一种达巴万星关键中间体A40926各组分单体的分离纯化方法与流程

一种达巴万星关键中间体a40926各组分单体的分离纯化方法
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体为一种达巴万星关键中间体a40926各组分单体的分离纯化方法。


背景技术：

2.达巴万星是新型的第二代半合成糖肽类抗生素，其结构与万古霉素与替考拉宁相似，用于革兰氏阳性病原菌引起的严重感染，其是由a40926作为前体合成的。a40926是1984年科学家在培养分离来自土壤的马杜拉品系菌时年发现的一种糖肽类物质，2003年将其产生菌归类于野野村放线菌属，编号atcc39727。a40926有5个主要组份：pa、pb、a、b0和b1，b0和b1统称为b组份。达巴万星是菌产生的次级代谢产物a40926 b经过化学合成结构修饰后获得的，相较于万古霉素与替考拉宁具有更广泛的抗菌谱，其对葡萄球菌、链球菌、肠球菌以及甲氧西林耐药菌株在内的所有凝固酶阴性葡萄球菌均有效。
3.目前对a40926各组分单体的分离主要采用凝胶过滤、大孔吸附树脂结合反相色谱法。凝胶过滤层析，其载样体积小，对装柱要求高，较难实现工业化放大；反相柱色谱纯化，载样量低，流动相采用有机溶剂，成本较高且有环保污染及安全隐患。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种达巴万星关键中间体a40926各组分单体的分离纯化方法，具备单批次上样量大、效率高、污染小、成本低、操作安全和适合工业化生产等优点，解决了凝胶过滤、大孔吸附树脂结合反相色谱法载样体积小，对装柱要求高，载样量低，较难实现工业化放大，且成本较高，存在环保污染及安全隐患的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种达巴万星关键中间体a40926各组分单体的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：
8.第一步：将发酵液调节ph值，膜过滤以得到a40926的提取液；
9.第二步：将上述a40926提取液进行聚酰胺色谱纯化，等电点沉淀，获得膏状a40926半成品；
10.第三步：将上述半纯品溶解后，离子交换色谱纯化，等电点沉淀，乙醇脱水，真空干燥可获得高纯度a40926 b0等组分，其色谱纯度可达到99％以上。
11.优选的，所述发酵液碱提取后可以采用陶瓷膜过滤，也可以采用离心等方式进行固液分离。
12.优选的，所述陶瓷膜过滤方法为发酵液用碱调节ph值至9.0-14.0，陶瓷膜过滤，补充ph值至9.0-14.0的碱液1-10倍体积的发酵液，收集滤液。
13.优选的，所述滤液用酸调节ph值至7-9，洗脱溶剂为碱水或者尿素水溶液。
14.优选的，所述等电点沉淀为调节ph值至2.5-4.0，静置离心或过滤。
15.优选的，所述聚酰胺色谱分离可以采用大孔吸附树脂分离或凝胶过滤分离。
16.优选的，所述a40926半成品用碱水溶解或用酸水溶解。
17.优选的，所述离子交换剂采用阴离子交换剂或阳离子交换剂。
18.优选的，所述离子交换采用的洗脱剂为盐离子梯度洗脱液或ph值梯度洗脱液。
19.与现有技术相比，本发明提供了一种达巴万星关键中间体a40926各组分单体的分离纯化方法，具备以下有益效果：
20.1、该达巴万星关键中间体a40926各组分单体的分离纯化方法，通过采用陶瓷膜过滤发酵液，然后用聚酰胺色谱纯化等电点沉淀获得膏状半纯品，接着采取离子交换色谱纯化，等电点沉淀，然后使用乙醇脱水并真空干燥即可得到高纯度a40926 b0等组分，其中采用的设备均可以大规模处理样品，方便实现工业放大，且主要在水相完成，相比传统工艺更加安全环保。
21.2、该达巴万星关键中间体a40926各组分单体的分离纯化方法，通过样品处理主要在水相体系完成，相较于现有技术使用大量有机溶剂，其污染小，成本更低，操作安全，更适合工业化生产，且单批次上样量大，效率大大提高。
附图说明
22.图1为本发明分离纯化示意图；
