抗菌肽NZX在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用

抗菌肽nzx在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及抗菌肽nzx在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用。


背景技术：

2.无乳链球菌(streptococcus.agalactiae)是一种人畜共患病的病原体，不仅可诱发孕妇阴道感染、新生儿败血症和脑膜炎、奶牛乳腺炎，还可诱发鱼类链球菌病，是罗非鱼链球菌病的主要致病菌之一。罗非鱼链球菌病以败血症、脑膜脑炎和眼球突出为特征，发病率和死亡率非常高，其对罗非鱼产业的经济影响超过10亿美元，是全球罗非鱼养殖的一大障碍。常规治疗手段抗生素的滥用带来的耐药性越来越普遍，在最新的研究中，无乳链球菌对大环内酯类药物、四环素)、青霉素g产生高水平耐药，疫苗作为新兴防控手段，其研发的时间成本和应用成本限制了其大规模的应用，因此，开发对无乳链球菌具有高杀菌活性和低耐药性的新型抗菌药物势在必行。
3.抗菌肽(amps)是一类具有抗菌活性的天然小分子，因其广谱抗菌、低毒性和低耐药的特征，成为替抗候选药物中的热点之一，plectasin是从腐生子囊菌 pseudoplectania nigrella中分离出来的第一例防御素类阳离子抗菌肽，对革兰氏阳性细菌(如金黄色葡萄球菌、链球菌)具有强大的活性，通过对plectasin的d9、m13和k32 三个位点进行突变，得到了抗菌活性更好的衍生肽nzx，并在毕赤酵母x-33中建立了高表达量系统。该肽对急性结核分枝杆菌的体外和体内(小鼠感染模型)抗菌活性均优于利福平。尚未见nzx对无乳链球菌抗菌方面的研究报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供提供抗菌肽nzx在抑制无乳链球菌方面的新用途。
5.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种抗菌肽nzx在制备无乳链球菌(streptococcus.agalactiae)抗菌药物或组合物中的应用。
6.本发明中，抗菌肽nzx包含如下的氨基酸序列或由其组成：
7.i)seq id no:1所示的氨基酸序列；或
8.ii)在i)的n端和/或c端连接标签得到的氨基酸序列。
9.第二方面，本发明提供抗菌肽nzx在制备治疗或预防无乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。
10.第三方面，本发明提供抗菌肽nzx在治疗或预防无乳链球菌感染，以及治疗或预防由其感染所致相关疾病中的应用。
11.所述疾病是指由无乳链球菌及其产生的生物膜所导致的相关疾病，如链球菌病 (罗非鱼链球菌病)。
12.第四方面，本发明提供抗菌肽nzx在抑制无乳链球菌引起的生物膜方面的应用，包括对初期生物膜的抑制作用，
13.本发明中，无乳链球菌可以是从患链球菌病的罗非鱼体内分离获得的临床菌株，也可以是标准株。
14.所述无乳链球菌包括但不限于如下菌株：accc 61733、atcc 13813、cau-fri 1、cau-fri 2、cau-fri 3、cau-fri 4、pbsa0903。
15.第五方面，本发明提供抗菌肽nzx在制备停乳链球菌(streptococcus dysgalactiae) 抗菌药物或组合物中的应用。
16.第六方面，本发明提供抗菌肽nzx在制备治疗或预防停乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。
17.第七方面，本发明提供抗菌肽nzx在治疗或预防停乳链球菌感染，以及治疗或预防由其感染所致相关疾病中的应用。
18.所述疾病是指由停乳链球菌及其产生的生物膜所导致的相关疾病，如奶牛乳房炎。
19.所述停乳链球菌包括但不限于菌株cvcc 3938。
