一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法

一种基于cp8基因的猫滴虫病的实时荧光pcr诊断方法
技术领域
1.本发明涉及病毒检测领域，确切地说是一种基于cp8基因的猫滴虫病的实时荧光pcr诊断方法。


背景技术：

2.猫滴虫除了寄生胃肠道外，也可寄生在猫的泌尿生殖道中，导致猫子宫积脓，但在已经接受过卵巢子宫切除术或去势术治疗的健康猫中尤其罕见。滴虫体外虫体培养也是一种猫滴虫病敏感性特别强的检测手段，常用的体外商品化培养系统有两种，tf培养系统和改良的diamond培养基。但由于价格昂贵加之培养技术困难且耗时较长，故不适合大量推广使用。急需建立一种快速、敏感的猫滴虫病检测手段以供临床所需。本研究以重组质粒标准品cp8-pucm-t vector为模板，通过对一系列反应条件的优化，建立一种猫滴虫sybr greenⅰ实时荧光定量pcr诊断方法，有望为临床猫滴虫病的诊断提供一种更快速、更准确的检测手段。
3.实时荧光定量pcr是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析的方法。real-time pcr是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。sybr greenⅰ法就是在pcr反应体系中，加入过量sybr荧光染料，sybr荧光染料特异性地掺入dna双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的sybr染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步。序列的扩增程度(得率)取决于模板起始量，pcr常用于对样品中的dna进行定量，其中，最常见的应用是基因表达定量。终点pcr方法虽然可行，但它存在一重大缺点，即需要通过凝胶电泳确定得率，从而限制了检测灵敏度。此外，定量是在pcr末期进行的，而此时的扩增已达到平台期，因此，dna凝胶染色强度无法与dna起始量呈线性相关。尽管如此，若在到达平台期之前通过终点pcr对基因表达进行半定量分析，可使用连续稀释的dna样品作为起始物，或收集指定pcr循环的扩增子，并根据凝胶染色强度估计基因表达量。直到1993年，higuchi等报道称使用荧光信号对pcr扩增进行实时监测，才克服了终点pcr定量的局限性[8]。这一技术为我们今天所熟知的定量pcr(qpcr)奠定了基础。1997年，第一款qpcr仪进入市场，使pcr能够准确定量基因表达和拷贝数。qpcr依靠对指数期目的片段扩增荧光信号的实时监测，克服了终点pcr定量的缺点。尽管qpcr能够定量检测相对和绝对基因表达，但是其检测能力限制了定量性能。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于针对现有缺陷，提供一种对猫滴虫病的早期诊断和流行病学调查提供了一种基于cp8基因的猫滴虫病的实时荧光pcr诊断方法。
[0005]
上述目的通过以下方案实现：
[0006]
一种基于cp8基因的猫滴虫病的实时荧光pcr诊断方法，其特征在于，包括以下步
骤
[0007]
(1)引物设计与合成
[0008]
根据基因序列表所得序列，应用primer primer 5.0软件设计一对特异性引物，f2：5'-acaagttcgctgctatgaccc-3'，r2：5'-aacaacgcccttttcacgcc-3'，扩增预期片段大小为137bp，引物经primer-blast初步验证，后进行合成；
[0009]
(2)制备猫滴虫dna标准模板cp8-pucm-t vector质粒标准品；
[0010]
(3)荧光定量pcr反应
[0011]
反应总体系20μl，其中sybr greenⅰmaster荧光染料10μl，10μmol/μl上下游引物各0.4μl，cp8-pucm-t vector标准品模板2μl，用ddh2o补足至20μl；反应程序为：首先95℃预变性3min，95℃5s，59.3℃30s，65℃5s，共40个循环，最后95℃延伸5min，。
[0012]
