嗜盐四联球菌嗜盐亚种及其应用的制作方法

1.本发明涉及食品发酵技术领域，具体而言，涉及一种嗜盐四联球菌嗜盐亚种及其应用。


背景技术：

2.随着对食品安全重视程度的增加，生物胺在中外传统发酵食品中的含量越来越受到关注。生物胺是一类具有生物活性的低分子量含氮有机化合物的总称，主要有组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺和亚精胺。生物胺存在于各种动植物的组织中，是生物活性细胞必不可少的组成部分，在调节核酸与蛋白质的合成及生物膜稳定性方面起着重要作用。适量的生物胺有助于人体正常的生理功能，但过量则会引起不良的生理反应。
3.在食品中，生物胺主要是微生物对氨基酸进行脱羧作用形成的，因此与环境中微生物的种类和数量紧密相关。而酱、酱油是利用微生物作用，经过制曲发酵而成的调味品，因此酱、酱油中的一些微生物可能会利用氨基酸代谢产生生物胺。市售酱油中的生物胺含量普遍介于200～2000 mg/l，并且以酪胺和组胺为主。国家标准中虽然没有对酱、酱油中的生物胺的限量规定，但从食品安全角度，对生物胺进行研究和认识，并积极寻找解决方式降低生物胺含量，可以为产品质量和安全保驾护航。
4.目前主要有以下三种降低生物胺的方法：一、外加化合物法。如发明专利申请（申请号cn201910058780.8）公开了一种向成曲中添加山梨酸钾来控制酱油生物胺含量的方法。发明专利申请（申请号cn 201910058795.4）公开了一种采用杨梅叶提取物控制酱油生物胺含量的方法。发明专利（授权公告号cn 102771752b）公开了一种添加甘氨酸和柠檬酸降低酱油生物胺含量的方法。
5.二、降低发酵温度法。发明专利申请（申请号cn201811239914.8）公开了一种通过调控温度降低酱油生物胺含量的方法。其通过控制酱油酱醪0～30天发酵温度为30℃，之后发酵温度为18~20℃，最终所得酱油中生物胺总量皆在100mg/l以下，且生物胺总量比空白组降低40％以上。
6.三、生物学方法。目前已报道的具有降生物胺作用的或不产生物胺的菌株，主要用于香肠、泡菜或黄酒等的发酵，用于酱及酱油发酵的较少。如发明专利（授权公告号cn 109182188b）公开了一株植物乳杆菌用于发酵剂制备发酵香肠时，所得发酵香肠在腌制或发酵过程中不产生生物胺，且香肠成熟后，其酪胺浓度显著低于现有技术。发明专利（授权公告号cn 109401998b）公开了一株明登乳杆菌菌株，其降胺能力良好，可明显降低浸米过程中生物胺的含量，减少带入黄酒发酵体系的生物胺。
7.其中，外加化合物的方法控制生物胺存在二次风险并且可能影响酱油品质，而通过改变发酵温度的方式会对酱油原有风味产生较大影响。生物学方法是目前降低食品生物胺的主要方法。但酱、酱油微生物群落结构复杂，发酵盐度较其他食品高，且生物胺降解反应是在胺氧化酶作用下发生的需氧反应，而酱醪发酵环境偏厌氧。因此，生物胺降解菌株很难用于酱及酱油的实际生产过程。筛选能适合于酱和酱油酱醪发酵，不产生物胺同时又能
抑制产生物胺微生物生长的菌株，对于生产健康安全的酱及酱油具有重要意义。


技术实现要素：

8.本发明旨在提供一种嗜盐四联球菌嗜盐亚种及其应用，在不需要添加其他化合物的情况下，降低酱、酱油中生物胺含量。为了实现上述目的，本发明一方面提供了一株嗜盐四联球菌嗜盐亚种，嗜盐四联球菌嗜盐亚种命名为菌株sp101，2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为cgmcc no. 23611，分类命名为嗜盐四联球菌 tetragenococcus halophilus。
9.本发明另一方面提供了上述嗜盐四联球菌嗜盐亚种在酱油或酿造酱酿造中的应用。
10.进一步地，包括：将成曲和盐水混合制成酱醪，将菌株sp101接种至发酵0~15天的酱醪进行酱油或酿造酱生产发酵，接种量为106～107个/g酱醪。
11.进一步地，酱油生产发酵包括：前期发酵温度8~10℃，发酵1~1.5个月；中期发酵温度为20~25℃，发酵时间为2.5~3个月；后期发酵温度为30~32℃，时间为1~2个月，前期发酵、中期发酵和后期发酵总计密闭发酵6个月；优选的，用于生产酱油的酱醪中，所用盐水的浓度为16~20%，成曲和盐水按重量比1:1~1:1.5混合。
