基于ilvC突变体高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用

基于ilvc突变体高产d-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种基于ilvc突变体高产d-泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备d-泛酸中的应用。
(二)

背景技术：

2.泛酸，也称为维生素b5，是辅酶a的组成成分之一，在能量代谢以及柠檬酸循环等重要生化反应中起到关键作用。因此，作为一种重要的维生素及前体物质，d-泛酸在饲料、医药以及化妆品等方面得到广泛应用。在已知的d-泛酸合成方法中，生物发酵法生产d-泛酸具有底物廉价、易分离、毒性小等优势而受到关注。但目前利用生物法生产d-泛酸仍存在缺陷，例如发酵过程不稳定、产量不高等问题。因此，构建一株更高产的d-泛酸菌株仍是一大挑战。
(三)

技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种基于ilvc突变体高产d-泛酸的基因工程菌构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备d-泛酸中的应用。
4.本发明采用的技术方案是：
5.一种基于ilvc突变体高产d-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建：运用基因编辑技术，对ilvc基因413号密码子进行定点突变，将异亮氨酸突变为丙氨酸，并通过中高拷贝质粒ptrc99a使其在底盘菌dpan15(e.coli w3110trc-panc/trc-pane/trc-panb/trc-ilvc/ilvg
*
/δavta/ilve
*
/coaa/
△
poxb/
△
pta/
△
ldha
△
plfb/ trc-pyka/ilvn*/ilvh*/trc-spot*/trc-lpd/trc-ilvd/
△
laci
*
，已在cn 113278569 a中公开) 中过表达，得到dpan15/ptrc99a-ilvc
i413a
，即所述基于ilvc突变体高产d-泛酸的基因工程菌。
6.本发明在前期实验室已构建的无质粒、无诱导剂使用的d-泛酸生产菌株 dpan15的基础上，运用代谢工程改造、酶改造、代谢通量的优化等方式，构建了一株性能更优的d-泛酸生产菌株。本发明菌株的构建方法具体如下：通过改造底物与酮醇酸还原异构酶相互作用附近位点，改变其底物混杂性，为了得到酶分子与底物2-酮泛解酸相互作用的构象，采用autodock软件对其进行对接，其中酮醇酸还原异构酶ahair的晶体结构(pdb id：3ulk)由pdb蛋白质结构数据库(protein data bank)中获得，从对接结果来看(图1)，酶分子的活性口袋较浅，底物更易结合在酶上，这也解释了为什么ahair能催化多种2-酮酸进行反应。
7.本发明从底物与酶结合的复合物0.5nm附近位置随机选择了9个预测位点，这些位点均位于酮醇酸还原异构酶的活性口袋和底物相互作用的位点附近，将9 个位点均突变为丙氨酸后，随后对其分别进行摇瓶发酵，作为最优选的方案，最终使摇瓶中d-泛酸产量从4.72g/l提升至5.30g/l，并且相对于出发菌株，所得发酵液中l-valine的含量基本没变，维持在1.1g/l左右。
8.本发明运用分子对接，对酮醇酸还原异构酶ahair进行定点突变，通过增强底物与酶的结合能力，提高了2-酮泛解酸对底物的亲和能力，最终得到突变质粒trc-ilvci413a，
在加强d-泛解酸途径的同时，未影响l-缬氨酸的合成。最后通过摇瓶发酵，使d-泛酸产量从4.72g/l提升至5.30g/l，且相对于出发菌株，所得发酵液中l-valine的含量基本没变，维持在1.1g/l左右。
9.本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
10.(1)运用基因编辑技术，对ilvc基因413号密码子进行定点突变，将异亮氨酸突变为丙氨酸，得到运用基因编辑技术，得到ilvc
i413a
；
11.(2)运用基因编辑技术，通过中高拷贝质粒ptrc99a使ilvc
i413a
在底盘菌dpan15 中过表达，得到dpan15/ptrc99a-ilvc
i413a
，即所述基于ilvc突变体高产d-泛酸的基因工程菌。
12.所述底盘菌dpan15参照专利cn113278569a(已公开)构建获得。
13.具体的，所述ilvc
i413a
核苷酸序列如seq id no.8所示。
14.本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备d-泛酸中的应用。