所述的一种基于cp8基因的猫滴虫病的实时荧光pcr诊断方法，其特征在于，所述的猫滴虫dna标准模板cp8-pucm-t vector质粒标准品的制备方法为：将经显微镜检查确诊为猫滴虫感染的阳性粪便，严格按照粪便全基因提取试剂盒说明书提取猫球虫总基因组dna，后用引物f2、r2进行普通pcr扩增，回收目的片段，连接pucm-t vector克隆载体，转化至dh5a大肠杆菌感受态细胞中，涂板、通过含有氨苄抗性的lb固体培养基筛选，挑取单菌落至含有氨苄抗性的lb液体培养基中扩大培养，菌液pcr鉴定后阳性菌液提取重组质粒cp8-pucm-t vector，进行测序，测序正确的阳性质粒采用酶标仪测定浓度，换算拷贝数，-18到-22℃保存备用，即得。
[0013]
所述的一种基于cp8基因的猫滴虫病的实时荧光pcr诊断方法，其特征在于，所述的猫滴虫dna标准模板cp8-pucm-t vector质粒标准品质粒浓度为24ng/μl，换算其拷贝数为2.37
×
10
10
copies/μl。
[0014]
本技术的有益效果为：本研究采用sybr greenⅰ法建立猫滴虫实时荧光定量pcr诊断方法，通过对荧光定量pcr各反应体系及条件进行了优化，比传统显微镜检测更敏感、迅速，提高了该病的诊断效率。对临床样本进行荧光定量pcr检测，阳性率为85.00％(17/20)，而显微镜检测阳性率为65.00％(10/20)，二者检测的阳性符合率为100％。本实验所建立的荧光定量pcr方法为基层兽医部门对猫滴虫病的早期诊断和流行病学调查提供了一种更为有效可靠的检测办法。
附图说明
[0015]
图1为建立荧光定量pcr的标准曲线图；
[0016]
图2为特异性试验结果图；
[0017]
图中1：猫滴虫2-5：贾第虫、球虫、冠状病毒、细小病毒6：阴性对照
[0018]
1：t.foetus 2-5：giardia felis、isospora felis、feline coronavirus、feline parvovirus
[0019]
6：ddh2o；
[0020]
图3为敏感性试验结果图；
[0021]
1-10：模板浓度2.37
×
10
10
copies/μl～2.37
×
101copies/μl 11：阴性对照
[0022]
1-10：template concentration 2.37
×
10
10
copies/μl～2.37
×
101copies/μl
[0023]
11：ddh2o。
具体实施方式
[0024]
实施例1、
[0025]
1材料
[0026]
1.1样品
[0027]
重组质粒标准品cp8-pucm-t vector由前面实验制备保存。
[0028]
1.2试剂
[0029]
genious 2x sybr green fast qpcr mix购自abclonal公司。
[0030]
1.3仪器与设备
[0031]
荧光定量pcr仪购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司(bio-rad)。
[0032]
2方法
[0033]
2.1引物设计与合成
[0034]
测序所得的序列，应用primer primer 5.0软件设计一对特异性引物，f2：5'-acaagttcgctgctatgaccc-3'，r2：5'-aacaacgcccttttcacgcc-3'，扩增预期片段大小为137bp，引物经primer-blast初步验证，后送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0035]
2.2重组质粒标准品的制备
[0036]
制备猫滴虫dna标准模板cp8-pucm-t vector质粒。
[0037]
制备方法为：将经显微镜检查确诊为猫滴虫感染的阳性粪便，严格按照粪便全基因提取试剂盒说明书提取猫球虫总基因组dna，后用引物f2、r2进行普通pcr扩增，回收目的片段，连接pucm-t vector克隆载体，转化至dh5a大肠杆菌感受态细胞中，涂板、通过含有氨苄抗性的lb固体培养基筛选，挑取单菌落至含有氨苄抗性的lb液体培养基中扩大培养，菌液pcr鉴定后阳性菌液提取重组质粒cp8-pucm-t vector，进行测序，测序正确的阳性质粒采用酶标仪测定浓度，换算拷贝数，-18到-22℃保存备用，即得。
[0038]
2.3荧光定量pcr反应条件的优化以浓度为2.37
×