12.进一步地，酿造酱生产发酵包括：发酵温度维持25~35℃，发酵时间为70~100天；优选的，用于生产酿造酱的酱醪中，所用盐水的浓度为20.5%~23.5%；盐水的添加量为成曲重量的0.9~1.5倍。
13.进一步地，在接种前，还包括菌株活化的步骤，活化包括：将菌株sp101接种于含有10％~20%盐的mrs培养基，并在30~35℃的温度及厌氧条件下进行培养，时间为48h~72h。
14.进一步地，用于生产酱油的成曲通过以下步骤制备得到：酱油制曲包括：将预处理后的脱脂大豆和炒麦按照1:1~1:1.5混合，接种米曲霉后在28~40℃下进行制曲40~42h，得到酱油成曲；优选的，脱脂大豆的预处理包括：将脱脂大豆清洗后，温度控制115~120℃，压力控制0.05~0.15mpa，蒸煮8~10分钟；炒麦的预处理包括：温度控制300~400℃，压力控制0.01~0.05mpa，炒麦后水分控制在0.5~1％，最后进行粉碎，粉碎后颗粒大小为20~100目。
15.进一步地，用于生产酿造酱的成曲通过以下步骤制备得到：酿造酱制曲包括：将预处理后的大豆和/或小麦粉按照1:10~1:1混合，接种米曲霉后在28~35℃下进行制曲38~45h，得到酿造酱成曲；优选的，大豆的预处理包括：大豆清洗后，温度控制98~120℃，蒸煮8~10分钟；小麦粉的预处理包括：在温度为98~120℃，蒸煮20~30s，水分控制在22％~24％。
16.本发明还提供了一种酱油。该酱油为采用上述嗜盐四联球菌嗜盐亚种进行酱油酿造得到的，酱油的生物胺含量在100mg/l以下。
17.本发明还提供了一种酿造酱，酿造酱为采用上述嗜盐四联球菌嗜盐亚种进行酿造酱酿造得到的，酿造酱的生物胺含量在100mg/l以下。
18.应用本发明的技术方案，在酱、酱油发酵过程中接种上述嗜盐四联球菌嗜盐亚种，无需改变原有的发酵控制工艺即可抑制酱醪中的产胺菌的生长代谢，显著降低酱、酱油的生物胺含量，并赋予豆酱、酱油优良的风味。
具体实施方式
19.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
20.本发明通过下述技术方案实现：根据本发明一种典型的实施方式，提供一株嗜盐四联球菌嗜盐亚种tetragenococcus halophilus subsp. halophilus sp101，用于酱、酱油生产工艺，以降低其生物胺含量。
21.嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus sp101，分离自发酵2个月的酱油酱醪。其获得方法为：使用含10%盐的mrs培养基，采用梯度稀释法进行分离培养，挑取长势较好的菌株进行初筛，将初筛菌株增菌后，分别按1%接种量接种于发酵0天的酱油酱醪中，发酵结束后通过高效液相法检测生物胺含量进行复筛，最终获得能降低生物胺的菌株sp101、sp102，分子生物学鉴定结果显示，两株菌均为嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus，其中sp101降低生物胺的效果更好。
22.sp101菌株特性研究如下：将菌株sp101接种在含10%盐的mrs平板上，30℃厌氧培养4d，菌落呈乳白色，圆形凸起，不透明，边缘整齐；显微镜下观察菌体呈球状，成对或成四联状排列，革兰氏染色阳性。氨基酸脱羧酶反应结果显示，其不具有酪胺酸和组氨酸脱羧酶活性，即不产生酪胺和组胺。，将菌株sp101按2%的接种量分别接种至含10%、14%、18%、20%、22%、24%盐浓度的mrs肉汤中，30℃静置培养48h，其od
600nm
值均大于1，说明菌株sp101能在10%~24%盐浓度下生长繁殖，将其接种至酱醪后能迅速适应酱醪环境，并生长繁殖。
23.根据本发明一种典型的实施方式，菌株sp101的应用包括：将成曲和盐水混合制成酱醪，将菌株sp101接种至发酵0~15天的酱醪进行酱油或酿造酱生产发酵，接种量为106～107个/g酱醪。
