一种源于米曲霉菌制备高F值低聚肽的特异性羧肽酶

一种源于米曲霉菌制备高f值低聚肽的特异性羧肽酶
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一种源于米曲霉用于制备高f值低聚肽的羧肽酶及其工程菌。


背景技术：

2.米曲霉（aspergillus oryzae）是一种安全的丝状真菌，虽然米曲霉和黄曲霉同属黄绿曲霉菌属，但米曲霉不同于黄曲霉。它不产黄曲霉毒素，其在食品工业的长期使用证明了它的安全性。米曲霉（aspergillus oryzae）分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处，是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。它在豆豉、酱油、传统豆制品发酵以及酿酒工业中有着悠久的应用历史，是美国食品药品管理局（fda）于1989年公布的40种安全的酿造菌株之一。目前酿酒酵母中的丝氨酸羧肽酶研究最为广泛。而本序列通过ncbi同源比对，发现其源于米曲霉rib40丝氨酸羧肽酶。
3.现代营养学研究发现，人体摄入蛋白质经消化酶作用后，不仅以氨基酸形式吸收，大多数情况是以小分子肽的形式吸收，而低聚肽比游离氨基酸吸收更快，这表明低聚肽的生物价值与营养效用更高。那么高f值寡肽是一种由2-10个氨基酸组成，支链氨基酸（bcaa）与芳香族氨基酸（aaa）含量的摩尔数比值大于20的短肽。同时高f值寡肽是一种功能性寡肽，如高f值寡肽具有抗疲劳、抗氧化、防衰老的功效以及对预防高血压和肝修复作用。与酸或碱水解相比，酶水解法具有工艺条件温和，很少或没有不良副反应或产物，终产物经中和后含盐量较少，并可通过选择特定酶和反应因子来控制终产物功能性等优点，因此采用酶法制备生物活性肽。常以动植物来源的蛋白质为底物，利用蛋白酶在适宜的条件下将其水解，经分离纯化获得生物活性肽的过程。而使用酶法制备高f值低聚肽的过程中，存在酶切特异性较差，酶组合较多等问题。因此迫切需要使用对芳香族氨基酸具有一定特异性的肽酶，以有效切除芳香族氨基酸，提高产物的f值。采用蛋白酶水解制备低聚肽的成本较低，尤其在酶解一些粮油加工副产品时可以有效的提高产品的价值，具有很大的发展前景。


技术实现要素：

4.针对酶法制备高f值低聚肽时存在的问题，本发明提供一种源于米曲霉的高产特异性功能低聚肽的对芳香族氨基酸有特异性的丝氨酸羧肽酶和工程菌，能高效获得高f值低聚肽。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
6.一种羧肽酶，其氨基酸序列如seq id no: 1所示，所述羧肽酶来源于米曲霉菌（aspergillus oryzae）m30011，保藏编号为cgmcc no.12371。
7.一种上述羧肽酶的突变体，其氨基酸序列如seq id no: 2-4任一所示；其中，seq id no: 2为seq id no: 1所示序列第271位的酪氨酸突变为精氨酸；seq id no: 3为seq id no: 1所示序列第464位的异亮氨酸突变为甘氨酸；
seqidno:4为seqidno:1所示序列第517位的甲硫氨酸突变为精氨酸。
8.一种上述羧肽酶的编码核苷酸。
9.一种包含上述编码核苷酸的质粒或工程菌；优选地，所述工程菌选自大肠杆菌。
10.一种上述工程菌在制备羧肽酶中的应用。
11.一种上述羧肽酶在制备高f值低聚肽中的应用。
12.本发明具有以下优点：本发明提供了一种基因改造的羧肽酶及生产该酶的工程菌。通过对特殊位点的改造，提高了羧肽酶切除多肽底物中芳香族氨基酸的效率，能够有利于提高产品f值，降低酶法生产成本，减少后期纯化过程中的能耗，降低环境污染，实现高效制备高f值低聚肽的工业化生产应用。