15.具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至含有kan抗性的发酵培养基中，25～30℃、100～200rpm条件下进行发酵培养至od600＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.2mm的iptg，之后转至30℃，180rpm下继续培养48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到d-泛酸。
16.所述发酵培养基组成如下：葡萄糖24g/l、(nh4)2so
4 12g/l、kh2po
4 1g/l、 mgso
4 0.5g/l、酵母提取物2g/l、caco
3 10g/l，1ml/l微量元素溶液，溶剂为去离子水，ph值自然；微量元素溶液组成为：10g/l cucl2、10g/l feso4·
7h2o、 1g/l znso4·
7h2o、0.20g/l cuso4、0.02g/l nicl2·
7h2o，溶剂为去离子水。
17.通常，所述基因工程菌发酵前，先接种至lb培养基中，于37℃、200rpm 的摇床上过夜培养，之后以体积浓度2％接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养
18.本发明运用分子对接，对酮醇酸还原异构酶ahair进行定点突变，通过选取底物与酶结合的复合物0.5nm附近9个预测位点，在增强底物与酶的结合能力的同时，提高了2-酮泛解酸对底物的亲和能力，最终得到突变质粒 ptrc99a-ilvc
i413a
，在加强d-泛解酸途径的同时，未影响l-缬氨酸的合成。
19.与现有技术相比，本发明的有益之处主要体现在：
20.运用分子对接以及基因编辑技术，得到的突变质粒ptrc99a-ilvc
i413a
，在提高酶对底物2-酮泛解酸的亲和力同时，促进了前体d-泛解酸的合成，并且未对 l-缬氨酸的合成产生影响，使d-泛酸的摇瓶效价从4.72g/l提高至5.30g/l，且相对于出发菌株，所得发酵液中l-valine的含量基本没变，维持在1.1g/l左右。
(四)附图说明
21.图1为酮醇酸还原异构酶与2-酮泛解酸的对接结果；
22.图2为dpan16(dpan15/ptrc99a-ilvc)的od
600
和d-泛酸效价变化；
23.图3为dpan17(dpan15/ptrc99a-ilvc
g220a
)的od
600
和d-泛酸效价变化；
24.图4为dpan18(dpan15/ptrc99a-ilvc
l225a
)的od
600
和d-泛酸效价变化；
25.图5为dpan19(dpan15/ptrc99a-ilvc
c226a
)的od
600
和d-泛酸效价变化；
26.图6为dpan20(dpan15/ptrc99a-ilvc
l396a
)的od
600
和d-泛酸效价变化；
27.图7为dpan21(dpan15/ptrc99a-ilvc
i397a
)的od
600
和d-泛酸效价变化；
28.图8为dpan22(dpan15/ptrc99a-ilvc
v412a
)的od
600
和d-泛酸效价变化；
29.图9为dpan23(dpan15/ptrc99a-ilvc
i413a
)的od
600
和d-泛酸效价变化；
30.图10为dpan24(dpan15/ptrc99a-ilvc
s414a
)的od
600
和d-泛酸效价变化；
31.图11为dpan25(dpan15/ptrc99a-ilvc
t416a
)的od
600
和d-泛酸效价变化。
(五)具体实施方式
32.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
33.以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/l。
34.本发明所述亲本菌株e.coli w3110来自耶鲁大学cgsc保藏中心(coligenetic stock center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号cgsc#4474，已在专利us 2009/0298135 a1，us 2010/0248311 a1中公开。
35.实施例1-11中使用的引物序列信息如表2所示，
36.表1：基因编辑所涉及的基因及相应途径
[0037][0038]
表2：引物序列
[0039]
[0040][0041]
实施例1：d-泛酸含量的hplc测定
[0042]
检测方法如下：
[0043]
色谱条件：c
18
柱(250
×
4.6mm，particle size 5μm，agilent technologies co.， santa clara，ca，usa)、检测波长：200nm、柱温：30℃；
