一种即用型基因检测包的制作方法

1.本发明涉及基因检测领域，更具体地，涉及一种即用型基因检测包。


背景技术：

2.1985年，美国pe-centus公司人类遗传研究所的mullis等发明了聚合酶链式反应技术 (polymerase chain reaction,pcr),基因诊断技术成为最具发展潜力的领域，而pcr技术也一直占据着核酸扩增反应技术的垄断地位，并且该技术获得了2003年的诺贝尔医学奖。然而pcr技术对精良仪器具有依赖性，在没有仪器的情况下就不能进行核酸的扩增，限制了pcr技术更为广泛的应用。基于这一现状，近年来，科研工作者发明了一系列核酸恒温扩增技术。与pcr相比，核酸恒温扩增具有快速高效，且不需要专用仪器的优点。核实恒温扩增技术自诞生以来，便得到了迅猛的发展。有些技术已经相当成熟，正逐步在检验检疫、医学、法学等领域得到了广泛的应用。
3.目前主流的核酸恒温扩增技术有：依赖解旋酶的等温扩增技术(had)、链替代扩增(sda)、交叉引物扩增技术(cpa)、环介导核酸等温扩增技术(lamp)、滚环扩增技术(rca)、单引物等温扩增(spia)。科研工作者进一步开发了恒温扩增技术的可视化检测方法，比如lamp技术可以直接根据管内的浑浊来判断结果，另外可以添加一些荧光染料如sybr green、picogreen、gene finder和钙黄绿素等，hnb也是常见的一种可视化检测染料。有了这些手段后，核酸检测可以在很普通的实验条件下得以实现，例如在有水浴锅、普通的核酸样本处理设备比如离心机、水浴锅和移液器的室验条件下完成。
4.但是基于家庭试验器材及操作人员专业知识限制，且家庭一般不具备精准的移液工具、离心机等，因此很难在一般家庭中完成检测并达到判定目的。只有开发一种更易于普通非专业人士操作使用的核酸检测工具，核酸检测才能走进千家万户。


技术实现要素：

5.本发明的目的是在于解决现有技术的不足之处而提供一种更为简单易用的核酸检测工具平台，在普通家庭或者野外，不需要任何专业仪器和设备就可以用来检测核酸，当然，本发明亦可降低医院的基因检测成本。
6.本发明首先提供了一种即用型基因检测包，包括：
7.采样工具，植绒或者粗糙表面的拭子；样品处理管，所述的样品处理管含有裂解液和磁珠；加样工具，所述加样工具至少包括样本吸附部及封闭层穿刺部。扩增反应管，所述扩增反应管内装有基因扩增检测液态反应体系，所述基因扩增检测液态反应体系表面设有封闭层，所述封闭层将基因扩增检测液态反应体系封闭于扩增反应管内的固定空间内；本发明的即用型基因检测包不需要任何专业仪器和设备即可提取和检测基因。
8.所述的采样工具用于从口腔、鼻孔或者物体的表面擦拭，蘸取待检测样品。
9.所述的样品处理管用于裂解释放样品核酸。
10.所述的样品处理管中的磁珠在裂解液中吸附核酸，在反应液中释放核酸。
11.所述恒温基因扩增检测液态反应体系被封闭层封闭于所述恒温扩增反应管的下部，可以是一层，也可以是多层。
12.所述加样工具包括样本吸附部件及封闭层穿刺部件；优选，所述样本吸附部与封闭层穿刺部位于同一部件上，构成样本承载穿刺件。
13.所述加样工具的样本吸附部件用于吸附裂解液中的磁珠。
14.所述封闭层的固液转换起点温度为室温以上扩增反应温度以下，且所述封闭层在扩增温度下的密度低于相同温度下所述基因扩增检测液态反应体系的密度。
15.所述封闭层的材料可选自但不限于：橡胶、塑料、石蜡、生物胶或者树脂等。
16.所述扩增反应管可以是单管，亦可以是由多个单管相连构成的管组。在较佳的实施方式中，所述管组中的单管可以呈线性或阵列排布。
17.所述扩增反应管的封口部件形式不限，达到封口目的即可，可以是可拆卸的或是不可拆卸的，可拆卸的封口部件包括但不限于：插拔封盖、封套、螺纹连接的封盖等。不可拆卸封口部件破坏后即可加样，例如刺破后即可加样。
18.所述加样工具可以刺破封闭层，把样品的基因带入反应液。
19.所述基因扩增反应可以是恒温的，也可以是变温的。
