白色链霉菌pd9-pld3及其在ε-聚赖氨酸生产中的应用的制作方法

白色链霉菌pd9-pld3及其在
ε-聚赖氨酸生产中的应用
技术领域
1.本发明涉及工业微生物技术领域，具体地说，是关于一株基因工程菌——白色链霉菌(streptomyces albulus)pd9-pld3及其在ε-聚赖氨酸生产中的应用。


背景技术：

2.ε-聚赖氨酸(ε-poly-l-lysine)是一种高效广谱的新型生物防腐剂，是由l-赖氨酸的α-羧基和ε-氨基连接形成的聚合物，一般含有25～35个赖氨酸残基，纯化成品为淡黄色粉末，易溶于水，吸湿性强，略有苦味。与其它防腐剂相比，ε-聚赖氨酸具有抑菌谱广、抑菌效率高、稳定性好、安全性高的特点。ε-聚赖氨酸对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有抑菌效果，对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用；在食品中的添加量少却高效；能适应较宽的ph范围，可以随食品一起灭菌，具有很高的热稳定性；ε-聚赖氨酸的用途十分广泛。在食品工业中，还可用作乳化剂、食疗剂；在医药行业中，可用作药物载体以及高吸水性的生物材料。
3.白色链霉菌(streptomyces albulus)是ε-聚赖氨酸的工业生产菌株，但白色链霉菌内同时还存在ε-聚赖氨酸降解酶(ε-poly-l-lysine degrading enzyme，pld)用以降解ε-聚赖氨酸，实现对细胞的自我保护。