20.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
21.本发明首次发现抗菌肽nzx对无乳链球菌具有抑制作用。实验表明，nzx对无乳链球菌具有高效、快速杀菌、低耐药的作用。抗菌肽nzx对无乳链球菌的抗菌活性和杀菌速率明显优于氟苯尼考(ff)，nzx显示出了对s.agalactiae accc 61733更好的抗菌活性，mic值为0.11μm，远低于ff的5.59μm，nzx的mpc(mutantprevention concentration)为1.82μm，选择指数si为16，均低于ff，表明nzx的预防耐药能力低于后者，此外在256
×
mic下的溶血率仅为0.71％，在与25％血清和血浆共孵育60min 后，nzx分别保留97.8％和98.9％的活性。nzx显示出成为治疗由无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病新型制剂的潜力。
附图说明
22.图1为本发明较佳实施例中nzx对无乳链球菌accc 61733杀菌动力学曲线。
23.图2为本发明较佳实施例中抗菌肽nzx对罗非鱼红细胞的溶血性测定结果。
24.图3为本发明较佳实施例中抗菌肽nzx在罗非鱼血清中的稳定性。
25.图4为本发明较佳实施例中抗菌肽nzx在罗非鱼血浆中的稳定性。
26.图5为本发明较佳实施例中nzx对无乳链球菌accc 61733早期生物膜形成的影响。
27.图6为本发明较佳实施例中nzx对无乳链球菌accc 61733细胞膜完整性的影响。
28.图7为本发明较佳实施例中扫描电镜观察nzx对无乳链球菌accc 61733的细胞形态的影响。
29.图8为本发明较佳实施例中孵育环境对nzx杀菌能力的影响。
30.图9为本发明较佳实施例中超分辨显微镜观察抗菌肽nzx在无乳链球菌accc 61733中的定位。
具体实施方式
31.本发明提供真菌防御素plectasin的一种衍生肽—nzx，在杀灭无乳链球菌(如临床分离菌株无乳链球菌accc 61733)中的应用。以抗菌肽nzx为研究对象，以无乳链球菌为指示菌，检测了它的抗菌活性、血清/血浆稳定性、溶血性以及抑制初级生物膜的能力。并通
过使用流式细胞仪分析细胞膜完整性；扫描电镜观察nzx作用下的细菌形态变化；分辨显微镜观察nzx在细胞中的定位等阐明了其作用机制和靶点。实验表明，nzx对无乳链球菌具有高效、快速杀菌、低耐药的作用。nzx的作用机制为通过抑制细菌细胞壁合成来杀灭细菌；在64
×
mic浓度下，对初期生物膜的抑制率为 49.0％；在256
×
mic下的溶血率仅为0.71％；在与25％血清和血浆共孵育60min后，nzx 分别保留97.8％和98.9％的活性。
32.本发明的抗菌肽nzx对无乳链球菌的抗菌活性和杀菌速率优于氟苯尼考，溶血率较低，血浆和血清稳定性较高，具备独特的靶向细胞壁的杀菌机制，对无乳链球菌具有较强的体外杀菌作用且具有快速杀菌、无反弹、耐药能力强的杀菌特点。nzx有望被开发成为治疗由无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病的新型制剂。
33.本发明采用如下技术方案：
34.本发明提供抗菌肽nzx在制备无乳链球菌抗菌药物中的应用。
35.本发明还提供抗菌肽nzx在制备治疗或预防无乳链球菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。
36.进一步地，所述疾病是指由无乳链球菌所导致的相关疾病。
37.所述疾病包括罗非鱼链球菌病。
38.本发明还提供抗菌肽nzx抑制无乳链球菌的原理。
39.本发明还提供抗菌肽nzx在抑制无乳链球菌引起的生物膜方面的应用，包括对初期生物膜的抑制作用。
40.本发明中，无乳链球菌可以是从患链球菌病的罗非鱼体内分离获得的临床菌株，也可以是标准株，如atcc 13813。
41.以下实施例中使用的菌株、培养基及主要仪器如下：