[0044]
样品处理：将样品用超纯水稀释，保持d-泛酸含量在0.05g/l到0.40g/l 之间；
[0045]
流动相：乙腈/水/磷酸：(50/949/1)；
[0046]
数据采集时间：25min。
[0047]
实施例2：l-valine含量的测定
[0048]
检测方法如下：
[0049]
分析条件：hitachi custom ion exchange resin(4.6mm id
×
60mm*)、波长：570nm、 440nm、分离柱温度：57℃：反应柱温度：135℃。
[0050]
样品处理：将样品用超纯水稀释，保持l-valine含量在0.05g/l到0.4g/l 之间；
[0051]
流动相：b1(水700ml/柠檬酸钠6.19g/1m naoh/氯化钠5.66g/柠檬酸 19.8g/乙醇135ml)；r3(乙醇50ml/水950ml)。
和g220a-r对其进行定点突变，对突变后的pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行cleanup纯化、测核酸浓度，最终得到带有ilvc突变的ptrc99a-ilvc
g220a
质粒线性化载体片段。
[0066]
(2)将质粒ptrc99a-ilvc
g220a
转化至底盘菌dpan15，即得dpan17。以dpan16 为对照菌株，分别接种到10ml的lb培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1ml预培养物到装有50ml的ms培养基的500ml摇瓶中，然后在30℃、180rpm培养至发酵液中菌体弄得达到od
600
＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.2mm的iptg，继续培养48h；发酵结束后取1ml发酵液测定 od
600
的同时，取1ml发酵液于室温12000rpm离心3min，将发酵上清稀释5 倍，根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图3 所示。
[0067]
由图可见，通过对ilvc进行突变，构建重组质粒ptrc99a-ilvc
g220a
，对比于 dpan16菌株，d-泛酸效价产生有了较大提升，这说明对ilvc 220位密码子进行突变，可能会增强其异构酶活性，使酶分子能够更好的与底物2-酮泛解酸结合，由此造成d-泛酸产量提升。
[0068]
实施例5：d-泛酸生产菌株dpan18构建及摇瓶发酵
[0069]
以dpan15为出发菌株，使用定点突变，将大肠杆菌原始ilvc 225位密码子 ctg突变为gcg(参见seq id no.3)，使其编码的氨基酸从亮氨酸突变为丙氨酸，以此来改变酮醇酸还原异构酶对底物的偏好性。
[0070]
(1)重组质粒ptrc99a-ilvc
l225a
构建:以质粒ptrc99a-ilvc为模板，使用引物 l225a-f和l225a-r对其进行定点突变，对突变后的pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行clean up纯化、测核酸浓度，最终得到带有ilvc突变的ptrc99a-ilvc
l225a
质粒线性化载体片段。
[0071]
(2)将质粒ptrc99a-ilvc
l225a
转化至底盘菌dpan15，即得dpan18。以dpan16 为对照菌株，分别接种到10ml的lb培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1ml预培养物到装有50ml的ms培养基的500ml摇瓶中，然后在30℃、180rpm培养至发酵液中菌体弄得达到od
600
＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.2mm的iptg，继续培养48h；发酵结束后取1ml发酵液测定 od
600
的同时，取1ml发酵液于室温12000rpm离心3min，将发酵上清稀释5 倍，根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图4 所示。
[0072]
由图可见，通过对ilvc进行突变，构建重组质粒ptrc99a-ilvc
l225a
，对比于 dpan16菌株，d-泛酸效价产生有了较大提升，这说明对ilvc 225位密码子进行突变，可能会增强其异构酶活性，使酶分子能够更好的与底物2-酮泛解酸结合，由此造成d-泛酸产量提升。
[0073]
实施例6：d-泛酸生产菌株dpan19构建及摇瓶发酵
[0074]
以dpan15为出发菌株，使用定点突变，将大肠杆菌原始ilvc 226位密码子 tgc突变为gcg(参见seq id no.4)，使其编码的氨基酸从半胱氨酸突变为丙氨酸，以此来改变酮醇酸还原异构酶对底物的偏好性。