20.所述样本吸附部件选自：采样拭子、吸管、塑料棒或棉签中的一种或多种；样本承载穿刺件的样本吸附部选自：由气囊及与之相通的管腔构成的吸管结构、芯材外包裹样本附着材料的采样拭子结构、或直接由样本附着材料制成的采样棒状结构；所述封闭层穿刺部件或样本承载穿刺件的封闭层穿刺部包括一个或多个刺尖。
21.当所述样本吸附部与封闭层穿刺部位于同一部件上时，构成样本承载穿刺件，所述样本吸附部与封闭层穿刺部可一体成型；或者，所述样本吸附部与封闭层穿刺部为固定连接或可拆卸式连接的组件。具体的，所述样本吸附部可以是任意可承载样本的结构，包括但不限于：由气囊及与之相同的管腔构成的吸管结构、芯材外包裹样本附着材料的采样拭子结构、直接由样本附着材料制成的采样棒状结构等。所述样本附着材料适于附着样本即可，包括但不限于：棉、绒、塑料、竹、木、金属等。当所述恒温扩增反应管为管组时，为更进一步简化操作步骤，亦可对应管组中单管的排列方式，将加样工具设置为由多个平行的样本承载穿刺件相连构成的组件。
22.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的核酸检测包不需要其他特殊设备，检测方便，成本低，适合家庭和现场使用，样本现采现用，不涉及复杂的样本保存运输。 2.本发明的核酸检测包即便运输中颠簸亦不会影响检测的精准，且检测步骤特别简单，尤其适于非专业人士操作3.本发明的核酸检测包扩增快速且高效，在几分钟内可以完成核酸的采样和核酸提取的步骤。4.本发明的核酸检测包所得的核酸样本纯度高，适用于进一步进行恒温或者变温的基因扩增。5.本发明的家用核酸检测包将样本的制备过程简化，使得该检测包走进家庭成为了可能。6.本发明的家用核酸检测包全部采用密封的一次性小管，减少了气溶胶污染的可能。
附图说明
23.图1显示为本发明即用型基因检测包中恒温扩增反应管的一种实施方式拆分示意图。
0.5m；硫氰酸胍为3-5m；edta为10-40mm；peg-6000占总质量的2-5％；sds占总质量1％-3％；triton-100占总质量的4.5-9％；异丙醇占总质量的5-15％；磁珠浓度为20-50mg/ml。
49.恒温扩增反应管1，如图1～8所示，所述恒温扩增反应管包括封口部件11，所述恒温扩增反应管内装有恒温基因扩增检测液态反应体系12，所述恒温基因扩增检测液态反应体系表面设有封闭层13，所述封闭层将恒温基因扩增检测液态反应体系封闭于恒温扩增反应管内的固定空间内。
50.加样工具，如图8-12所示，所述加样工具至少包括样本吸附部21及封闭层穿刺部22。
51.基于运输及搬运过程中不可预料的颠簸，反应管中的液态反应试剂容易随意分布于管壁的任意部位，对于家庭而言，对预先装好的反应试剂，如没有离心机或者精准的移液工具，将无法克服反应试剂体积不精准导致的检测问题。本发明利用封闭层将恒温基因扩增检测液态反应体系封闭于恒温扩增反应管内的固定空间内，一方面防止运输与搬运过程中液态试剂随意分布，另一方面也可以在恒温扩增反应中防止反应试剂的挥发。
52.作为进一步的优选，所述封闭层的固液转换起点温度为室温以上恒温扩增反应温度以下。考虑到绝大多数地区的室温情况，且恒温扩增反应的常用温度为65℃，所以，优选的固液转换起点温度范围为35-65℃。为适应更为炎热的环境，所述低熔点封闭层的固液转换起点下限还可以进一步选择35℃-50℃之间的任意温度，例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、 41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃等。为了在恒温扩增时，封闭层能更迅速地进行固液转换，低熔点封闭层的固液转换起点上限更优选为小于65℃，例如64℃、63℃、62℃、61℃、60℃、59℃、58℃、57℃、56℃、55℃、54℃、53℃、52℃、 51℃等。所述封闭层的固液转换起点温度可根据即用型基因检测包生产及销售地的温度条件进行恰当选择。
