与母猪产畸形仔猪性状相关的SNP分子标记及其应用

与母猪产畸形仔猪性状相关的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于猪分子标记技术领域，具体涉及与母猪产畸形仔猪性状相关的 snp分子标记及应用。


背景技术：

2.我国是世界上生猪养殖规模最大的国家，且国民对猪肉产品的消费量居世界第一，而猪的育种工作作为生猪养殖的源头性工作，育种工作取得有效进展即可对我国生猪总产量及其相关行业带来的巨大的经济效益(刘文涛和顾立伟，2016)。至2021年末，据统计我国能繁母猪存栏量达4329万头，年产胎次约为2.3胎，平均窝产仔数约为13头，仔猪畸形发生率为2.9％，我国每年将损失约3753.7万头仔猪(王明华，2022)。近年来随着育种工作的开展，我国地方猪的一些性状得到有效改良。采用常规的育种手段，对背膘厚、瘦肉率等具有中高等遗传力的生产性状的改良取得了较为显著的进展，而对于窝产活仔数、死胎数、畸形仔猪数等具有较低遗传力的繁殖性状的改良面临较大困难(zhang et al，2019)。
3.随着分子生物学及多组学测序技术的发展，分子标记辅助选择育种逐渐成为育种工作的主流手段。许多研究证明，分子标记辅助选择在低遗传力性状选择方面具有显著优势，极大提高了育种效率(ding et al，2021)。国内外学者已经对与仔猪畸形性状和产畸形仔猪数相关的分子标记进行了大量研究，并挖掘了潜在的功能基因。hao等人对杜洛克、长白猪、大白猪三个群体进行研究，通过gwas 筛选出7个与仔猪八字腿综合征(piglet splay leg syndrome，psl)显著相关的 snp，定位到4个候选基因(hao et al，2017)。траспов等人通过gwas在大白猪群体中鉴定到24个与仔猪肛门闭锁、肢蹄问题和仔猪震颤等畸形性状显著相关的snp，涉及到11个功能基因(трасповet al，2020)。此外，杨杰等人鉴定到与母猪产畸形仔猪数显著相关的snp，为猪分子标记辅助选择育种工作做出一定贡献(杨杰等，2021)。纵观国内外研究，对于鉴定与母猪产畸形仔猪相关分子标记的研究较少。
4.本发明通过gmat软件进行全基因组关联分析，筛选到4个与母猪产畸形仔猪性状显著关联的snp位点，为猪分子标记辅助选择育种工作提供了理论基础及应用途径(wang et al，2020)。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用基因芯片技术进行基因分型，与母猪产畸形仔猪性状进行全基因组关联分析，筛选出4个与母猪产畸形仔猪性状显著相关的snp，为母猪繁殖性状提供了新的snp分子标记资源。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.申请人通过全基因组关联分析筛选得到与母猪产畸形仔猪性状显著相关的 snp分子标记，并依据ensmble数据库猪11.1版本参考基因组得到每个snp上下游100bp的核苷酸序列，具体如下：
8.含有snp1标记的核苷酸序列如seq id no.1和2所示，snp1标记位于所述序列的第
101位，对应于猪基因组3号染色体第114038560位，对应的基因为 ncoa1，多态性位点为a或c；该位点的基因型为ac时，母猪拥有高的产畸形仔猪率；
9.含有snp2标记的核苷酸序列如seq id no.3和4所示，snp1标记位于所述序列的第101位，对应于猪基因组9号染色体第17003320位，对应的基因为 prcp，在dbsnp数据库中的登录号为rs338617139，多态性位点为g或a；该位点的基因型为ga时，母猪拥有高的产畸形仔猪率；
10.含有snp3标记的核苷酸序列如seq id no.5和6所示，snp1标记位于所述序列的第101位，对应于猪基因组9号染色体第17029982位，对应的基因为 prcp，在dbsnp数据库中的登录号为rs318571326，多态性位点为t或a；该位点的基因型为ta时，母猪拥有高的产畸形仔猪率；
11.含有snp4标记的核苷酸序列如seq id no.7和8所示，snp1标记位于所述序列的第101位，对应于猪基因组9号染色体第17083124位，对应的基因为 ddias，在dbsnp数据库中的登录号为rs340077666，多态性位点为a或g；该位点的基因型为ag时，母猪拥有高的产畸形仔猪率；
12.与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