[0075]
(1)重组质粒ptrc99a-ilvc
c226a
构建:以质粒ptrc99a-ilvc为模板，使用引物 c226a-f和c226a-r对其进行定点突变，对突变后的pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行clean up纯化、测核酸浓度，最终得到带有ilvc突变的ptrc99a-ilvc
c226a
质粒线性化载体片段。
[0076]
(2)将质粒ptrc99a-ilvc
c226a
转化至底盘菌dpan15，即得dpan19。以dpan16 为对照菌株，分别接种到10ml的lb培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1ml预
培养物到装有50ml的ms培养基的500ml摇瓶中，然后在30℃、180rpm培养至发酵液中菌体弄得达到od
600
＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.2mm的iptg，继续培养48h；发酵结束后取1ml发酵液测定 od
600
的同时，取1ml发酵液于室温12000rpm离心3min，将发酵上清稀释5 倍，根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图5 所示。
[0077]
由图可见，通过对ilvc进行突变，构建重组质粒ptrc99a-ilvc
c226a
，对比于 dpan16菌株，d-泛酸效价产生有很大提升，这说明对ilvc 226位密码子进行突变，能够在增强其异构酶活性的同时减弱其还原酶活性，使酶分子能够更好的与底物2-酮泛解酸结合，由此造成d-泛酸产量提升。
[0078]
实施例7：d-泛酸生产菌株dpan20构建及摇瓶发酵
[0079]
以dpan15为出发菌株，使用定点突变，将大肠杆菌原始ilvc 396位密码子 ctg突变为gcg(参见seq id no.5)，使其编码的氨基酸从亮氨酸突变为丙氨酸，以此来改变酮醇酸还原异构酶对底物的偏好性。
[0080]
(1)重组质粒ptrc99a-ilvc
l396a
构建:以质粒ptrc99a-ilvc为模板，使用引物 l396a-f和l396a-r对其进行定点突变，对突变后的pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行clean up纯化、测核酸浓度，最终得到带有ilvc突变的ptrc99a-ilvc
l396a
质粒线性化载体片段。
[0081]
(2)将质粒ptrc99a-ilvc
l396a
转化至底盘菌dpan15，即得dpan20。以dpan16 为对照菌株，分别接种到10ml的lb培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1ml预培养物到装有50ml的ms培养基的500ml摇瓶中，然后在30℃、180rpm培养至发酵液中菌体弄得达到od
600
＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.2mm的iptg，继续培养48h；发酵结束后取1ml发酵液测定od
600
的同时，取1ml发酵液于室温12000rpm离心3min，将发酵上清稀释5 倍，根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图6 所示。
[0082]
由图可见，通过对ilvc进行突变，构建重组质粒ptrc99a-ilvc
l396a
，对比于 dpan16菌株，d-泛酸效价提升与dpan19大致相同，这说明对ilvc 396位密码子进行突变，能够与对226位密码子突变起到大致相同效果，使酶分子能够更好的与底物2-酮泛解酸结合，由此造成d-泛酸产量提升。
[0083]
实施例8：d-泛酸生产菌株dpan21构建及摇瓶发酵
[0084]
以dpan15为出发菌株，使用定点突变，将大肠杆菌原始ilvc 397位密码子att突变为gcg(参见seq id no.6)，使其编码的氨基酸从异亮氨酸突变为丙氨酸，以此来改变酮醇酸还原异构酶对底物的偏好性。
[0085]
(1)重组质粒ptrc99a-ilvc
i397a
构建:以质粒ptrc99a-ilvc为模板，使用引物 i397a-f和i397a-r对其进行定点突变，对突变后的pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行clean up纯化、测核酸浓度，最终得到带有ilvc突变的ptrc99a-ilvc
i397a
质粒线性化载体片段。
[0086]
(2)将质粒ptrc99a-ilvc