53.封闭层的固液转换起点温度高于室温，可以使得室温运输及储存条件下能维持固态，达到封闭检测试剂的目的。固液转换起点温度在恒温扩增反应温度以下，可以使得在进行恒温扩增检测反应时，封闭层部分或全部液化，即便在加样时破坏了密封层的密封状态，在进行恒温扩增反应时，液化的封闭层基于液化部分的张力，仍能恢复密封状态，将反应体系与外界进行隔离，从而降低了对操作者与操作环境的要求，减少人为或外界条件引起的检测误差。而反应完成恢复室温后，低熔点封闭层将重新恢复固态，很好地固定了反应后溶液，不至于受搬运、摆放条件等因素影响，便于使用者随时观察检测结果。
54.更进一步优选的，所述封闭层在恒温扩增温度下的密度低于相同温度下所述恒温基因扩增检测液态反应体系的密度。封闭层的密度更低，可以使得即便在加样过程中，部分封闭层材料被带入检测试剂，亦很容易浮到检测试剂表面，一方面可保证反应试剂的澄清度，另一方面也有利于重新封闭反应液面。
55.所述封闭层的材料可选自但不限于：橡胶、塑料、石蜡、生物胶或者树脂等。
56.所述恒温扩增反应管1的管壳可以采用常规的反应管。所述封闭层将恒温基因扩增检测液态反应体系封闭于恒温扩增反应管内的固定空间内是指：经封闭层的封闭，恒温基因扩增检测液态反应体系在恒温扩增反应管的位置被固定下来，即便是液体状态，也被限制在一封闭空间内，不能随意流动到恒温扩增反应管的其他位置。较佳的，所述恒温基因扩增检测液态反应体系被封闭层封闭于所述恒温扩增反应管1的下部。所述恒温扩增反应
管的底部可以是圆底、尖低、平底等各种底部结构。在优选的实施方式中，如图1～4所示，所述反应管的下部，横截面向端部逐渐减小。恒温扩增反应的反应体系一般为微量体系，体系总体积一般在500μl以下，其容腔横截面由上至下逐渐减小更利于操作与观察。
57.所述恒温扩增反应管可以是单管，亦可以是由多个单管相连构成的管组。一般而言，一个单管对应一个snp位点的一种碱基的检测。基因检测包可以包含多个单管，从而实现对一个snp位点的各种碱基类型的检测或者进一步的对多个snp位点的各种碱基类型的检测。多个单管相连构成管组，可便于操作。
58.如图5～8所示的较佳实施方式中，所述管组中的单管可以呈线性或阵列排布，所述阵列排布包括但不限于矩形阵列、环形阵列等。管组中，各单管相互平行。如图5所示，管组中，相邻单管的管壁可经由连接结构14相连，亦可如图6所示，共享同一管壁。
59.即用型基因检测包中的单管数主要由该检测包可检测的位点确定，一般一个位点对应1-3 个单管，对于可以检测多个位点的检测包，例如可以有12个、18个、24个、32个、36个、 40个、48个、60个、72个、84个、96个单管或者由他们构成的管组。
60.所述恒温扩增反应管的封口部件形式不限，达到封口目的即可，如图1-4所示，包括但不限于：插拔封盖、封套、螺纹连接的封盖等。较佳的，封口部件与管身柔性连接。
61.所述加样工具中的样本吸附部及封闭层穿刺部可位于不同部件上，亦可位于同一部件上。
62.所述样本吸附部件用于承载样本。所述样本吸附部件包括样本容纳腔或样本吸附材料。
63.所述封闭层刺穿部用于刺破封闭层，较佳的，所述封闭层刺穿部包括至少一个刺尖。
64.如图9、10所示，当样本吸附部及封闭层穿刺部位于不同部件上时，所述加样工具包括样本吸附部件及封闭层穿刺部件，所述样本吸附部件包括样本吸附部21，所述封闭层穿刺部件包括封闭层穿刺部22。所述样本吸附部件可以是任意可承载样本的常规部件，包括但不限于：采样拭子、吸管、塑料棒、棉签等。所述封闭层穿刺部件可以是任意可刺穿封闭层的部件，为了刺穿封闭层，所述封闭层穿刺部件可以有一个或多个刺尖。当所述恒温扩增反应管为管组时，为更进一步简化操作步骤，所述样本吸附部件亦可对应管组中单管的排列方式设置由多个平行的样本吸附部相连构成的组件。
65.当所述样本吸附部与封闭层穿刺部位于同一部件上时，构成样本承载穿刺件，所述样本吸附部21与封闭层穿刺部22可一体成型；或者，所述样本吸附部21与封闭层穿刺部22为固定连接或可拆卸式连接的组件。具体的，所述样本吸附部可以是任意可承载样本的结构，包括但不限于：由气囊及与之相通的管腔构成的吸管结构、芯材外包裹样本附着材料的采样拭子结构、直接由样本附着材料制成的采样棒结构等。所述样本附着材料适于附着样本即可，包括但不限于：棉、绒、塑料、竹、木、金属等。当所述恒温扩增反应管为管组时，为更进一步简化操作步骤，亦可对应管组中单管的排列方式，将加样工具设置为由多个平行的样本承载穿刺件相连构成的组件。