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.请参阅图1，一种达巴万星关键中间体a40926各组分单体的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：
25.第一步：将发酵液调节ph值，膜过滤以得到a40926的提取液，发酵液碱提取后可以采用陶瓷膜过滤，也可以采用离心等方式进行固液分离，陶瓷膜过滤方法为发酵液用碱调节ph值至9.0-14.0，陶瓷膜过滤，补充ph值至9.0-14.0的碱液1-10倍体积的发酵液，收集滤液，滤液用酸调节ph值至7-9，洗脱溶剂为碱水或者尿素水溶液；
26.第二步：将上述a40926提取液进行聚酰胺色谱纯化，聚酰胺色谱分离可以采用大孔吸附树脂分离或凝胶过滤分离，等电点沉淀，等电点沉淀为调节ph值至2.5-4.0，静置离心或过滤，获得膏状a40926半成品，a40926半成品用碱水溶解或用酸水溶解；
27.第三步：将上述半纯品溶解后，离子交换色谱纯化，离子交换剂采用阴离子交换剂或阳离子交换剂，离子交换采用的洗脱剂为盐离子梯度洗脱液或ph值梯度洗脱液，等电点沉淀，乙醇脱水，真空干燥可获得高纯度a40926 b0等组分，其色谱纯度可达到99％以上。
28.实施例1
29.将35l发酵液，加入2mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至12.0，搅拌30min。取1ml样品离心取上清液进行hplc分析测定，a40926 b0组分有42.8g。将发酵液倒入陶瓷膜过滤设备(陶瓷膜孔径0.1um)，控制发酵液温度低于30℃进行过滤，当发酵液体积低于20l后，缓慢
加入180l的ph值为12.0的碱水维持发酵液体积在20l左右。将陶瓷膜过滤后的滤液用1mol/l的盐酸调节ph值至8.0，上样聚酰胺柱(15cm*70cm)，上样速度为4bv/hr，上样完成之后，分别用3bv纯水、5bv的1％氨水、5bv的2％氨水洗脱，合并含a40926洗脱液。洗脱液用1％盐酸调节ph值至3.5，静置1h，6000rpm离心15min，弃去上清液获得a40926膏状半成品227.3g。半成品加入5％氨水溶解，过滤。滤液上样至阴离子交换柱(10cm*50cm)，然后进行盐离子浓度梯度洗脱(0min，0.5％氨水
→
40min，0.5％氨水+2m nacl，流速为100ml/min，紫外检测器检测，分部收集目标馏分)。获得a40926 b0组分馏分700ml，a40926 b1组分馏分200ml，a40926 a组分馏分100ml。分别用盐酸调节ph至3.5，进行等电点沉淀，离心获得各组分膏状物。反复用0.2％氨水溶解，盐酸等电点沉淀4次，然后沉淀分别用无水乙醇350ml、100ml、50ml进行沉淀，沉淀真空干燥获得白色a40926 b0粉末22.3g，a40926 b1粉末3.1g，a40926 a粉末1.9g。
30.实施例2
31.将50l发酵液，加入氨水调节ph值至11.0，搅拌30min。取1ml样品离心取上清液进行hplc分析测定，a40926 b0组分有57.5g。将发酵液倒入陶瓷膜过滤设备(陶瓷膜孔径0.2um)，控制发酵液温度低于30℃进行过滤，当发酵液体积低于20l后，缓慢加入180l的ph值为11.0的碱水维持发酵液体积在20l左右。将陶瓷膜过滤后的滤液用1mol/l的硫酸调节ph值至7.0，上样聚酰胺柱(15cm*70cm)，上样速度为5bv/hr，上样完成之后，分别用3bv纯水、10bv的ph10的naoh水溶液、10bv的ph12的naoh水溶液洗脱。合并含a40926洗脱液。洗脱液用1％硫酸调节ph值至3.0，静置45min，6000rpm离心10min，弃去上清液获得a40926膏状半成品302.7g。半成品加入0.5％naoh水溶液溶解，过滤。滤液上样至阴离子交换柱(10cm*50cm)，然后进行盐离子浓度梯度洗脱(0min，25mm磷酸氢二钠水溶液
→
