产核苷及其衍生物的重组菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于微生物工程，具体地说，涉及一种产核苷及其衍生物的重组菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由d-核糖或d-z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由d-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与rna组成，由d-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与dna组成。d-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(a)、鸟苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。

2、鸟嘌呤核苷(鸟苷)和次黄嘌呤核苷(肌苷)在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(amp)和鸟苷酸(gmp)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。

3、腺苷即腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-d-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，属于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷除了可以用作治疗心脏的特效药物之外，还是用于合成三磷酸腺苷(atp)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体，广泛应用于医药等行业。

4、目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差、核苷的转化率仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种产核苷及其衍生物的重组菌及其构建方法与应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种修饰的微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其全局转录调控因子ccpa的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的核苷生产能力。

3、本发明中，所述全局转录调控因子ccpa在ncbi上的参考序列编号为bamf_2774(解淀粉芽孢杆菌)或bsu_29740(枯草芽孢杆菌)。

4、进一步地，微生物中的全局转录调控因子ccpa的活性降低或丧失可以由选自以下1)-5)，或任选的组合实现的：

5、1)通过改变所述全局转录调控因子ccpa的编码基因的启动子序列而降低或丧失；

6、2)通过改变所述全局转录调控因子ccpa的编码基因的核糖体结合位点而降低或丧失；

7、3)通过改变所述全局转录调控因子ccpa的氨基酸序列而降低或丧失；

8、4)通过改变编码所述全局转录调控因子ccpa的核苷酸序列而降低或丧失；

9、5)通过敲除所述全局转录调控因子ccpa的编码序列而丧失。

10、可以采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低所述全局转录调控因子ccpa的编码基因的表达或敲除内源的所述全局转录调控因子ccpa的编码基因。

11、优选地，全局转录调控因子ccpa活性降低或丧失是通过如下a～d的至少一种方式来实现的：

12、a、全局转录调控因子ccpa的第95位氨基酸由i突变为m；

13、b、全局转录调控因子ccpa的第150位氨基酸由e突变为k；

14、c、全局转录调控因子ccpa的第205位氨基酸由l突变为p；

15、d、全局转录调控因子ccpa的编码基因的起始密码子由gtg或atg突变为ttg。

16、本发明中，所述微生物可以是芽孢杆菌属(bacillus)或埃希氏菌属(escherichia)菌种，如解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、大肠杆菌(escherichia coli)等。

17、第二方面，本发明提供一种产核苷及其衍生物的重组菌的构建方法，利用基因工程手段，失活或弱化具有核苷生产能力的微生物中的全局转录调控因子ccpa的编码基因。

18、所述弱化可以选自以下1)-5)，或任选的组合实现的：

19、1)通过改变所述全局转录调控因子ccpa的编码基因的启动子序列而降低或丧失；

20、2)通过改变所述全局转录调控因子ccpa的编码基因的核糖体结合位点而降低或丧失；

21、3)通过改变所述全局转录调控因子ccpa的氨基酸序列而降低或丧失；

22、4)通过改变编码所述全局转录调控因子ccpa的核苷酸序列而降低或丧失；

23、5)通过敲除所述全局转录调控因子ccpa的编码序列而丧失；

24、弱化的方法可以选自诱变、定点突变、同源重组中的至少一种。

25、优选地，弱化是通过如下a～d的至少一种方式来实现的：

26、a、全局转录调控因子ccpa的第95位氨基酸由i突变为m；

27、b、全局转录调控因子ccpa的第150位氨基酸由e突变为k；

28、c、全局转录调控因子ccpa的第205位氨基酸由l突变为p；

29、d、全局转录调控因子ccpa的编码基因的起始密码子由gtg或atg突变为ttg；

30、第三方面，本发明提供按照所述方法构建得到的重组菌。

31、第四方面，本发明提供所述修饰的微生物或所述重组菌在核苷及其衍生物的发酵生产或提高核苷及其衍生物的发酵产量中的应用。

32、所述核苷及其衍生物包括但不限于肌苷、鸟苷、腺苷、次黄嘌呤、肌苷酸、鸟嘌呤、腺嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸、腺苷酸、阿糖腺苷等。

33、第五方面，本发明提供一种生产核苷的方法，所述方法包括如下步骤：

34、a)培养所述修饰的微生物或所述重组菌，获得培养物；

35、b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的核苷。

36、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

37、本发明通过使微生物中的全局转录调控因子ccpa活性减弱，使得微生物能够高效率、高速度地生成鸟嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷或腺嘌呤核苷，突变菌株b.a 8344(含ccpai95m点突变)、b.a 8345(含ccpae150k点突变)、b.a 8346(含ccpal205p点突变)和b.a 8347(ccpa起始密码子弱化)与出发菌相比，鸟苷产量由1.1g/l提高至3.2g/l、1.8g/l、1.9g/l和2.8g/l。肌苷产量由0.5g/l分别提高至1.5g/l、1.0g/l、1.0g/l和1.3g/l。突变菌株b.subtilisa0004(含ccpai95m突变)、b.subtilis a0005(含ccpae150k突变)、b.subtilis a0006(含ccpal205p突变)和b.subtilis a0007(ccpa起始密码子弱化)与出发菌相比，腺苷产量由8.9g/l提高至10.8g/l、10.6g/l、11.3g/l和11.9g/l。本发明为大规模生产核苷提供有效手段，应用前景广阔。