13.相比于传统筛选方法，本发明具有简单、快捷等突出优点。将其应用在母猪产畸形仔猪性状的选择育种上，可降低产畸形仔猪总量，大量减少养猪企业的经济损失、增加生产收益；国家整体观上可以增大养猪业的有效产业规模，且提高国内生猪育种水平、加速育种进程。
附图说明
14.图1：实施例2制作的曼哈顿图，将gwas分析的结果可视化。阈值线以上共有5个snp，其中14号染色体上的1个snp位于基因间区，属于非编码区。其余4 个位于基因编码区的为本发明筛选出的与大白母猪产畸形仔猪性状显著相关的 snp分子标记。
15.图2：实施例2制作的qq图，通过比较实际的-log(p)值和期望的-log(p)值概率分布的分位数从而对两个概率分布进行比较，用于进一步判断gwas结果的可靠性。
具体实施方式
16.实施例1基因分型检测及数据处理
17.(1)dna提取
18.①
采集1175头大白母猪的耳朵组织，将采集到的耳样组织捣碎置于玻璃匀浆器中，加入等体积的由100mmol/l的tris饱和酚、500mmol/l的乙二胺四乙酸二钠(edta)、20mmol/l的氯化钠(nacl)、10％浓度的十二烷基硫酸钠(sds)、20ug/ml的胰rna酶配置成的细胞裂解缓冲液，再加入10ng/ml 的蛋白酶k，混匀，置于65℃恒温水浴锅中水浴30min；
19.②
缓慢振荡离心管15min，置于离心机中以12000rpm离心5min后，取上清液入另一离心管中；
20.③
加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇(体积比为25:24:1)，振荡混匀，置于离心机中以12000rpm离心5min后，取上清液入另一离心管中；
21.④
再加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇(体积比为25:24:1)，振荡混匀，置于离心机
中以12000rpm离心10min，取上清液入另一离心管中；
22.⑤
加入2倍体积的预冷无水乙醇，静置待乙醇挥发后，挑出dna沉淀并使用超纯水溶解dna；
23.⑥
用dna浓度测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测dna质量。
24.(2)基因分型检测
25.①
根据上述所提取的dna，使用illumina公司研制的50k snp全基因组芯片进行基因分型，该芯片包含超过50000个snp分子标记位点；
26.②
基于152头大白母猪全基因组重测序数据，对原始测序数据进行基因分型处理，并使用plink v1.9软件对得到的snp分子标记位点进行质控，剔除检出率小于90％、最小等位基因频率小于0.05的snp，最终有17985419个snp 用于基因型填充；
27.(3)基因型填充
28.使用beagle v5.1软件，以大白猪全基因组重测序数据为参考群，对芯片数据进行填充，筛选出10197628个填充准确性高于0.8的snp分子标记位点用于后续分析。
29.实施例2snp分子标记与大白母猪产畸形仔猪性状的全基因组关联分析
30.(1)表型定义
31.母猪产畸形仔猪视为case-control性状，根据原表型记录中每头母猪每胎产畸形仔猪的情况，将母猪有产两胎及以上畸形仔猪作为case，母猪未产畸形仔猪或只产一胎畸形仔猪作为control，case-control构建新表型用于后续全基因组关联分析。
32.(2)snp分子标记质控
33.根据上述基因型填充后筛选出的可靠snp分子标记位点，使用plink v1.9 软件分别对填充后的case表型和control表型的snp进行质控，针对case表型的snp数据剔除最小等位基因频率小于0.01的snp，针对control表型的snp 数据剔除最小等位基因频率小于0.01的snp，合并后取完全重叠的snp分子标记。最终有1175个样本和7851901个snp用于全基因组关联分析。
34.(3)大白母猪产畸形仔猪性状全基因组关联分析
35.本实施例全基因组关联分析所用的实验猪群为大白猪，包括1175头母猪。根据实验猪群所记录的产畸形仔猪信息，基于混合线性模型的方法，使用gmat 软件中的uvlmm分析模块，对snp分子标记与大白母猪的产畸形仔猪性状进行全基因组关联分析。具体模型如下所示：
36.y＝μ+wα+xβ+zu+e
37.其中，y为表型向量；μ为群体均值；w为固定效应设计矩阵；α为固定效应向量的分类变量；x为snp向量；β为snp效应；z为设计矩阵；u为个体效应；e为随机残差。