40min，25mm磷酸氢二钠水溶液+2m nacl，流速为100ml/min，紫外检测器检测，分部收集目标馏分)。获得a40926 b0组分馏分750ml，a40926 b1组分馏分220ml，a40926 a组分馏分100ml。分别用硫酸调节ph至3.0，进行等电点沉淀，离心获得各组分膏状物。反复用0.2％氨水溶解，盐酸等电点沉淀4次，然后沉淀分别用无水乙醇350ml、100ml、50ml进行沉淀，沉淀真空干燥获得白色a40926 b0粉末27.2g，a40926 b1粉末3.6g，a40926 a粉末2.3g。
32.实施例3
33.将45l发酵液，加入1mol/l的氢氧化钾溶液调节ph值至13.0，搅拌30min。取1ml样品离心取上清液进行hplc分析测定，a40926 b0组分有52.9g。将发酵液倒入陶瓷膜过滤设备(陶瓷膜孔径0.05um)，控制发酵液温度低于25℃进行过滤，当发酵液体积低于20l后，缓慢加入200l的ph值为13.0的碱水维持发酵液体积在20l左右。将陶瓷膜过滤后的滤液用1mol/l的磷酸调节ph值至7.0，上样聚酰胺柱(15cm*70cm)，上样速度为3bv/hr，上样完成之后，分别用3bv纯水、6bv的5％尿素水溶液、8bv的20％尿素水溶液洗脱。合并含a40926洗脱液。洗脱液用磷酸调节ph值至3.2，静置1h，6000rpm离心15min，弃去上清液获得a40926膏状半成品266.2g。半成品盐酸调节ph至1.5溶解，过滤。滤液上样至阴离子交换柱(10cm*50cm)，然后进行盐离子浓度梯度洗脱(0min，0.1％盐酸
→
40min，0.1％盐酸+2m nacl，流速为100ml/min，紫外检测器检测，分部收集目标馏分)。获得a40926 b0组分馏分1200ml，a40926 b1组分馏分280ml，a40926 a组分馏分140ml。分别用naoh溶液调节ph至3.5，进行等电点沉淀，离心获得各组分膏状物。反复用0.2％氨水溶解，盐酸等电点沉淀4次，然后沉淀
分别用无水乙醇350ml、100ml、50ml进行沉淀，沉淀真空干燥获得白色a40926 b0粉末26.3g，a40926 b1粉末3.5g，a40926 a粉末2.7g。
34.实施例4
35.将35l发酵液，加入2mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至12.0，搅拌30min。取1ml样品离心取上清液进行hplc分析测定，a40926 b0组分有44.9g。将发酵液倒入陶瓷膜过滤设备(陶瓷膜孔径0.1um)，控制发酵液温度低于30℃进行过滤，当发酵液体积低于20l后，缓慢加入180l的ph值为12.0的碱水维持发酵液体积在20l左右。将陶瓷膜过滤后的滤液用1mol/l的盐酸调节ph值至8.0，上样聚酰胺柱(15cm*70cm)，上样速度为4bv/hr，上样完成之后，分别用3bv纯水、5bv的1％氨水、5bv的2％氨水洗脱。合并含a40926洗脱液。洗脱液用1％盐酸调节ph值至3.5，静置1h，6000rpm离心15min，弃去上清液获得a40926膏状半成品234.1g。半成品加入5％氨水溶解，过滤。滤液上样至阴离子交换柱(10cm*50cm)，然后进行ph梯度洗脱(0min-10min，20mm ph为5.0的磷酸盐缓冲液洗脱；10.1min-20min，20mm ph为4.0的磷酸盐缓冲液洗脱；20.1min-30min，20mm ph为3.0的磷酸盐缓冲液洗脱；30.1min-40min，20mm ph为2.0的磷酸盐缓冲液洗脱；流速为100ml/min，紫外检测器检测，分部收集目标馏分)。获得a40926 b0组分馏分800ml，a40926b1组分馏分180ml，a40926 a组分馏分100ml。分别用naoh溶液调节ph至3.5，进行等电点沉淀，离心获得各组分膏状物。反复用0.2％氨水溶解，盐酸等电点沉淀4次，然后沉淀分别用无水乙醇350ml、100ml、50ml进行沉淀，沉淀真空干燥获得白色a40926 b0粉末18.38g，a40926 b1粉末1.8g，a40926 a粉末1.5g。
36.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。