24.在酱、酱油发酵过程中接种嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus sp101（即保藏存活证明中的sp101，嗜盐四联球菌tetragenococcus halophilus），无需改变原有的发酵控制工艺，该菌株即可抑制酱醪中的产胺菌的生长代谢，显著降低酱、酱油的生物胺含量，并赋予豆酱、酱油优良的风味。优选的，酱油生产发酵包括：前期发酵温度8~10℃，发酵1.5个月；中期发酵温度为20~25℃，发酵时间为2.5~3个月；后期发酵温度为30~32℃，时间为1~2个月，前期发酵、中期发酵和后期发酵总计密闭发酵6个月；优选的，用于生产酱油的酱醪中，所用盐水的浓度为16~20%，成曲和盐水按重量比1:1~1:1.5混合。优选的，酿造酱生产发酵包括：发酵温度维持25~35℃，发酵时间为70~100天；优选的，用于生产酿造酱的酱醪中，所用盐水的浓度为20.5%~23.5%；盐水的添加量为成曲重量的0.9~1.5倍。如此工艺下生产的酱油或酿造酱风味优良。
25.为了提高菌株的发酵活性，在接种前，还包括菌株活化的步骤，活化包括：将菌株sp101接种于含有10％~20%盐的mrs肉汤（北京陆桥，货号cm187），并在30~35℃的温度下静置培养，时间为48h~72h。
26.根据本发明一种典型的实施方式，用于生产酱油的成曲通过以下步骤制备得到：酱油制曲包括：将预处理后的脱脂大豆和炒麦按照1:1~1:1.5混合，接种米曲霉（可以是本领域中常规使用的任何米曲霉）后在28~40℃下进行制曲40~42h，得到酱油成曲；优选的，脱脂大豆的预处理包括：将脱脂大豆清洗后，温度控制115~120℃，压力控制0.05~0.15mpa，蒸
煮8~10分钟；炒麦的预处理包括：温度控制300~400℃，压力控制0.01~0.05mpa，炒麦后水分控制在0.5~1％，最后进行粉碎，粉碎后颗粒大小为20~100目。经过预处理后，米曲霉能够充分与原料接触，从而提高原料的利用能力。
27.根据本发明一种典型的实施方式，用于生产酿造酱的成曲通过以下步骤制备得到：酿造酱制曲包括：将预处理后的大豆和/或小麦粉按照1:10~1:1混合，接种米曲霉（可以是本领域中常规使用的任何米曲霉）后在28~35℃下进行制曲38~45h，得到酿造酱成曲；优选的，大豆的预处理包括：大豆清洗后，温度控制98~120℃，蒸煮8~10分钟；小麦粉的预处理包括：在温度为98~120℃，蒸煮20~30s，水分控制在22％~24％。经过预处理后，米曲霉能够充分与原料接触，从而提高原料的利用能力。
28.根据本发明的再一方面，提供了一种酱油。该酱油由上述嗜盐四联球菌嗜盐亚种在酱油酿造中的应用制备得到，酱油的生物胺含量在100mg/l以下。
29.根据本发明的又一方面，提供了一种酿造酱，酿造酱由上述嗜盐四联球菌嗜盐亚种在酿造酱酿造中的应用制备得到，酿造酱的生物胺含量在100mg/l以下。
30.下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
31.下列实施例中，酱油的成曲通过以下步骤制备得到：脱脂大豆的预处理包括：将脱脂大豆清洗后，温度控制115~120℃，压力控制0.05~0.15mpa，蒸煮9分钟；炒麦的预处理包括：温度控制300~400℃，压力控制0.01~0.05mpa，炒麦后水分控制在0.8％，最后进行粉碎，粉碎后颗粒大小为20~100目。将预处理后的脱脂大豆和炒麦按照1:1.5混合，接种米曲霉后在28~40℃下进行制曲42h，得到酱油成曲。
32.酿造酱的成曲通过以下步骤制备得到：大豆的预处理包括：大豆清洗后，温度控制98~120℃，蒸煮9分钟；小麦粉的预处理包括：在温度为98~120℃，蒸煮200s，水分控制在22％。将预处理后的大豆和/或小麦粉按照1:2混合，接种米曲霉后在28~35℃下进行制曲38h，得到酿造酱成曲。
33.菌株活化包括：将菌株接种于含有10％盐的mrs培养基，并在30~35℃的温度及厌氧条件下进行培养，时间为48h。