l396a
转化至底盘菌dpan15，即得dpan21。以dpan16 为对照菌株，分别接种到10ml的lb培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1ml预培养物到装有50ml的ms培养基的500ml摇瓶中，然后在30℃、180rpm培养至发酵液中菌体弄得达到od
600
＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.2mm的iptg，继续培养48h；发酵结束后取1ml发酵液测定 od
600
的同时，取1ml发酵液于室温12000rpm离心3min，将发酵上清稀释5 倍，根据实
施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图7 所示。
[0087]
由图可见，通过对ilvc进行突变，构建重组质粒ptrc99a-ilvc
i397a
，对比于dpan16菌株，d-泛酸效价提升较dpan19提升有些许降低，这说明对ilvc 397 位密码子进行突变，虽然能增强其异构酶活性，但相比于前两个，这种效果不是很大，但对比于dpan16，d-泛酸产量依然有较大提升。
[0088]
实施例9：d-泛酸生产菌株dpan22构建及摇瓶发酵
[0089]
以dpan15为出发菌株，使用定点突变，将大肠杆菌原始ilvc 412位密码子 gtt突变为gcg(参见seq id no.7)，使其编码的氨基酸从缬氨酸突变为丙氨酸，以此来改变酮醇酸还原异构酶对底物的偏好性。
[0090]
(1)重组质粒ptrc99a-ilvc
v412a
构建:以质粒ptrc99a-ilvc为模板，使用引物 v412a-f和v412a-r对其进行定点突变，对突变后的pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行clean up纯化、测核酸浓度，最终得到带有ilvc突变的ptrc99a-ilvc
v412a
质粒线性化载体片段。
[0091]
(2)将质粒ptrc99a-ilvc
v412a
转化至底盘菌dpan15，即得dpan22。以dpan16 为对照菌株，分别接种到10ml的lb培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1ml预培养物到装有50ml的ms培养基的500ml摇瓶中，然后在30℃、180rpm培养至发酵液中菌体弄得达到od
600
＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.2mm的iptg，继续培养48h；发酵结束后取1ml发酵液测定 od
600
的同时，取1ml发酵液于室温12000rpm离心3min，将发酵上清稀释5 倍，根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图8 所示。
[0092]
由图可见，通过对ilvc进行突变，构建重组质粒ptrc99a-ilvc
v412a
，对比于 dpan16菌株，d-泛酸效价提升在之前几株菌中达到了最高，这说明对ilvc 412 位密码子进行突变，能够显著增强其异构酶活性，使d-泛酸产量有显著提升。
[0093]
实施例10：d-泛酸生产菌株dpan23构建及摇瓶发酵
[0094]
以dpan15为出发菌株，使用定点突变，将大肠杆菌原始ilvc 413位密码子 atc突变为gcg(参见seq id no.8)，使其编码的氨基酸从异亮氨酸突变为丙氨酸，以此来改变酮醇酸还原异构酶对底物的偏好性。
[0095]
(1)重组质粒ptrc99a-ilvc
i413a
构建:以质粒ptrc99a-ilvc为模板，使用引物 i413a-f和i413-r对其进行定点突变，对突变后的pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行clean up纯化、测核酸浓度，最终得到带有ilvc突变的ptrc99a-ilvc
i413a
质粒线性化载体片段。
[0096]
(2)将质粒ptrc99a-ilvc
i413a
转化至底盘菌dpan15，即得dpan23。以dpan16 为对照菌株，分别接种到10ml的lb培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1ml预培养物到装有50ml的ms培养基的500ml摇瓶中，然后在30℃、180rpm培养至发酵液中菌体弄得达到od
600
＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.2mm的iptg，继续培养48h；发酵结束后取1ml发酵液测定 od
600