42.无乳链球菌(s.agalactiae)accc 61733来自中国水产科学研究院南海渔业研究所，保存于中国农业培养物保藏中心(accc)。s.agalactiae atcc 13813购自美国菌种保藏中心(atcc)。从牛乳腺炎组织中分离的s.agalactiae cau-fri 1、cau-fri 2、 cau-fri 3和cau-fri 4来自中国农业大学。从罗非鱼中分离得到的s.agalactiaepbsa0903，来自海南大学。停乳链球菌cvcc 3938购自中国兽医培养物保藏中心 (cvcc)。
43.抗菌肽nzx由中国农业科学院饲料研究所基因工程室经毕赤酵母重组表达制备，纯度＞95％。使用的所有其他化学试剂均为分析级。
44.胰蛋白胨大豆琼脂(tsa)培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(tsb)培养基购自北京奥博星生物科技有限公司；氟苯尼考(ff)购自中国兽医药品监察所；其它试剂均属于国产分析纯级别。高速冷冻台式离心机(sigma 3k15)购自sigma公司；全温振荡培养箱(zhwy-211d)购自上海精宏实验设备有限公司；超净工作台(swcj-2fd)购自苏净集团设备有限公司；facs alibur流式细胞仪购自bd公司；扫描电镜(quanta 2100pro)购自于荷兰philips公司；超分辨显微镜(n-sims)购自日本nikon公司。
45.抗菌肽lf5的氨基酸序列为：fkafrwawrwkklaaps。
46.抗菌肽n2的氨基酸序列为：afcwnvcvyrnavrvchrrcn。
47.实施例1抗菌肽nzx、lf5、n2对s.agalactiae最小抑菌浓度的测定
48.选用微量肉汤稀释法测定nzx对病原菌的抑菌活性。处于指数期的s.agalactiae 菌液制备用培养基稀释成浓度为1
×
105cfu/ml的菌悬液，用0.01mol/l pbs(ph 7.4) 溶解
后的抗菌肽nzx、lf5、n2和抗生素对照氟苯尼考(ff)粉末按2倍梯度浓度配置成0.0625-128μg/ml的肽溶液；按照1:9的体积比在96孔板中分别加入肽溶液和菌悬液，然后置于37℃培养箱中无菌培养18-24h，空白对照、阳性对照、阴性对照分别为无菌tsb肉汤、ff和pbs，每个浓度设3个重复，以肉眼看不到浑浊的最小药物浓度为mic数值。结果如表1所示：
49.表1 nzx对细菌的mic值
[0050][0051][0052]
实施例2抗菌肽nzx对s.agalactiae accc 61733最低预防耐药抑菌浓度(mpc) 的测定
[0053]
在mic的基础上，将nzx肽溶液与灭菌后的固体培养基tsa混合后2倍梯度配制药物平板，药物终浓度从1
×
mic到64
×
mic，对数生长期的s.agalactiae accc 61733 菌液浓度浓缩至3.0
×
10
10
cfu/ml。吸取100μl菌液涂布在上述倍比浓度的nzx药物平板上。并于37℃恒温孵育。以72h不出现菌落生长的最低药物浓度为mpc。结果如表2所示。mpc与mic的比值(selection index)si，反映了抗菌药物限制耐药突变株选择的能力，si值越低预防耐药的能力越强，nzx的选择指数为16，ff》64，说明 nzx的预防耐药突变能力大于ff。
[0054]
表2 nzx对s.agalactiae accc61733的mpc和si值
[0055][0056]
实施例3抗菌肽nzx对s.agalactiae accc 61733的杀菌动力学曲线
[0057]
将处于对数生长期的s.agalactiae accc 61733稀释成1
×
105cfu/ml的菌悬液，然后与终浓度为1
×
、2
×
、4
×
mic的nzx溶液在37℃(250rpm)下混合培养，pbs作为空白对照，2
×
mic ff作为阳性对照,在不同的时间点(0、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、 12、22、24h)取100μl细菌样本，最后用固体培养基tsa进行计数，并绘制nzx的时间杀菌曲线。结果如图1所