66.为便于操作，所述加样工具可包括手持部23，所述手持部可设于加样工具的端部或中部。
67.样本承载穿刺件的一个优选实施例如图11所示，所述样本吸附部21与封闭层穿刺
部22 分别位于样本承载穿刺件的两端。
68.样本承载穿刺件的另一个优选实施例中，所述样本吸附部21与封闭层穿刺部22一体成型，位于样本承载穿刺件的同端。
69.样本承载穿刺件的一个优选的实施例如图12所示，所述加样工具一端塑料棒与刺尖一体成型作为样本吸附部与封闭层穿刺部，另一端为手持部23。该加样工具特别适用于体液样本，例如唾液。使用者只需口含塑料棒或将塑料棒置于液态样本中片刻即可在塑料棒上吸附一定量的样本，基于塑料为非渗透材质，而塑料本身对样本又有一定的吸附作用，表面吸附的样本不会过多或过少，因此加样量精准。塑料棒与刺尖一体成型，穿刺与加样可一气呵成。该设计让取样加样变得特别简单易操作。
70.所述样本可以为各种样本形式，例如为原始样本，比较常见的如唾液，或者为稀释后的样本。唾液中会含有破碎的口腔上皮细胞，基于恒温基因扩增所需的核酸模板量很低，因此唾液原液已可满足采样要求。此外，亦可刮取口腔上皮细胞作为原始样本，对样本稀释后作为检测样本使用。对于采样后需要稀释的情况，检测包中还可以进一步包括：独立包装的样本稀释液，以便于样本稀释后再取样。样本稀释液可选用常规稀释液，如无菌水、缓冲液等。
71.恒温基因扩增检测液态反应体系包含恒温基因扩增反应试剂混合液。所述恒温基因扩增反应试剂混合液在加入样本后置于合适温度下即能对含有待检基因位点的样本进行恒温基因扩增反应。所述恒温基因扩增反应试剂混合液可基于恒温基因扩增技术设计，恒温基因扩增技术属于现有技术，已知常用的包括：依赖解旋酶的等温扩增技术(had)、链替代扩增(sda)、交叉引物扩增技术(cpa)、环介导核酸等温扩增技术(lamp)、滚环扩增技术(rca)、单引物等温扩增(spia)等。恒温基因扩增检测液态反应体系一般应含有促进恒温基因扩增反应的酶，缓冲体系，待测基因目标位点的特异性引物以及核苷酸，能在适于恒温基因扩增的反应温度下条件下进行基因扩增反应。基于不同的恒温扩增技术，本领域技术人员可以根据现有技术选择适用的酶及缓冲体系。特异性引物可以利用引物设计软件等现有技术来完成初步设计并采用常规手段验证是否适用即可。任意经专业方法验证可有效检测特定基因位点的恒温基因扩增检测液态反应体系均适用于作为本发明中恒温扩增反应管中预装的恒温基因扩增检测液态反应体系制备本发明的检测包，从而使得非专业人士在无需专业工具及专业技巧的情况下亦能获得精准的检测结果。此外，恒温基因扩增反应在较高温度下进行的，可以不用细胞裂解液，本身的温度可以促进细胞的裂解。优选的情况下还可以在反应体系中进一步添加促进细胞裂解的物质，使反应更为快速。
72.为更便于即用型基因检测包稳定性更好，保质期更久，方便运输和保存，可以把基因扩增所需要的酶冷冻干燥在封闭层的上部，或者冷冻干燥在底部，中间再增加一层封闭层。有些颜色指示剂也是不稳定的，也可以采用同样的策略。
73.为了更方便操作者使用，优选的，即用型基因检测包中还可进一步包括：示温元件，用于指示温度。所述示温元件可以是温度计或者带有温度指示的水杯或者锅中的测温显温单元。同样优选的，即用型基因检测包中还可进一步包括：恒温扩增反应管架。恒温扩增反应管架可以用于承载反应管，以使承载恒温扩增反应管在水浴中位置相对固定。较佳的，可以采用漂浮架，漂浮架使恒温扩增反应管竖直漂浮于水浴中。漂浮架一般选用轻质材料制备，可漂浮于水面上。漂浮架上可设通孔等，便于插入恒温扩增反应管。同样优选的，即
用型基因检测包中还可进一步包括：保温装置或恒温装置，用于提供恒定的反应温度环境。保温装置例如可以为保温杯、保温锅等各种起到保温水浴容器作用的装置，恒温装置例如可以为恒温盒、恒温箱等各种可以提供恒温环境的装置。基于温度计、保温杯一般家庭常备，而一般的泡沫材质、树叶即可用作漂浮架，家庭使用时完全可以就地取材无需特别匹配，因此示温元件、漂浮架、保温装置或恒温装置并非检测包必备配件，可按需配置。
