余量为水，ph值7.3
ꢀ±ꢀ
0.2。反应初始菌od600为0.01，培养液于30℃、200rpm恒温震荡条件下培养72小时，分别在培养各取样时间点，取200μl菌液于酶标板中测定od600，且将1ml菌液样品经12000rpm离心2min，且0.22μm滤膜过滤上清液后，用hplc-icp-ms进行砷形态分析和定量。
42.如图4所示，菌株yt5在含砷培养基中的生长曲线显示，菌株yt5均能在三种培养基中生长，并呈现不同的生长特征；对数期在lb中滞后，在tsb中培养24小时后yt5生长加速，并在40小时超过r2a。在r2a、lb和tsb中分别在24，58和40小时进入稳定期，且lb和tsb中生物量比r2a中大3.5-4.4倍，说明lb和tsb为扩大培养菌株yt5的最佳培养基。
43.如图5所示，菌株yt5在含砷r2a、lb和tsb培养基中对12μm亚砷酸有明显的甲基化作用。在三种培养基中，三甲基砷和二甲基砷浓度随培养时间增加逐渐增加，同时无机亚砷酸浓度随时间增加而降低。培养第48小时，tsb中甲基砷效率最高，其次为lb和r2a。72小时反应结束后，r2a、lb和tsb培养基中亚砷酸转化为甲基砷比例分别为13%、38%和53%，证明菌株yt5在三种培养基条件下，均能较好的将亚砷酸转化为甲基砷。甲基砷主要产物为三甲基砷和二甲基砷，并且毒性更低的三甲基砷的比例在r2a、lb和tsb中分别占40%，44%和52%。
44.实施例3：砷甲基化功能噬几丁质菌yt5在tsb培养基中转化不同浓度的亚砷酸的效率比较参考实施例2，取0.55ml yt5菌液（od600=1.8）分别接种在3、6、12、24、48μm亚砷酸的100ml灭菌tsb液体培养基中。菌株yt5反应初始菌od600为0.01，培养液于30℃、200rpm恒温震荡条件下培养72小时后，分别在各个处理样品取点，将1ml菌液样品经12000rpm离心2min，且0.22μm滤膜过滤上清液后，用hplc-icp-ms进行砷形态分析和定量。
45.如图6所示，菌株yt5在tsb培养基中对不同梯度亚砷酸均具有很好的砷甲基化转化效率；在72小时内，对亚砷酸的甲基化转化率分别为100%、98.2%、52.1%、24.3%、10.5%；甲基砷产生量也分别达到了3.05、6.1、6.3、5.83、5.1μm；结果表明，在接同菌株量的前提下，随着亚砷酸初始浓度的增加，对其转化量没有显著下降，证明菌株yt5对亚砷酸具有较好的耐受能力。
46.实施例4：砷甲基化功能噬几丁质菌yt5在含砷r2a、lb和tsb培养基中的砷挥发效率配制120ml含12μm无机亚砷酸的r2a、lb和tsb培养基分别于500ml的磨口集气玻璃瓶。挥发性砷的收集装置是由500ml磨口玻璃瓶、通气接口和捕集器组成，通气接口有两个，一个是鼓风通气，另一个是由锡箔纸包裹着的1ml枪头，枪头两端为石英棉，中部填充物为经1%agno3浸泡过夜的35-60目高纯硅胶粒，起着排气和氧化捕获挥发性砷的作用。反应初
始菌液od600为0.01，培养置于30℃，200rmp摇床，培养72小时后回收捕集头。为了收集完全玻璃瓶内和培养物中的挥发性砷，每次需要从进气口鼓风20分钟，间歇性晃动玻璃瓶，结束后更换新的捕获器。取出回收捕集枪头内的硅胶粒，在2ml 0.5（v/v）hno3中90℃回流消煮洗脱2小时，洗脱后的溶液经hplc-icp-ms测定砷形态和含量。由于实验中能检测到的挥发性砷只有三甲基砷，含agno3浸泡的硅胶颗粒能将三甲基砷氧化为三甲基砷氧化物。因此，洗脱液中的砷含量代表着三甲基砷含量。
47.菌株yt5在r2a、lb和tsb中培养72小时后皆有挥发性砷产生。如图7所示。挥发性甲基砷产物形态为低毒性的三甲基砷，无其他挥发性砷形态检出。r2a、lb和tsb培养基中挥发性甲基砷分别为0.014μg，0.16μg和0.07μg（以砷计）。挥发性甲基砷以三甲基砷为主，72小时内的砷挥发率占三个培养基总砷比例分别为0.01%（r2a），0.2%（lb），0.1%（tsb）。上述结果表明菌株yt5对砷具有较好的挥发能力。
48.实施例5：砷甲基化功能噬几丁质菌yt5修复含砷污染土壤砷的效果采集湖南某地砷污染稻田土壤（土壤ph= 6.4，总砷= 45.6mg/kg），经自然风干且过10目筛，获得均匀土壤样品。其中，取部分土样样品，利用co-γ辐照进行灭菌，获得灭菌土样。各称取4g原始土壤样品、以及4g灭菌土壤样品于50ml锥形瓶，并分别加入灭菌超纯水40ml；根据实施例2获得的yt5菌株，取0.55ml yt5菌液（od600=1.8），分别加入上述原始土壤以及灭菌土壤的锥形瓶中，并设置相应的对比组（即未接种yt5菌液的样品），锥形瓶放于室温下静置培养14天反应后，取1ml菌液样品，加入一定量的磷酸提取液，进行振荡提取后，经12000rpm离心2min，且0.22μm滤膜过滤上清液后，用hplc-icp-ms进行砷形态分析和定量。
49.如图8所示，相对于土壤对照组的甲基砷含量（1.5mg/kg），以及灭菌土壤对照组的甲基砷含量（0.1mg/kg），接种了yt5菌种的砷污染土壤中，磷酸盐提取态的甲基砷总量达到了15.5mg/kg，显著高于上述土壤对照组与灭菌土壤对照组中砷的甲基化率，证明yt5菌种可有效提高砷污染土壤的甲基化率；同时，与直接接种至灭菌土壤中的砷甲基率（16.9mg/kg）相近，证明yt5菌种的添加及其效果受到土壤土著微生物的影响较小。
50.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。