13.生物保藏信息米曲霉（aspergillusoryzae）m30011，于2016年04月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏地址为中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.12371。
附图说明
14.图1为cpy基因pcr产物凝胶电泳图片；图2为双酶切pcoldtf载体线性化凝胶电泳图片；图3为重组质粒转化dh5α感受态细胞的凝胶电泳图片；图4为pcoldtf-cpy重组质粒图谱；图5为重组质粒转化bl21（de3）感受态细胞的凝胶电泳图片；图6为cpy酶粗酶液sds-page电泳图；图7为构建突变体过程中的琼脂糖电泳图；图8为原酶及其突变酶的粗酶液sds-page图（1泳道为原酶，2、3泳道为y271r，4、5泳道为i464g，6、7泳道为m517r）；图9为纯化后原酶的sds-page电泳图（1、2泳道为粗酶液，3、4泳道为50mm咪唑，5、6、7泳道为100mm咪唑，8、9、10、11泳道为200mm咪唑）；图10为纯化后突变酶sds-page电泳图；图11为不同酶组合处理得到低聚肽的f值。
具体实施方式
15.下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
16.实施例1m30011菌株cpy基因克隆和表达按照cn106190857a中的方法将菌株m30011接种于液体发酵培养基中，在30℃，200r/min培养48h后，用灭菌后的滤纸收集菌体细胞，尽量减少残留的培养基，液氮预冷研磨。试剂盒提取总rna（a260/a280比值为1.95）并合成cdna。
17.设计并合成表1所示引物，进行pcr扩增，建立反应体系：10
×
taqbuffer10μl，dntp(10mm)2.5μl，引物cpy-ecori-f2μl，引物cpy-xbai-r2μl，taq（5u/μl）1μl，目的基因
2μl，双蒸水补至50μl。pcr扩增条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，62.5℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min。
18.表1带酶切位点cpy基因克隆引物序列产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示：产物大小约1600bp，符合预期，目的条带利用胶回收试剂盒进行胶回收并测序，证明得到的目的片段为带酶切位点的cpy基因。以ecori和xbai双酶切后纯化获得cpy基因，核苷酸序列如seqidno:7所示。
19.提取pcoldtf载体的质粒，以ecori和xbai双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳（图2），然后回收线性质粒。然后将cpy基因和线性质粒进行连接，按下述反应体系37℃反应30min，降至4℃或立即置于冰上冷却。反应体系如下：5
×
ceiibuffer4μl，exnaseii2μl，pcoldtf载体3.3μl（35ng/μl），cpy基因1.3μl（48.1ng/μl），双蒸水补至20μl。
20.将上述步骤获得的质粒42℃，60s分别热激导入e.colidh5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗生素lb平板，37℃培养12-16h，挑取单菌落生长后，用表2中的cpy基因特异性引物进行菌落pcr扩增，筛选阳性克隆。
21.表2pcr扩增cpy基因特异性引物序列pcr扩增条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，61.4℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，得到一段大小约为1600bp的片段，琼脂糖电泳检测如图3所示。产物进行测序，并在ncbi网站上进行比对，验证正确的重组质粒命名为pcoldtf-cpy，重组质粒pcoldtf-cpy谱图如图4所示。