74.本发明的即用型基因检测包使用时采用以下步骤：
75.1.用基因检测包中拭子采集样本。
76.2.将拭子放入样本处理管中释放样本的核酸。
77.3.用加样工具的样本吸附部吸附样本处理管中的磁珠。
78.4.用加样工具的穿刺部刺穿恒温扩增反应管的封闭层后将样本吸附部浸入基因扩增检测液态反应体系；
79.5.将扩增反应管在扩增反应温度下反应适当时间；
80.6.判定反应结果。
81.适当反应时间依据反应体系的不同而不同，可采用阳性标准样及阴性标准样来确定，一般选择阳性标准样能与阴性标准样表现出明显差别的反应时间范围作为适当的反应时间范围。一般而言，反应时间在5-120分钟。更常用的，一般在15-60分钟。
82.恒温扩增反应温度环境可利用保温装置或恒温装置预先准备。在本发明中，所谓的恒温并非绝对恒温，是一个相对概念，只要在可发生恒温基因扩增反应的温度范围内均可，比如 55-65℃。例如在本发明中使用的一些保温杯等器材，在开始时可能是65度，随着时间的推移，温度会逐渐降低，一般不低于55度，反应均可正常进行。因此本发明中所涉及的恒温反应可以允许温度在一定的范围波动。
83.以下进一步以新冠病毒n基因检测为例，提供一种n基因即用型检测包，包括：
84.1.采样工具，植绒的拭子。
85.2.样品处理管，采用常用2ml离心管，含有1ml裂解液和磁珠。所述裂解液包括tris-hcl、硫氰酸胍、edta、triton-100、peg-6000；sds；异丙醇；其中tris-hcl为0.1m-0.5m；硫氰酸胍为3-5m；edta为10-40mm；peg-6000占总质量的2-5％；sds占总质量1％-3％；triton-100占总质量的4.5-9％；异丙醇占总质量的5-15％；磁珠浓度为20-50mg/ml。
86.3.恒温扩增反应管，恒温扩增反应管为200μl带盖小管，其内预装有恒温基因扩增检测液态反应体系，购自上海百艳生物科技公司(货号covn0010)，取25ul反映体系加入反应管，然后加入融化的30ul石蜡。
87.4.加样工具如图12所示，一端塑料棒与刺尖一体成型，另一端为手持部。
88.n基因即用型检测包即用型检测包使用方法：
89.a.将打开检测包，在保温杯中加入热水，用温度计调整为65摄氏度。
90.b.用口腔拭子刮取口腔内壁，将拭子放入样本处理管中释放样本的核酸。
91.c.用加样工具的样本吸附部吸附样本处理管中的磁珠，用加样工具的穿刺部刺穿恒温扩增反应管的封闭层后将样本吸附部浸入基因扩增检测液态反应体系。
92.d.将反应管盖紧，放入保温杯中，反应15-60分钟。
93.e.观察反应管颜色变化，阳性为浅蓝色，阴性为浅红色。
94.本实验阳性对照采用n基因质粒，购自上海百艳生物科技公司(货号covn1010)。在
阳性对照样本的拭子中加入100copy质粒，阴性对照加入等体积的灭菌水。
95.经预检的阳性样本及阴性样本，采用该即用型检测包进行检测，经30分钟反应后，阳性样本显示清晰的浅蓝色，阴性样本显示清晰的浅红色。这说明，采样工具的设计完全符合采样量的要求。
96.为了验证试剂盒是否适于非专业人士使用，在所用检测试剂完全一致的情况下进行了专业操作与本检测包操作的比对试验。专业人士采用移液器在200ul的eppendorf管中按上述反应体系配方临时配置反应体系，离心后封盖，采用专业水浴锅在65摄氏度反应。非专业人士则采用即用型检测包按说明的方法进行检测，过程中不使用离心机、移液器等工具。完成操作后对两者检测结果的一致性进行比较。
97.结果表明，无论是阴性样本、阳性样本还是其他样本，针对同一样本，专业人士与非专业人士检测结果完全一致。采用本发明的检测包，基于石蜡的密封作用，在反应完成72小时内，仍能观察到检测结果。
98.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。