一种双功能融合蛋白PETase-MHETase变体的制作方法

一种双功能融合蛋白petase-mhetase变体
技术领域
1.本发明涉及生物降解领域，更具体的是涉及一种双功能融合蛋白petase-mhetase变体。


背景技术：

2.塑料污染是一场全球性的环境危机。在全世界每年生产的3.59亿吨塑料中，有1.5~2亿吨堆积在垃圾填埋场或自然环境中。聚对苯二甲酸乙二醇酯（pet）是最丰富的聚酯塑料，每年在世界范围内生产近7000万吨用于纺织品和包装。目前pet的主要回收再利用方法：首先将回收的pet塑料进行分类，通过机械粉碎成碎片、洗涤和干燥处理后再利用加热等工艺进行再次制粒。虽然上述回收再利用方法得到了广泛的应用，但是这种方法往往会发生pet分子链断裂、分子量减少以及无法去除掺杂的杂质成分等情况，这大大降低了pet的使用性能。
3.2016年在日本堺市的一处垃圾掩埋场之中发现大阪堺菌（ideonella sakaiensis）能制造出来一种水解酶，该水解酶能攻击pet塑料，释放对苯二甲酸乙二醇酯（bhet）、对苯二甲酸-2-羟乙基单酯（mhet）和对苯二甲酸（tpa）和乙二醇（eg）。尽管ideonella sakaiensis 201-f6菌株的发现以及关键酶pet水解酶(petase)的功能分析为pet塑料的生物降解带来了希望，但该野生型菌株对pet塑料降解的效率较低，且该细菌喜欢无定形态的pet聚合物(而结晶态pet聚合物是目前pet塑料废弃物的主要构成成分)，难以直接实现在pet塑料生物降解的工业化应用。同时，petase除了会与pet结合外，该类酶的水解产物bhet和mhet也会与pet竞争酶的活性中心，从而抑制pet降解。因此，如何提高pet的生物水解效率以实现工业化应用是目前亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于以野生型petase和mhetase作为母本提供一种耐高温的双功能融合蛋白petase-mhetase变体，该petase-mhetase变体在72℃环境下催化6h就能将80%以上的pet粉末降解为对苯二甲酸和乙二醇。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种双功能融合蛋白petase-mhetase变体，所述petase-mhetase变体由柔性接头共价连接mhetase变体的c端和petase变体的n端形成，其中所述mhetase变体包括：a）mhetase变体一：由氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型mhetase进行以下点突变获得：y27q/k-m112f/y-w340l；或b）mhetase变体二：在所述mhetase变体一的基础上进行以下点突变中的至少一个：e30a、s51g、g84s、d95a、y117l、v332g、d343v、k362s、i367t、l370a、q476r、f487a，mhetase变体二与野生型mhetase的氨基酸序列同源性达到95%以上；所述petase变体包括：a）petase变体一：由氨基酸序列如seq id no.2所示的野生型petase进行以下点
突变获得：v40l/f-r159p-s200f-a234l；或b）petase变体二：在所述petase变体一的基础上进行以下点突变中的至少一个：a9r、a51s、q89l、m90s、s176h、l178r、d182n、n187a、q190a、k215y、m224v、e236g，petase变体二与野生型petase的氨基酸序列同源性达到95%以上；所述petase-mhetase变体在72℃环境下催化6h就能将80%以上的pet粉末降解为对苯二甲酸和乙二醇。
6.作为优选，所述mhetase变体二与野生型mhetase的氨基酸序列同源性达到96%以上或97%以上或98%以上或99%以上；所述petase变体二与野生型petase的氨基酸序列同源性达到96%以上或97%以上或98%以上或99%以上；所述petase变体二来源于叶枝堆肥角质酶。
7.上述petase-mhetase变体中所述mhetase变体可替换为氨基酸序列如seq id no.4所示的mhetase变体，新的petase-mhetase变体也能在72℃环境下催化6h就能将80%以上的pet粉末降解为对苯二甲酸和乙二醇。
