一种NGF基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法

本发明属于生物工程，特别是涉及一种ngf基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法。

背景技术：

1、外泌体是一种细胞产生的纳米级囊泡，几乎被体内所有细胞释放和接收。外泌体可以在细胞之间转移，并包含各种与其来源和功能密切相关的分子组成，包括蛋白质、脂质和rna等。外泌体在细胞通讯中的重要性使其可以成为在全身传递各种药物的重要载体，其在循环系统中无处不在，可以通过各种生物屏障到达受伤或疾病的部位。由于其独特的结构和丰富的内含物，可用于疾病的诊断和治疗。

2、抗氧化领域是当今生命科学领域和社会领域的研究热点。神经生长因子(nervegrowth factor,ngf)是一种神经营养因子，在细胞周期、细胞代谢、及神经细胞损伤修复等生理活动中发挥着重要作用。ngf可以降低急性或慢性神经病变的风险。已有研究证实ngf具有促进神经恢复和新血管生成的作用。本发明应用基因编辑技术，通过构建含有ngf基因的载体在间充质干细胞中过表达使其外泌体高表达ngf基因，从而具有抗氧化作用。

技术实现思路

1、本发明主要解决的技术问题是提供一种ngf基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，可以有效替代间充质干细胞成为具有抗氧化作用的新型药物。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种ngf基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

3、1)构建含有目的基因的ngf表达载体；

4、2)将步骤1)所获得的ngf表达载体与vsvg包膜质粒、δr8.2包装质粒共转染293细胞，包装病毒，收集细胞上清；

5、3)用步骤2)收集的细胞上清感染间充质干细胞，使用嘌呤素药物筛选至少一周后，获取高表达ngf基因的人脐带间充质干细胞稳转细胞株；

6、4)用含有步骤3)收集的高表达ngf基因的人脐带间充质干细胞稳转细胞株的细胞液，利用peg6000提取外泌体，得到高表达ngf基因的人脐带间充质干细胞外泌体。

7、进一步地说，步骤2)中质粒共转染的比例为ngf表达载体:δr8.2:vsvg＝3:2:1。

8、进一步地说，步骤2)中收集上清后2000g离心5min，0.45um过滤器过滤。

9、进一步地说，步骤3)中感染间充质干细胞时细胞上清与mem培养基的体积比为1:3。

10、进一步地说，步骤3)中感染间充质干细胞前在培养基中加入100mg/ml鲑精蛋白。

11、进一步地说，步骤3)中嘌呤霉素药物筛选浓度为0.5μg/ml。

12、进一步地说，步骤3)中间充质干细胞为永生化人脐带间充质干细胞。

13、进一步地说，步骤4)中peg6000浓度为12％。

14、本发明的有益效果：本发明通过构建ngf的慢病毒载体在人脐带间充质干细胞中高表达进而使msc来源的外泌体ngf蛋白高表达，从而使其具有有效的抗氧化作用。

技术特征：

1.一种ngf基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种ngf基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤2)中质粒共转染的比例为ngf表达载体:δr8.2:vsvg＝3:2:1。

3.根据权利要求1所述的一种ngf基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤2)中收集上清后2000g离心5min，0.45um过滤器过滤。

4.根据权利要求1所述的一种ngf基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤3)中感染间充质干细胞时细胞上清与mem培养基的体积比为1:3。

5.根据权利要求1所述的一种ngf基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤3)中感染间充质干细胞前在培养基中加入100mg/ml鲑精蛋白。

6.根据权利要求1所述的一种ngf基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤3)中嘌呤霉素药物筛选浓度为0.5μg/ml。

7.根据权利要求1所述的一种ngf基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤3)中间充质干细胞为永生化人脐带间充质干细胞。

8.根据权利要求1所述的一种ngf基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤4)中peg6000浓度为12％。

技术总结
本发明公开了一种NGF基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：1)构建含有目的基因的NGF表达载体；2)将步骤1)所获得的NGF表达载体与vsvg包膜质粒、ΔR8.2包装质粒共转染293细胞，包装病毒，收集细胞上清；3)用步骤2)收集的细胞上清感染间充质干细胞，使用嘌呤素药物筛选至少一周后，获取高表达NGF基因的人脐带间充质干细胞稳转细胞株；4)用含有步骤3)收集的高表达NGF基因的人脐带间充质干细胞稳转细胞株的细胞液，利用PEG6000提取外泌体，得到高表达NGF基因的人脐带间充质干细胞外泌体。本发明通过构建NGF的慢病毒载体在人脐带间充质干细胞中高表达进而使MSC来源的外泌体NGF蛋白高表达，从而使其具有有效的抗氧化作用。

技术研发人员：崔恒宓,马嘉年,孙振
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15