示，nzx的杀菌速率均呈浓度依赖性，并且nzx对s. agalactiae accc 61733杀菌速率高于ff，1
×
mic～4
×
mic的nzx在1-2h内下对病原菌的杀菌率为99％，且不发生反弹，而1
×
mic的ff对s.agalactiae accc 61733仅能发挥抑制作用，在2
×
mic下到6h才能达到99％的杀灭率，nzx比ff具显著的杀菌速率和杀菌效果优势。
[0058]
实施例4抗菌肽nzx对罗非鱼红细胞的溶血性试验
[0059]
健康罗非鱼尾静脉取血，抗凝管收集全血并轻轻摇晃，在1500rpm、4℃条件下离心5min，用0.9％生理盐水轻轻洗涤红细胞三次，直至上清无色透明，用生理盐水稀释成红细胞浓度为8％的悬浮液，抗菌肽nzx溶解于0.01m pbs(ph7.4)中，配置成2-512μg/ml的肽溶液，将红细胞悬浮液与不同浓度的肽溶液各取100μl混合后加入 96孔板，生理盐水和0.1％triton x-100分别作为空白对照和100％溶血的阳性对照，在 37℃条件下孵育1h，然后在4℃、1500rpm条件下离心5min，取上清至96孔板中，使用酶标仪在540nm下检测紫外吸光值。溶血率计算公式为：
[0060]
溶血率(％)＝[(abs540nm
nzx
－abs540nm
生理盐水
)/(abs540nm0.1％
triton x-100
－abs540nm
生理盐水
)]
×
100％
[0061]
结果如图2所示，浓度在1～256μg/ml范围内的nzx对血红细胞几乎没有溶血作用；当肽浓度达到256μg/ml时，其溶血率仅为为0.72％，这说明抗菌肽nzx几乎没有溶血性，作为腹腔和静脉注射药物使用是相对安全的。
[0062]
实施例5抗菌肽nzx在罗非鱼血清和血浆中的稳定性
[0063]
罗非鱼尾静脉取血，抗凝管/促凝管收集全血并轻轻摇晃，在1500rpm、4℃条件下离心5min，分别获得罗非鱼血清和血浆，用0.01m pbs将nzx制备成浓度为200 μg/ml的肽溶液，将血清和血浆稀释至浓度为50％，然后将50％血清/血浆与肽溶液等体积混合，制备成血清血浆终浓度为25％、nzx终浓度为100μg/ml的混合溶液，并在37℃下孵育。将对数期的s.agalactiae accc 61733加入灭菌后的mha固体培养基制备成终浓度为1
×
106cfu/ml的平板，在不同的时间点，取30μl混合液悬滴至制备好的mha平板上，37℃下培养16-24h，测定抑菌圈直径。以pbs制备的nzx(100 μg/ml)为阳性对照，25％血清/血浆为阴性对照。结果如图3、图4所示，nzx与25％血清和血浆共孵育60min后，nzx对s.agalactiae accc 61733分别保留97.8％和98.9％的活性，表明nzx在罗非鱼血清和血浆中具较高的稳定性。
[0064]
实施例6抗菌肽nzx对s.agalactiae accc 61733初级生物膜影响的测定
[0065]
将对数生长期的s.agalactiae稀释至浓度为1
×
108cfu/ml，取180μl加入96孔板中进行培养，随后加入2倍梯度稀释的nzx和ff，使之终浓度分别为0.25、0.5、1、2、 4和8
×
mic。pbs作为阴性对照，空白培养基作为空白对照。37℃培养24h后，小心吸取孔中上清，并用pbs柔洗3次，自然风干。风干后用结晶紫染色法测定每孔生物膜含量结果如图5所示，用8
×
mic nzx处理24h后，s.agalactiae的初生膜降低到 0.23％，8
×
mic ff处理24h后，s.agalactiae的初生膜降低到32.5％，表明nzx抑制早期膜形成的能力高于ff，这表明nzx能够明显地抑制无乳链球菌初生膜的形成。
[0066]
实施例7抗菌肽p2对s.agalactiae accc 61733细胞膜完整性分析
[0067]
将对数生长期的s.agalactiae用tsb液体培养基稀释至od
600
＝1(约1
×
10
8 cfu/ml)，加入nzx至终浓度为1
×
mic、2
×
mic、4
×