109copies/μl的重组质粒标准品为模板，采用矩阵法分别对引物浓度(5μmol/μl、10μmol/μl、15μmol/μl、20μmol/μl、25μmol/μl)和退火温度(54.9℃、57.3℃、59.3℃、60.4℃、61.0℃)进行优化，摸索最佳反应条件。
[0039]
2.4标准曲线建立
[0040]
将已经制备好的重组质粒cp8-pucm-t vector标准品10倍倍比稀释(2.37
×
1010copies/μl～2.37
×
10copies/μl)，在最佳反应条件下进行荧光定量pcr扩增，选择连续5个浓度，建立标准曲线。
[0041]
2.5特异性试验以制备好的重组质粒cp8-pucm-t vector标准品为试验样本，以猫贾第虫基因组dna、猫滴虫基因组dna、猫冠状病毒基因组dna、猫冠状病毒基因组cdna为对照样本，同时以双蒸水作为阴性对照。采用建立的荧光定量pcr方法进行扩增，检测本研究建立的荧光定量pcr方法的特异性。
[0042]
2.6敏感性试验以前面稀释好的重组质粒cp8-pucm-t vector标准品(6.26
×
1010copies/μl～6.26
×
101copies/μl)作为模板，同时以双蒸水作为阴性对照。采用荧光定量pcr扩增，检测本研究建立的荧光定量pcr方法的检测下限。
[0043]
2.7重复性试验以同一批制备的重组质粒cp8-pucm-t vector标准品的不同浓度(6.26
×
107copies/μl、6.26
×
106copies/μl、6.26
×
105copies/μl)的样品作为模板，采用
qpcr
[0062][0063]
3.7临床样品检测试验结果
[0064]
应用本试验荧光定量pcr方法对20份临床样品dna进行检测。同时，与本文普通pcr诊断方法和传统显微镜检查进行对比。结果显示：荧光定量pcr检测阳性率为85.00％(17/20)，普通pcr诊断方法的阳性率为80.00％(16/20)；而传统显微镜检查阳性率仅为65.00％(13/20)，并且显微镜检测和普通pcr检测为阳性的样本经荧光定量pcr检测均为阳性，这表明本文所建立的方法较传统显微镜检测和普通pcr检测更准确、更敏感。
[0065]
3.8分析与讨论
[0066]
本研究采用sybr greenⅰ法建立猫滴虫实时荧光定量pcr诊断方法，通过对荧光定量pcr各反应体系及条件进行了优化，比传统显微镜检测更敏感、迅速，提高了该病的诊断效率。对20份临床样本进行荧光定量pcr检测，阳性率为85.00％(17/20)，而显微镜检测阳性率为65.00％(10/20)，二者检测的阳性符合率为100％。本实验所建立的荧光定量pcr方法为基层兽医部门对猫滴虫病的早期诊断和流行病学调查提供了一种更为有效可靠的检测办法。
[0067]
实施例2、显微镜检测和普通pcr诊断方法如下：
[0068]
猫滴虫病可引起猫慢性腹泻，出血性肠炎等消化道疾病，严重危害猫的健康。对该病的诊断临床上最常用的是显微镜虫体检测及胶体金检测，但由于虫体镜检敏感性较低，而胶体金商品价格昂贵，都不利于对该病的诊断。本研究以t.foetus cp8基因为目的基因，通过对反应条件的优化，建立一种快速、准确、敏感的pcr诊断方法，所建立的方法特异性高，敏感性较强，有望为临床猫滴虫病的诊断提供一种快速准确的检测手段。
[0069]
2.1材料
[0070]
2.1.1样品
[0071]
所有阳性粪便样品均来自银川某动物医院。其中猫贾第虫基因组dna、猫球虫基因组dna、猫冠状病毒基因组dna、猫冠状病毒基因组cdna来自于临床确诊病例粪便中提取的基因组，由本实验室保存。
[0072]
2.1.2试剂与耗材
[0073]
粪便全基因提取试剂盒stool dna kit d4015购自omega bio-tek公司、sanprep柱式dna胶回收试剂盒、sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒、pucm-t vector克隆载体、dna分子量标准marker(100-2000bp)、dh5a大肠杆菌感受态细胞等均购自生工生物工程(上海)股份有限公司、premix taq
tm
(takara taq
tm
version 2.0 plus dye)购自宝生物工程
(大连)有限公司、0.9％生理盐水。