34.实施例1菌株sp101降低酱油生物胺的效果将嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus sp101活化培养后，以接种量为106个/g酱醪分别接种于发酵0天的酱油酱醪（酱醪由成曲和浓度17%的盐水按重量比1:1.5混合），作为实验组1，将嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus sp102活化培养后，以接种量为106个/g酱醪分别接种于同一批次发酵0天的酱醪，作为实验组2；以不接种sp101的同一批次的0天酱醪为对照组。实验组和对照组均按照常规的高盐稀态酱油的发酵过程进行控制（前期发酵温度8~10℃，发酵1.5个月；中期发酵温度为20~25℃，发酵时间为2.5个月；后期发酵温度为30~32℃，时间为2个月）。发酵6个月后，将发酵产物压榨，提取生酱油，巴氏杀菌后获得酱油原汁。采用高效液相法参照《gb 5009.208-2016 食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》检测其生物胺含量，并参照《gb 5009.235-2016 食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》检测氨基酸态氮含量。与对照组相比，实验组1和实验组2酪胺和组胺含量均明显降低，且实验组1的酪胺和组胺含量更低，说明sp101和sp102均具有降低酱油生物胺含量的作用，且sp101降低生物胺的效果更
好。此外，实验组1的氨基酸态氮含量显著高于对照组，说明接种sp101，在降低酱油生物胺的同时，提升了氨基酸态氮的含量。具体检测结果见表1。
35.表1：酱油原汁生物胺及氨基酸态氮含量备注：nd表示未检出，检出限为50 mg/kg。
36.实施例2菌株sp101在酱油酱醪中对产胺菌的抑制作用取发酵0天的高盐稀态酱油酱醪（同实施例1的酱油酱醪），将实验室自行分离的产胺菌（嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus sp133）与嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus sp101分别进行活化培养，先接种产胺菌，接种量为104～105个/g酱醪，再接种sp101，接种量为106个/g酱醪，作为实验组1；先接种产胺菌，接种量为104～105个/g酱醪，再接种sp102，接种量为106个/g酱醪，作为实验组2；以仅接种产胺菌，接种量为104～105个/g酱醪的同一批次的发酵0天酱醪做对照组1，以未接种菌株的同一批次的发酵0天酱醪作为对照组2。实验组和对照组均按照常规正常的高盐稀态酱油醪的发酵过程进行控制（前期发酵温度8~10℃，发酵1.5个月；中期发酵温度为20~25℃，发酵时间为2.5个月；后期发酵温度为30~32℃，时间为2个月）。发酵6个月结束后，将发酵产物压榨，提取生酱油，巴氏杀菌后获得酱油原汁。酱醪压榨、杀菌后获得原汁，采用高效液相法参照《gb 5009.208-2016 食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》检测其生物胺含量，并参照《gb 5009.235-2016 食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》检测与氨基酸态氮含量。对照组1因接种了产胺菌，酪胺含量较对照组2显著提升。与对照组1相比，实验组1和实验组2的酱醪酪胺和组胺含量均明显降低，说明sp101和sp102均可对产胺菌产生一定的抑制作用，其中实验组1的酪胺和组胺含量比对照组2更低，说明对产胺菌的抑制作用更强，降低生物胺的含量的效果更好。因sp101抑制了产胺菌的生长代谢，减少了氨基酸脱羧生成生物胺，因此其发酵的酱油原汁中氨基酸态氮含量更高。具体检测结果见表2。
37.表2：酱油原汁生物胺及氨基酸态氮含量备注：nd表示未检出，检出限为50 mg/kg。
38.实施例3菌株sp101降低发酵酱生物胺的效果取发酵0天的豆瓣酱酱醪（酱醪由成曲和浓度为22%的盐水按照重量比1：1混合），将嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus sp101活化培养后，以接种量为106个/g酱醪分别接种于发酵0天的酱醪，作为实验组1；将嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus sp102活化培养后，以接种量为106个/g酱醪分别接种于发酵0天的酱醪，作为实验组2；以不接种sp101的酱醪为对照组。实验组和对照组均按照正常的豆瓣酱发酵工艺过程进行控制（发酵温度维持25~30℃，发酵时间为90天）。