22.从阳性克隆子中提取质粒，42℃，60s热激导入bl21（de3）感受态细胞，涂板37℃培养12-16h后挑菌以表2中引物以相同条件进行pcr验证，产物琼脂糖电泳检测如图5所示，得到一段大小约为1600bp的片段，测序正确，说明获得了阳性转化子。
23.挑取验证成功的转化子在50ml氨苄抗性液体lb培养基中以1%的接种量转接活化后的菌液，达到扩大培养的目的，以37℃，200r/min的条件将其od
600
培养至0.6-0.8之间。之后添加iptg至发酵液中使得其终浓度为1.0mm，在20℃，200r/min的条件下继续振荡培养16h，诱导产酶。
24.在4℃，10000
×
g条件下离心10min，弃去上清收集得到菌体，用10ml0.2m，ph7.5的磷酸盐缓冲液（pbs）重悬菌体，之后对重悬菌体进行冰浴超声破壁，超声条件为60w，超声10s，停5s，共工作30min。4℃、8000
×
g离心10min后保留上清即得粗酶液。经sds-page电泳验证是否表达目的蛋白。通过考马斯亮兰染色显示蛋白带，将marker与样品在同一条件下进行电泳，以作为参考。sds-page凝胶电泳图如图6所示。根据氨基酸序列seqidno:1计算的目的蛋白的分子量为59.5kda，从图中可以看出在63kda附近有一条明显的蛋白积累，表明成功诱导表达得到了重组蛋白酶。
25.实施例2m30011cpy突变体的构建选择目的蛋白的271tyr、464ile、517met为突变位点，以实施例1中的pcoldtf-cpy质粒为突变模板，采用重叠延伸pcr的方法进行两轮pcr定点突变，以表3中序列为引物。
26.表3重叠延伸pcr引物第一轮pcr以构建成功的pcoldtf-cpy质粒为模板，以pcoldtf-f，y271g/i464g/m517r-r和y271g/i464g/m517r-f，pcoldtf-r为引物分别进行pcr得到包含突变位点的前段和后段序列，如图7所示。第二轮pcr以第一轮pcr得到的前段和后段产物为模板，以pcoldtf-f，pcoldtf-r为引物进行pcr得到突变体的全序列。各步pcr完成后对pcr产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收。
27.按照实施例1中的方法分别构建重组质粒pcoldtf-cpy-y271r、pcoldtf-cpy-i464g和pcoldtf-cpy-m517r，然后热激转化bl21（de3），阳性转化子诱导产酶，粗酶液的sds-page凝胶电泳图如图8所示，从图中可以看出在60kda附近有一条明显的蛋白积累。表明成功诱导表达得到了重组蛋白酶，突变体的氨基酸序列如seqidno:2-4所示。
28.将粗酶液使用ni柱进行纯化，使用平衡缓冲液进行淋洗使a
280
《0.05，把杂蛋白洗脱掉，然后依次选用50mm、100mm、200mm、300mm不同浓度的咪唑洗脱液进行洗脱收集。选择各咪唑浓度下洗脱得到的样品进行sds-page电泳以最终选定用于洗脱杂蛋白和单一的目的蛋白的洗脱液中咪唑的含量。在野生型纯化预实验中，选择各咪唑浓度下洗脱得到的样品进行sds-page电泳，结果如图9。用平衡缓冲液，洗脱的大多为杂蛋白，而用200mm咪唑浓度条件下，得到目的蛋白，蛋白条带积累最明显，基本洗脱了杂蛋白。3个突变体纯化时选用200mm咪唑浓度洗脱目的蛋白，其sds-page电泳如图10。收集液保存在4℃备用。