[0074]
2.1.3主要仪器
[0075]
pcr仪、凝胶成像系统购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司(bio-rad)，凝胶电泳仪，酶标仪购自普朗医疗。
[0076]
2.2方法
[0077]
2.2.1粪便处理及虫体镜检
[0078]
用棉签刮取猫直肠部分稀便，在含有1ml 0.9％生理盐水的2ml离心管中搅拌，使棉签上的粪便完全溶于0.9％生理盐水中，轻微震荡混匀，用镊子吸取适量悬液滴在洁净的玻璃板上，置于显微镜下观察；观察完后将其均匀的涂抹开，用瑞氏染色试剂盒对其染色，固定，再次置于显微镜下观察。
[0079]
2.2.2引物设计与合成
[0080]
根据genbank上已登录的猫三毛滴虫cp8不完整基因序列(ef610628.1)，应用primer primer 5.0软件设计一对特异性pcr引物，引物f1：5'-atgtttgcagttcttgcttccctcg-3'；r1：5'-ttgaagcgataccgcattggttgtc-3'，扩增预期片段大小为925bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0081]
2.2.3猫滴虫dna标准模板的制备
[0082]
将经显微镜检查确诊为猫滴虫感染的阳性粪便，严格按照粪便全基因提取试剂盒说明书提取猫球虫总基因组dna，后用引物f、r进行普通pcr扩增，回收目的片段，连接pucm-t vector克隆载体，转化至dh5a大肠杆菌感受态细胞中，涂板、通过含有氨苄抗性的lb固体培养基筛选，挑取单菌落至含有氨苄抗性的lb液体培养基中扩大培养，菌液pcr鉴定后阳性菌液提取重组质粒cp8-pucm-t vector，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序正确的阳性质粒采用酶标仪测定浓度，换算拷贝数，-20℃保存备用。
[0083]
2.2.4 pcr最佳退火温度筛选
[0084]
以制备的猫滴虫阳性重组质粒cp8-pucm-t vector为模板，用引物f1、r1进行pcr扩增，反应体系如下：
[0085][0086]
扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应。退火温度梯度为56℃～62℃。2.2.4扩增产物胶回收与测序
[0087]
用胶回收试剂盒对pcr产物进行回收，亚克隆至pucm-t vector载体，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序成功的结果在ncbi中进行blast鉴定。
[0088]
2.2.5特异性试验
[0089]
以阳性重组质粒cp8-pucm-t vector为试验样本，以猫贾第虫基因组dna、猫滴虫基因组dna、猫冠状病毒基因组dna、猫冠状病毒基因组cdna为对照样本，进行pcr扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析结果。
[0090]
2.2.6敏感性试验
[0091]
将阳性重组质粒cp8-pucm-t vector以10倍为梯度连续稀释成8个不同浓度，按照最适退火温度进行pcr扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析结果，并对比其敏感性。
[0092]
2.2.7稳定性试验
[0093]
取分别放置于-20℃3个月、6个月、9个月、12个月的cp8-pucm-t vector作为模板，进行pcr扩增检测，每组实验做三个重复，扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳观察。
[0094]
2.2.8临床样本检测试验
[0095]
对来自于银川某动物医院的20份腹泻猫粪便样品均按照粪便全基因提取试剂盒说明书提取基因组dna。并应用所建立的pcr方法对其进行检测。同时，与显微镜检查进行对比，比较检出率与符合率。
[0096]
2.3结果
[0097]
2.3.1镜检特点
[0098]