8.上述petase-mhetase变体中所述mhetase变体可替换为氨基酸序列如seq id no.7所示的mhetase变体，新的petase-mhetase变体也能在72℃环境下催化6h就能将80%以上的pet粉末降解为对苯二甲酸和乙二醇。
9.上述petase-mhetase变体中所述mhetase变体可替换为氨基酸序列如seq id no.19所示的mhetase变体，新的petase-mhetase变体也在72℃环境下催化6h就能将80%以上的pet粉末降解为对苯二甲酸和乙二醇。
10.上述petase-mhetase变体中所述petase变体替换为氨基酸序列如seq id no.24所示的petase变体，新的petase-mhetase变体也能在72℃环境下催化6h就能将80%以上的pet粉末降解为对苯二甲酸和乙二醇。
11.上述petase-mhetase变体中所述petase变体替换为氨基酸序列如seq id no.28所示的petase变体，新的petase-mhetase变体也能在72℃环境下催化6h就能将80%以上的pet粉末降解为对苯二甲酸和乙二醇。
12.上述petase-mhetase变体中所述petase变体替换为氨基酸序列如seq id no.35所示的petase变体，新的petase-mhetase变体也能在72℃环境下催化6h就能将80%以上的pet粉末降解为对苯二甲酸和乙二醇。
13.上述petase-mhetase变体中所述petase变体替换为氨基酸序列如seq id no.40所示的petase变体，新的述petase-mhetase变体也能在72℃环境下催化6h就能将80%以上的pet粉末降解为对苯二甲酸和乙二醇。
14.针对现有技术存在的不足，本发明的目的之二在于提供一种重组基因，重组基因，能够表达上述任意一种petase-mhetase变体。
15.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明设计的petase-mhetase变体既具有符合工业化推广的热稳定性还具有优异的催化活性。在72℃左右的反应温度下，pet无定型pet大分子链段自由运动且还未重新进行结晶，结晶度处于较低水平，在该温度环境下本发明的petase-mhetase变体与pet分子的可及性明显提高，酶解效率显著增加。实验证明，petase-mhetase变体能在72℃环境下催化6h就能将80%以上的pet粉末降解为对苯二甲酸（tpa）和乙二醇(eg)，降解效率非常优异，适合工业化推广。
附图说明
16.图1为mhetase野生型的三维预测图；图2为petase野生型的三维预测图。
具体实施方式
17.下面结合附图和实施例，对本发明进一步详细说明。
18.实施例1蛋白质序列中包含丰富的进化信息，对于提升蛋白质的热稳定性具有至关重要的作用。领域内已经开发了很多经典的共进化分析方法，这些方法基于同源序列比对文件，使用基于物理能量的potts模型，通过不断降低同源序列的能量，得到蛋白质序列中的共进化信号。但是，同源序列中存在源自系统生成树的噪声，严重影响了模型的精度。为此，发明人提出了平均乘积修正的后处理方法，但是这种方法仅对预测蛋白质接触图有效，无法消除噪声对共进化蛋白质设计算法的影响。发明人基于经典的蛋白质共进化分析方法gremlin，提出了谱范数惩罚项。在gremlin的优化过程中，谱范数惩罚项可以抑制共进化矩阵的最大特征值，进而降低系统生成噪声。基于计算得到的进化矩阵，发明人设计了逐代最优单点突变的贪婪算法，不断增强野生型mhetase和petase（氨基酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示，三维结构图如图1和图2所示）中的进化信号，最终得到了计算层面上最优的酶变体（mhetase变体和petase变体）。
19.具体地，本发明以野生型mhetase（氨基酸序列如seq id no.1所示）作为母体，进行以下点突变：y27q-e30a-g84s-d95a-m112f-y117l-w340l-d343v-k362s-f487a，得到mhetase-1变体（氨基酸序列如seq id no.3所示）；以野生型petase（氨基酸序列如seq id no.2所示）作为母体，分别进行以下点突变：v40l-q89l-m90s-r159p-d182n-n187a-q190a-s200f-m224v-a234l,得到petase-1变体（氨基酸序列如seq id no.22所示）。然后用柔性接头（gsgsgsgs）共价连接mhetase-1的c端和petase-1的n端，得到双功能融合蛋白petase-mhetase-1。