的同时，取1ml发酵液于室温12000rpm离心3min，将发酵上清稀释5 倍，根据实施例1和2进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量及发酵液中l-缬氨酸的积累量如图9所示。
[0097]
由图可见，通过对ilvc进行突变，构建重组质粒ptrc99a-ilvc
i413a
，对比于 dpan15菌株，发酵液中l-缬氨酸的积累量基本没变化，基本维持在1.1g/l左右，但d-泛酸产量却明
显提高，从4.72g/l提升至5.30g/l，这说明对ilvc 413 位密码子进行突变，能够提高酶对底物2-酮泛解酸的亲和力，使碳通量更多转向泛解酸途径，由此使d-泛酸产量有显著提升。
[0098]
实施例11：d-泛酸生产菌株dpan24构建及摇瓶发酵
[0099]
以dpan15为出发菌株，使用定点突变，将大肠杆菌原始ilvc 414位密码子 tct突变为gcg(参见seq id no.9)，使其编码的氨基酸从丝氨酸突变为丙氨酸，以此来改变酮醇酸还原异构酶对底物的偏好性。
[0100]
(1)重组质粒ptrc99a-ilvc
s414a
构建:以质粒ptrc99a-ilvc为模板，使用引物 s414a-f和s414a-r对其进行定点突变，对突变后的pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行clean up纯化、测核酸浓度，最终得到带有ilvc突变的ptrc99a-ilvc
s414a
质粒线性化载体片段。
[0101]
(2)将质粒ptrc99a-ilvc
s414a
转化至底盘菌dpan15，即得dpan24。以dpan16 为对照菌株，分别接种到10ml的lb培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1ml预培养物到装有50ml的ms培养基的500ml摇瓶中，然后在30℃、180rpm培养至发酵液中菌体弄得达到od
600
＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.2mm的iptg，继续培养48h；发酵结束后取1ml发酵液测定 od
600
的同时，取1ml发酵液于室温12000rpm离心3min，将发酵上清稀释5 倍，根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图10 所示。
[0102]
由图可见，通过对ilvc进行突变，构建重组质粒ptrc99a-ilvc
s414a
，对比于 dpan16菌株，d-泛酸效价提升效果并不是很大，说明对此位点进行突变，虽然能够使酶对底物的亲和力有些许改变，但这种改变并不明显。
[0103]
实施例12：d-泛酸生产菌株dpan25构建及摇瓶发酵
[0104]
以dpan15为出发菌株，使用定点突变，将大肠杆菌原始ilvc 416位密码子acc突变为gcg(参见seq id no.10)，使其编码的氨基酸从苏氨酸突变为丙氨酸，以此来改变酮醇酸还原异构酶对底物的偏好性。
[0105]
(1)重组质粒ptrc99a-ilvc
t416a
构建:以质粒ptrc99a-ilvc为模板，使用引物 t416a-f和t416a-r对其进行定点突变，对突变后的pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行clean up纯化、测核酸浓度，最终得到带有ilvc突变的ptrc99a-ilvc
t416a
质粒线性化载体片段。
[0106]
(2)将质粒ptrc99a-ilvc
t416a
转化至底盘菌dpan15，即得dpan25。以dpan16 为对照菌株，分别接种到10ml的lb培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1ml预培养物到装有50ml的ms培养基的500ml摇瓶中，然后在30℃、180rpm培养至发酵液中菌体弄得达到od
600
＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.2mm的iptg，继续培养48h；发酵结束后取1ml发酵液测定 od
600
的同时，取1ml发酵液于室温12000rpm离心3min，将发酵上清稀释5 倍，根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图11 所示。
[0107]
由图可见，通过对ilvc进行突变，构建重组质粒ptrc99a-ilvc
t416a
，对比于 dpan16菌株，d-泛酸效价提升虽然与dpan20提升效果大致相同，说明对ilvc 416位密码子进行突变，能够使碳通量更多转向了泛解酸途径，由此使d-泛酸产量有了较大提升。