技术实现要素：

4.本发明的目的就在于针对白色链霉菌(streptomyces albulus)在发酵生产ε-聚赖氨酸的过程中由于存在ε-聚赖氨酸降解酶而导致产量受限的问题，从而提供一种改造的基因工程菌，以提高ε-聚赖氨酸的产量，降低ε-聚赖氨酸降解酶的活性。
5.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.本发明的第一个方面，提供了一株高产ε-聚赖氨酸的基因工程菌——白色链霉菌 (streptomyces albulus)pd9-pld3，所述菌株的保藏号为cctcc m 20211549。
7.本发明的第二个方面，提供了所述白色链霉菌(streptomyces albulus)pd9-pld3 用于发酵生产ε-聚赖氨酸的应用。
8.根据本发明的优选实施例，所述发酵生产ε-聚赖氨酸的培养基为添加了caco3的m3g培养基。
9.优选的，所述caco3的添加量为0.2wt％～0.5wt％；更好的，所述caco3的加入量为0.5wt％。
10.本发明的第三个方面，提供了一种优化的发酵培养基，用于所述的白色链霉菌 (streptomyces albulus)pd9-pld3，所述培养基为添加了0.2wt％～0.5wt％的caco3的m3g培养基。
11.优选的，所述caco3的加入量为0.5wt％。
12.本发明具有以下有益效果：
13.1、本发明通过基因工程手段实现了对白色链霉菌(streptomyces albulus)内ε
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聚赖氨酸降解酶的抑制，构建了新的基因工程菌(streptomyces albulus)pd9-pld3。
14.2、本发明对摇瓶发酵白色链霉菌生产ε-聚赖氨酸的发酵培养基配方进行了优化，通过添加caco3来实现对摇瓶发酵过程中ph值的控制，增加摇瓶发酵的稳定性，ε
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聚赖氨酸产量获得了显著提高。
附图说明
15.图1为p152-dcas9-pld抑制质粒谱图。
16.图2为菌株构建抗性基因pcr验证图。
17.图3为ε-聚赖氨酸降解酶酶活测定图。
18.图4为摇瓶发酵优化图。
19.图5为基因工程菌pd9-pld3与出发菌nk660生产ε-聚赖氨酸能力比较图。
20.图6为基因工程菌pd9-pld3与出发菌nk660的ε-聚赖氨酸降解酶酶活的比较图。
21.本发明从白色链霉菌(streptomyces albulus)nk660衍生而来一株白色链霉菌菌株，分类命名为白色链霉菌(streptomyces albulus)pd9-pld3，已于2021年12月7 日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：cctcc no: m 20211549。保藏单位地址：中国武汉武汉大学。
具体实施方式
22.以下通过具体实施例对本发明做进一步地详细描述。应理解，所描述的实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。
23.以下实施例中使用到的培养基(其中的组分含量(％)为重量百分比含量)如下：
24.m3g培养基：葡萄糖5％，酵母粉0.5％，(nh4)2so
4 1％，k2hpo4·
3h2o 0.1048％， kh2po
4 0.136％，浓缩盐溶液(mgso4·
7h2o，feso4·
7h2o，znso4·
7h2o)100ml， ph6.8。葡萄糖单独灭菌。
25.ms培养基：2％甘氨酸，2％热榨黄豆饼粉，2％琼脂。
26.lb培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠。
27.tsb培养基：1.5％胰蛋白胨，0.5％大豆蛋白胨，0.5％氯化钠。
28.以下实施例中，构建基因工程菌的步骤所使用的实验材料，如内切酶、质粒、微生物菌株等，除特别说明的外，均可通过常规市售途径获得。实验过程中所涉及的操作也均为本技术领域的常规操作，可参考例如《分子克隆》等，或者按产品说明书操作。
29.实施例1、基因工程菌的构建
30.1、p152-dcas9抑制质粒的构建
31.将整合质粒pset152作为p152-dcas9抑制质粒的骨架，如图1所示，该质粒中 dcas9基因的表达由组成型强启动子erme*p驱动并由fd终止子终止；sgrna由来自大肠杆菌的启动子j23119转录，并由t0终止子终止。所述dcas9基因从cas9核酸酶衍生而来，分别在hnh域和ruvc域(d10a和h840a)发生点突变。
32.选取目的基因ε-聚赖氨酸降解酶(ε-poly-l-lysine degrading enzyme，pld)基因序列的668-688bp处作为pam位点的n20序列，序列为：
33.gggctgaccgcgttgatcac(seq in no:1)。
34.质粒构建引物设计如下：
35.pld-dcas9-pam3f：
36.cctaggtataatactagtgggctgaccgcgttgatcacgttttagagctagaaatagcaagt(seqinno:2)；
37.dcas9-r：tatgacatgattacgaattcgg(seqinno:3)。
38.利用hindiii和spei限制性酶切位点切割质粒，用上述引物获取带pam的目的片段后，利用clonexpressiionestep克隆试剂盒(vazymebiotechco.ltd.,nanjing,china)将目的基因片段克隆到质粒pset152上，得到抑制质粒p152-dcas9。
39.2、基因工程菌的构建
40.利用接合转移进行种间遗传转化：将构建的p152-dcas9抑制质粒转化至穿梭菌大肠杆菌et12567中，利用该菌株进行与白色链霉菌的接合转移，具体步骤如下：
41.s1：在接合转移操作的前一天，挑取包含p152-dcas9抑制质粒的穿梭菌大肠杆菌et12567单菌落，于含50μg/ml卡那霉素、50μg/ml氯霉素和50μg/ml安普霉素的lb液体培养基中，于37℃、220rpm摇床过夜培养；然后吸取500ul细菌培养液，转移到25ml/250mllb液体中继续培养约4-6h，至od值0.4-0.6，于50ml离心管，4℃、8000rpm冷冻离心机离心，收集菌体，再用相同体积的lb液体分别洗涤两次除去抗生素，获得供体菌细胞。
42.s2：取长好的白色链霉菌(streptomycesalbulus)nk660新鲜斜面，接种到50ml/250mltsb液体培养基中，于28℃、220rpm摇床震荡培养24h，得到一级种子液；取1％的一级种子液接种到二级tsb培养基中，相同条件下继续培养24h，于50ml离心管，4℃、8000rpm冷冻离心机离心收集菌体，再用相同体积的lb液体分别洗涤两次，获得感受态的宿主菌细胞。
43.s3：将含有p152-dcas9抑制质粒的供体菌(大肠杆菌et12567)和受体菌(白色链霉菌nk660)分别用2mllb稀释后按1:1混合，各取200ul混合液均匀地涂布到ms培养基平板上，于28℃恒温培养箱中培养18-20h，然后取出，给培养基覆盖5-10mm的apr和萘啶酮酸钠，在30℃继续培养2-3天，待培养基上长出结合子。
44.3、基因工程菌的验证
45.接合转移操作结束后，对培养基上长出的结合子进行构建菌株的筛选验证，具体如下：
46.首先挑取培养基上生长出来的单菌落，在含100μg/ml安普拉霉素apr的ms培养基上划线验证，初步筛选掉因链霉菌自身抗性原因而导致的假阳性。
47.经30℃培养2-3天后，待抗性板上生长出单克隆，即可进行pcr验证。利用如下引物对质粒上apr抗性基因进行pcr，来验证质粒是否成功进入菌株内。
48.aprf：gtgcaatacgaatggcgaaaagc(seqinno:4)；
49.aprr：gccaatcgactggcgagc(seqinno:5)。
50.pcr扩增产物通过测序验证，结果如图2所示，在1000bp位置有条带，显示p152-dcas9抑制质粒已成功转入白色链霉菌中，获得的基因工程菌命名为白色链霉菌(streptomycesalbulus)pd9-pld3，该基因工程菌已于2021年12月7日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：cctccm20211549。
51.为验证本发明获得的基因工程菌(streptomycesalbulus)pd9-pld3的传代稳定性，我们同时对传三代后的工程菌进行pcr验证，结果同样显示在图2中，可知本发明获得的
的ε-聚赖氨酸产量达到0.933g/l，是出发菌(streptomyces albulus)nk660的1.67 倍。
66.图6的结果显示，在96小时的摇瓶发酵过程中，基因工程菌(streptomyces albulus) pd9-pld3的ε-聚赖氨酸降解酶pld酶活相比出发菌(streptomyces albulus)nk660降低了约20.7％，从而有利于产物ε-聚赖氨酸的积累。