38.根据gwas的结果将每个snp位点p值计算为-log(p)，根据显著阈值线计算公式-log(1/snp数)计算，本发明计算得每个snp位点的-log(p)值大于等于6.889143时表明该snp与性状之间存在显著关联，并使用r语言的cmplot包绘曼哈顿图和qq图(图1，图2)。
39.表1：基于gwas鉴定的大白母猪产畸形仔猪性状的候选snp位点
[0040][0041]
表2：候选snp位点在大白母猪中的基因型频率和产畸形仔猪率分布
[0042][0043]
表2说明：括号内为该基因型母猪有2胎及以上产畸形仔猪的频率。
[0044]
如表1所述，筛选出4个与母猪产畸形仔猪性状显著关联的snp位点，进一步统计每个snp位点不同基因型的个体数以及对应基因型产2胎及以上产畸形仔猪的个体数，并计算不同基因型的产畸形仔猪率(产2胎及以上畸形仔猪的个体数/该基因型个体数)。由表2可知，对于3:114038560、9:17003320、9: 17029982、9:17083124这4个snp位点，基因型分别为ac、ga、ta、ag时，母猪有2胎及以上产畸形仔猪的频率要高于其他基因型的个体。
[0045]
主要参考文献：
[0046]
[1]刘文涛，顾立伟.关于中国与美国养猪业的比较研究[j].中国畜牧杂志，2016， 52(06):3-7.
[0047]
[2]王明华：粮食产量再创新高畜牧业生产稳定增长 [eb/ol].http://www.stats.gov.cn/xxgk/jd/sjjd2020/202201/t20220118_1826603.html, 2022
–
01
–
18/2022
–
02
–
23.
[0048]
[3]杨杰，吴珍芳，邱益彬，丁荣荣，郑恩琴，蔡更元，李紫聪，洪林君，徐铮.一种猪13号染色体上与母猪产畸形仔猪数相关的snp分子标记及其用途[p].广东省：cn113637768a，2021-11-12.
[0049]
[4]ding r,qiu y,zhuang z,ruan d,wu j,zhou s,ye j,cao l,hong l,xu z, zheng e,li z,wu z,yang j.genome-wide association studies reveals polygenic genetic architecture of litter traits in duroc pigs.theriogenology,2021,173:269-278. [5]hao x,plastow g,zhang c,xu s,hu z,yang t,wang k,yang h,yin x,liu s, wang z,wang z,zhang s.genome-wide association study identifies candidate genes for piglet splay leg syndrome in different populations.bmc genet,2017, 18(1):64.
[0050]
[6]трасповаа,костюнинаов,белоусаа,карпушкинатв,свеженцевана, зиновьевана.whole-genome association studies of distribution of developmental abnormalities and other breeding-valuable qualitative traits in offspring of the russian large-white boars.vavilovskii zhurnal genet selektsii,2020,24(2):185-190.
[0051]
[7]wang d,tang h,liu jf,xu s,zhang q,ning c.rapid epistatic mixed-model association studies by controlling multiple polygenic effects[j].bioinformatics,2020, 36:4833-4837.
[0052]
[8]zhang z,chen z,ye s,he y,huang s,yuan x,chen z,zhang h,li j. genome-wide association study for reproductive traits in a duroc pig population. animals,2019,9(10):732。