29.实施例3m30011cpy及其突变型对芳香氨基酸的特异性切割以不同长度的多肽：三肽（n-cbz-gly-gly-phe）、三肽（n-cbz-gly-phe-phe）和五肽（phe-gly-leu-gly-phe）分别为底物，测定cpy蛋白及3个突变体对芳香氨基酸进行特异性切割制备高f值寡肽的酶活，用荧光高效液相色谱法测定样品中游离苯丙氨酸的含量。酶活性单位定义为在反应条件下，每分钟产生1μg末端氨基酸的所需酶量（mg）。
30.构建500μl反应体系，将30μl的多肽底物（1mg/ml）加入5μg纯化酶，然后加入ph7.5，0.2mpbs缓冲液预热至40℃，40℃水浴条件下反应20min后，煮沸5min。对照品中以pbs缓冲液（ph7.5，0.2m）替代粗酶液做同样的处理。反应后的反应液分别用opa柱前衍生法处理样品后进行荧光高效液相分析。
31.表4m30011cpy及其突变型对不同多肽的酶活（u/mg）表4显示了原酶和突变体对于不同长度的肽底物的酶活，突变酶m517r对各肽底物的活性均显著高于其他突变酶原酶。对于n-cbz-gly-gly-phe和phe-gly-leu-gly-phe，突变体y271r和i464g显著高于原酶的活性。原酶对三肽底物n-cbz-gly-phe-phe的活性比三肽底物n-cbz-gly-gly-phe的活性高。
32.实施例4胰凝乳蛋白酶突变酶p308r的制备通过化学合成法合成目的基因chy1，核苷酸序列如seqidno:18所示，分析目的基因和载体质粒pcoldtf的多克隆位点上的限制性核酸内切酶识别位点，选择了两个酶切位点ndei和hindiii，设计引物引入这两个酶切位点，引物序列分别为chy1-f和chy1-r，如表5，pcr扩增目的基因。分别用限制酶ndei和hindiii对扩增后的基因和质粒载体pcoldtf进行酶切，37℃酶切反应3h，通过1%（m/v）琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收酶切过后带有粘性末端的chy1和线性化的pcoldtf载体质粒。将酶切后的chy1与pcoldtf质粒按7:1的摩尔比置于反应体系中，用t4dna连接酶在16℃条件下过夜反应，得到重组质粒pcoldtf-chy1。
33.为提高chy对芳香族氨基酸的特异性对308位的脯氨酸进行定点突变。用重叠延伸pcr的方法对pcoldtf-chy1重组质粒进行扩增，以表5中序列为引物进行两轮扩增。
34.表5突变体设计的上游和下游突变引物得到的产物用1%（m/v）琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收。分别对pcoldtf以及突变序列进行双酶切，之后采用t4dna连接酶将经过双酶切的突变序列和pcoldtf进行连接，并得到重组质粒pcoldtf-chy1-p308r。将重组质粒导入bl21（de3）感受态细胞中，在氨苄霉素抗性平板上筛选阳性转化子，并经菌落pcr验证后再测序验证。将验证正确的菌液进行iptg诱导产酶。然后通过超声细胞破碎破壁获得粗酶液。用10ml0.2m，ph7.5的磷酸盐缓冲液（pbs）重悬菌体，经sds-page电泳验证目的蛋白，表明成功诱导表达得到了重组蛋白酶，即为胰凝乳蛋白酶突变酶p308r，其氨基酸序列如seqidno:23所示，308位突变为精氨酸。将粗酶液经ni柱纯化得胰凝乳蛋白酶突变酶p308r纯酶液，对于小分子底物（leu-gly-tyr-gly-leu）活性为50.67u/mg，保存在4℃备用。
35.应用例1以米糠蛋白为底物制备高f值低聚肽1.米糠蛋白制备以米糠料液比1:10加入正己烷，室温下搅拌脱脂3h，离心（4000
×
g，15min）去除正己烷，加入正己烷再次脱脂，置于通风橱风干12h。称取5g脱脂米糠粉，按照1:19.6加入0.1mol/lnaoh溶液，搅匀后置于40℃恒温摇床，振荡提取米糠蛋白4.7h，离心（4000
×