20.重组质粒与重组菌株的构建：mhetase（野生型，氨基酸序列如seq id no.1所示）、petase（野生型，氨基酸序列如seq id no.2所示）和petase-mhetase-1的核苷酸序列均由北京擎科生物科技有限公司合成，并将这些核苷酸序列插入到pet26b(+)的ndei和xhoi酶切位点处，从而获得相对应的质粒。随后将合成的质粒pet26b-petase（野生型）、pet26b-mhetase（野生型）和pet26b-petase-mhetase-1转入e. coli bl21(de3)中,由此构建了含有不同质粒的大肠杆菌菌株。
21.petase（野生型）、mhetase（野生型）和petase-mhetase-1的表达与纯化：将上述构建的大肠杆菌在21℃的zym自动诱导培养基中培养23h。培养结束后离心获得大肠杆菌细胞，然后将大肠杆菌悬浮于裂解缓冲液20mm tris-hcl，ph8,300mm nacl）中超声裂解，将上述裂解液离心取上清液。采用talon金属亲和树脂为固定相，用裂解液+10mm 咪唑缓冲液（20mm tris-hcl，ph8,300mm nacl，100mm咪唑）作为洗脱液进行分离纯化，得到目标蛋白溶液。使用hiload凝胶过滤将上述目标蛋白溶液进一步纯化，然后浓缩、分装、在液氮中快速冷冻并储存在-80℃环境中直至用于测定。
22.petase（野生型）、mhetase（野生型）和petase-mhetase-1的pet降解率测定
实验1：使用14个玻璃瓶（100ml）构建反应体系，每个反应体系ph均为8，包括20mm tris-hcl、300mm nacl和100mg pet粉末，其中7个反应体系中分别添加0.69
µ
mol petase（野生型）和0.69
µ
mol mhetase（野生型），作为对照组。剩余7个反应体系中添加0.69
µ
mol petase-mhetase-1，作为实验组。然后14个反应体系中均加入49ml 蛋白质专用缓冲液并在恒温摇床中孵育。上述蛋白质专用缓冲液：ph为8的磷酸二氢钾缓冲液。然后将14个反应体系分别置于64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、76℃的恒温摇床中反应，反应时间达到6h时取样灭酶活以终止酶反应。利用孔径为12~15
µ
m的11级无灰过滤器对样品进行过滤并干燥。利用6m naoh溶液将干燥后的样品溶解，得到样液。
23.最后用高效液相色谱法（hplc）分析样液测定样液中的tpa含量以确定pet的充分降解速率。
24.pet降解过程中的酶的比活（sa）是指每毫克酶每小时降解pet产生的tpa（mg
tpaeq
.h-1
mg
enzyme-1
）。
25.采用高效液相色谱法（hplc）测定样液的方法：将样液加入到100mm ph为8的磷酸钾缓冲液中进行稀释（150
µ
l），然后加入150
µ
l 甲醇和6.5
µ
l 6m的hcl并充分混合，液体经0.45
µ
m 的滤膜过滤，取20
µ
l液体上样。hplc所用系统为lc-2030c ht系统(shimadzu, japan)，流动相采用乙腈70%/水30%等度洗脱，以0.8 ml/min的速度通过shim-pack gist c18色谱柱(150
ꢀ×ꢀ
4.6 mm, 5 μm) 以分离得到tpa。然后在相同条件下（使用相同hplc系统和洗脱液）对商业购买的tpa进行测定，并制备标准曲线。测定结果如表1所示：表1：
mhetase变体，如表2所示：表2：采用实施例1的方法表达并纯化得到上述petase-mhetase变体，然后采用实施例1的方法测定72℃环境下降解6h后上述petase-mhetase变体的pet降解率。测定结果如表3所示：表3：
由表3可知，18种petase-mhetase变体在72℃环境下降解pet粉末6h后，pet的降解率均能达到80%以上，降解效率非常优异，适合工业化推广。
27.以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通研究人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。