发酵结束后，将豆瓣酱巴氏杀菌后获得原酱，采用高效液相法参照《gb 5009.208-2016 食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》检测其生物胺含量，并参照《gb 5009.235-2016 食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》检测与氨基酸态氮含量。与对照组相比，实验组1和实验组2酪胺和组胺含量均明显降低，说明sp101和sp102均有降低发酵酱生物胺含量的作用。其中实验组1的酪胺和组胺含量更低，说明sp101降低生物胺的效果更好。具体检测结果见表3。
39.表3：酱油原汁生物胺及氨基酸态氮含量备注：nd表示未检出，检出限为50 mg/kg。
40.实施例4菌株sp101用于酱、酱油发酵对产品风味的影响对实施例1中的酱油原汁和实施例3中的原酱进行感官品评。挑选12位内部专业的品评人员，从体态、色泽、香气、酸味、甜味、苦味、咸味、鲜味、酱香味和综合口感进行评价打分，其中分值为0-5分，分数越高，说明该项指标越好。结果如表4、表5所示。
41.表4数据显示，从单项感官维度来看，实验组1、实验组2和对照组无显著差异，但从综合口感评分来看，实验组1优于实验组2和对照组。说明将菌株sp101用于酱油发酵，能使酱油的风味更协调，赋予酱油良好的风味。
42.表5数据显示，实验组1的酸味和甜味两项评分明显高于实验组2和对照组，品评人员反馈，对照组和实验组2偏酸，导致其酸味和甜味评分受影响，而实验组1酸甜度适宜。可能的原因是菌株sp101在抑制酱醪中产胺菌的同时，也抑制了酱醪中部分产酸菌的生长代谢。且综合口感评分也显示，实验组1的综合口感最好。综上，感官评分数据表明菌株sp101用于酱发酵，也能赋予酱良好的风味。
43.表4：菌株sp101对酱油风味的影响
表5：菌株sp101对酱风味的影响从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：发明专利申请（申请号cn202010259690 .8）公开了一种运用栅栏技术抑制产胺菌积累生物胺的方法，采用盐度及植物乳杆菌组合的方式，形成对产胺菌株的多重抑制，从而降低生物胺含量。发明专利（授权公告号cn110499271b）公开了植物乳杆菌qr19与鲁氏接合酵母s96复合接种用于酱油生产工艺，降低酱油生物胺含量的同时提高sod活性。发明专利（授权公告号cn109938243b）利用木糖葡萄球菌和嗜盐四联球菌联合发酵，控制酱油中氮代谢危害物。
44.与发明专利申请（申请号cn202010259690.8）相比，本发明无需通过提高盐度，仅
通过嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus sp101即可达到对产胺菌株的抑制的作用，因无需提高发酵盐度，本发明的成本更低，且发酵体系盐度不变，发酵过程中的微生物受影响较小，因此对产品的风味特点影响较小。
45.发明专利（授权公告号cn110499271b）和发明专利（授权公告号cn109938243b）均为两株菌联合使用达到降低酱油生物胺的效果，本发明使用的嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus sp101能耐受10%~24%盐浓度，能在厌氧条件下生长繁殖，在酱油酱醪中具有很好的适应性，仅使用此菌株即可达到对产胺菌的抑制作用，从而降低酱油生物胺含量。与接种两株菌相比，使用单菌株的增菌成本更低，发酵工艺过程控制更为便利。此外，该菌株能耐受10%~24%盐浓度，不仅可用于降低酱油的生物胺含量，还可用于降低发酵酱的生物胺含量，该菌株的应用范围更广，因此本发明具有显著的优越性。
46.综上，上述专利申请及专利使用微生物联合栅栏技术或使用两株菌才能达到降低酱油生物胺的效果。与上述技术相比，本发明仅使用嗜盐四联球菌嗜盐亚种t. halophilus subsp. halophilus sp101即可达到对产胺菌株的抑制，降低生物胺的含量，同时因减少了氨基酸脱羧生成生物胺，提升了氨基酸态氮含量，同时赋予酱、酱油优良的风味。
47.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。