g，15min），收集上清液，沉淀加naoh溶液重复上述步骤再次提取，合并两次所得的上清液（记录体积），用0.01mol/l的hcl溶液调ph至5.4，离心（4000
×
g，15min），弃掉上清液，蒸馏水轻轻洗3次后收集沉淀用0.2mph=7.5的10mlpbs溶液复溶，得米糠蛋白液。
36.2.不同内肽酶与外肽酶组合酶解内肽酶：非特异性的碱性蛋白酶ap；实施例4制备的特异性的胰凝乳蛋白酶突变酶p308r酶；外肽酶：非特异性的木瓜蛋白酶p和风味蛋白酶fp；实施例2制备的特异性的丝氨酸羧肽酶cpy及其突变体酶y271r、i464g、m517r。
37.所用碱性蛋白酶（酶活：200u/mg）、木瓜蛋白酶（酶活：800u/mg）和风味蛋白酶（酶活：20u/mg），均购自上海源叶生物科技有限公司。
38.不同内肽酶与外肽酶组合及酶解条件如下：（1）ap组：将步骤（1）得到的米糠蛋白液用碱性蛋白酶ap进行处理，酶解条件如下：ph=9，50℃，加酶量1%（e/s，w/v），酶解4h；（2）ap+p组：第一步内肽酶酶解同ap组；第二步外肽酶酶解为将第一步酶解液调节ph=7.0，55℃，加木瓜蛋白酶p，加酶量1%（e/s，w/v），酶解4h；（3）ap+fp组：第一步内肽酶酶解同ap组；第二步外肽酶酶解为将第一步酶解液调节ph至7.0，按1%加酶量加入活性为20u/mg风味蛋白酶fp，在50℃水浴条件下水解4h，煮沸5min灭活。
39.（4）p308r+fp组：第一步内肽酶酶解为将步骤（1）得到的米糠蛋白液用胰凝乳蛋白酶突变酶p308r进行处理，酶解条件如下：ph=7.5，50℃，加酶量1%（e/s，w/v），酶解4h，然后将酶解液煮沸5min；第二步外肽酶酶解为将第一步酶解液调节ph=7.0，50℃，加风味蛋白酶fp，加酶量1%（e/s，w/v），酶解4h；（5）p308r+p组：第一步内肽酶酶解同p308r+fp组第一步；第二步外肽酶酶解同ap+p组第二步；（6）p308r+cpy组：第一步内肽酶酶解同p308r+fp组第一步；第二步外肽酶酶解为将第一步酶解液调节ph至7.5，按1%的加酶量（e/s,w/v）加入纯化酶液，在40℃水浴条件下酶解4小时；（7）p308r+y271r组：除第二步外肽酶酶解使用突变酶y271r，其他步骤同p308r+cpy组；（8）p308r+i464g组：除第二步外肽酶酶解使用突变酶i464g，其他步骤同p308r+cpy组；（9）p308r+m517r组：除第二步外肽酶酶解使用突变酶m517r，其他步骤同p308r+cpy组；在酶解过程中不断搅拌，监控其ph变化并用1mol/lnaoh调节。待反应结束后，将
反应体系立即置于沸水浴中，保持5min，终止反应。
40.3. 酶解液f值的测定将上述全部酶解液的ph调至4.5，按固液比1:10的比例加入活性炭，在25℃下吸附12小时，过滤除去活性炭素。使用3kda规格的超滤膜进行超滤处理以去除大分子量的肽链，得到高f值低聚肽溶液。
41.使用高效液相色谱法检测每个样品中的氨基酸含量。在测定前，将每个样品在110℃下使用6m hcl水解22h。将每个样品的f值定义为支链氨基酸与芳族氨基酸的摩尔比。图11为米糠蛋白经不同酶组合处理后生成的低聚肽产物溶液中的f值的柱形图。由实验结果可以看出，单用非特异的碱性蛋白酶ap进行水解得到低聚肽的f值为13.1。用米曲霉菌株m30011来源的cpy+p308r组合制得的样品其f值为29.84，用特异性突变体y271r、i464g、m517r和p308r组合制得的低聚肽的f值分别为42.51、38.20、43.16，与原酶相比f值分别提高了42.46%、28.02%、44.64%，与单酶相比增加了3.29倍，达到的高f值的水平。同时f值优于非特异性的外肽酶（风味蛋白酶fp、木瓜蛋白酶p）和特异性内肽酶p308r的组合，更是明显优于非特异性的双酶（碱性蛋白酶ap和木瓜蛋白酶p、碱性蛋白酶ap和风味蛋白酶fp）的组合。