mic，在37℃条件下分别孵育 30min和2h，ff作为阳性对照，pbs作为阴性对照，孵育后的样品4000rpm离心5min，弃上清；加入pbs反复柔洗
3次，最后一次加入0.22μm过滤的pbs重悬，上流式细胞仪前加入终浓度为50μg/ml碘化丙啶(propidium iodide，pi)染液，室温静置孵育15 min，最后上机检测。结果如图6所示，2
×
mic的nisin处理s.agalactiae后，pi对细胞膜穿透为97.3％，而经pbs、4
×
mic ff、4
×
mic nzx处理的s.agalactiae accc 61733 细胞内pi信号均在1％左右，表明细菌细胞质膜完整，pi几乎未进入细菌内部。说明 nzx对无乳链球菌细胞膜无穿透作用其杀菌机制为非破膜机制。
[0068]
实施例8抗菌肽nzx对s.agalactiae accc 61733细胞形态的影响
[0069]
将对数生长期的s.agalactiae用tsb液体培养基稀释至1
×
108cfu/ml，加入终浓度为4
×
mic的nzx，等体积pbs作为为空白对照，ff作为阳性对照，37℃条件下孵育2h，孵育后的样品4000rpm离心5min，弃上清；用0.01mol/l pbs轻洗菌体三次，弃尽上清后缓慢加入0.01mol/l pbs配置的2.5％的戊二醛缓冲液，重悬菌体，4℃放置固定，时间大于2h。固定后依次用50％-70％-85％-95％(2次)-100％乙醇梯度脱水漂洗，每次15min，脱水后样品经过临界点干燥仪干燥，然后用离子溅射仪使样品表面镀膜，最后用s-4800型扫描电子显微镜进行观察。
[0070]
如图7所示，未经处理的s.agalactiae accc 61733细胞形态表面饱满且光滑，无内容物泄出与形态变化。无乳链球菌在ff作用下，细胞表面肿胀变形，细胞表面出现一些丝状粘连，细胞不能正常分裂，而nzx处理后，细菌除数量减少外，细胞形态无明显变化，说明nzx的杀菌靶点不在胞内。
[0071]
实施例9孵育环境对抗菌肽nzx杀菌能力的影响
[0072]
将对数生长期的s.agalactiae accc 61733分别用pbs和tsb培养基稀释至(1
×
10
6 cfu/ml)，加入终浓度为4
×
mic的nzx、氟苯尼考、青霉素、庆大霉素、链霉素、乳链菌肽，37℃条件下孵育2h，孵育结束后取样品100μl在tsa平板上进行菌落计数。
[0073]
结果如图8所示，庆大霉素、链霉素和乳链菌肽等具有非细胞壁靶向机制的杀菌活性，它们在pbs和tsb中表现出相似的杀菌能力。由nzx处理的s.agalactiae accc 61733悬浮于pbs环境中时，细菌数量几乎没有变化。而nzx处理的无乳链球菌细胞在tsb环境中时，其杀菌能力显显著提高，菌落数较ck组显着减少5.6log10。结果与靶向细胞壁的青霉素处理组相似(在tsb环境中减少3.93log10)。说明nzx的作用靶点可能为细胞壁。
[0074]
实施例10抗菌肽nzx在无乳链球菌accc 61733中的定位
[0075]
对数期s.agalactiae accc 61733稀释至1
×
108cfu/ml，在37℃下与4
×
micfitc-nzx共孵育30min，然后在pbs(0.01m,ph 7.4)中洗涤两次，再用10μg/ml dapi 和pi在4℃下染色15min，继续洗涤2次，pbs重悬。将5μl样品和2μl防荧光淬灭剂加入到多聚tm显微镜载玻片上，并用盖玻片密封，最后用n-sims(超分辨显微镜) 观察，未加fitc-肽处理的细胞作为空白对照。如图9所示，在对照组中仅检测到源自细胞核的蓝色荧光(dapi)。用fitc-nzx处理后，绿色荧光位于分裂子细胞的细胞壁上。这表明nzx可以与分裂细胞的细胞壁结合阻止其继续分裂，细胞壁是nzx的主要杀菌靶点。
[0076]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0077]
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