新鲜粪便悬液滴加在载玻片上，可以看见大量的虫体在快速的游荡，高倍镜下虫体呈半透明状，有时可见鞭毛，随着体外暴露时间的延长，鞭毛逐渐消失，虫体逐渐呈圆形。瑞氏染色后，三毛滴虫可清晰地看见三条前鞭毛和一条后鞭毛，有时可看见波动膜。
[0099]
2.3.2 pcr扩增
[0100]
用引物f、r对猫滴虫阳性重组质粒cp8-pucm-t vector进行pcr扩增后，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，出现925bp的特异性条带，与预期的片段大小一致。
[0101]
2.3.3猫滴虫dna标准模板的制备
[0102]
将测序正确的猫滴虫阳性重组质粒cp8-pucm-t vector经酶标仪对其浓度进行测定，质量浓度为24ng/μl，计算其拷贝数为2.37
×
10
10
copies/μl。
[0103]
2.3.4最佳退火温度筛选
[0104]
退火温度梯度为56℃～62℃。其中各个温度下均出现比较明亮的条带，因此，最适退火温度为56℃。
[0105]
2.3.5扩增产物序列测定
[0106]
测序结果表明，产物大小为1121bp，经blast序列比对分析，与jx187096.1、kx425915.1、lc054293.1、lc054287.1等序列几乎一致。序列表见基因序列表。
[0107]
2.3.6临床样本检测
[0108]
对来自于银川某动物医院的20份猫腹泻样本分别进行本试验建立的pcr方法与传统显微镜检测。结果显示：pcr检测阳性率为80.00％(16/20)，而传统显微镜检查阳性率为65.00％(13/20)
[0109]
2.4分析与讨论
[0110]
利用t.foetus cp8基因设计特异性引物，通过对pcr反应退火温度等条件的优化，建立出一种特异性强、灵敏度高的猫滴虫病的临床诊断方法，建立该方法与猫球虫、猫贾第虫、猫冠状病毒(fcov)、猫细小病毒(fpv)均无交叉反应；可检测的最低模板浓度为1.44
×
106copies/μl；猫滴虫阳性重组质粒cp8-pucm-t vector在-20℃冰箱放置12个月后仍可检
测出目的条带；并从20份猫临床样本中检测出16份猫滴虫核酸阳性，较传统显微镜检查结果(13份)更为准确、敏感。
[0111]
实施例3、
[0112]
一种基于cp8基因的猫滴虫病的实时荧光pcr诊断方法，包括以下步骤：
[0113]
(1)引物设计与合成
[0114]
根据基因序列表所得序列，应用primer primer 5.0软件设计一对特异性引物，f2：5'-acaagttcgctgctatgaccc-3'，r2：5'-aacaacgcccttttcacgcc-3'，扩增预期片段大小为137bp，引物经primer-blast初步验证，后进行合成；
[0115]
(2)猫滴虫dna标准模板cp8-pucm-t vector质粒标准品的制备
[0116]
将经显微镜检查确诊为猫滴虫感染的阳性粪便，严格按照粪便全基因提取试剂盒说明书提取猫球虫总基因组dna，后用引物f2、r2进行普通pcr扩增，回收目的片段，连接pucm-t vector克隆载体，转化至dh5a大肠杆菌感受态细胞中，涂板、通过含有氨苄抗性的lb固体培养基筛选，挑取单菌落至含有氨苄抗性的lb液体培养基中扩大培养，菌液pcr鉴定后阳性菌液提取重组质粒cp8-pucm-t vector，进行测序，测序正确的阳性质粒采用酶标仪测定浓度，换算拷贝数，-20℃保存备用；
[0117]
(3)荧光定量pcr反应条件
[0118]
反应总体系20μl，其中sybr greenⅰmaster荧光染料10μl，10μmol/μl上下游引物各0.4μl，cp8-pucm-t vector标准品模板2μl，用ddh2o补足至20μl；反应程序为：95℃预变性3min，95℃5s，59.3℃30s，65℃5s，共40个循环，95℃延伸5min，。
[0119]
所述的猫滴虫dna标准模板cp8-pucm-t vector质粒标准品的制备方法为：将经显微镜检查确诊为猫滴虫感染的阳性粪便，严格按照粪便全基因提取试剂盒说明书提取猫球虫总基因组dna，后用引物f、r进行普通pcr扩增，回收目的片段，连接pucm-t vector克隆载体，转化至dh5a大肠杆菌感受态细胞中，涂板、通过含有氨苄抗性的lb固体培养基筛选，挑取单菌落至含有氨苄抗性的lb液体培养基中扩大培养，菌液pcr鉴定后阳性菌液提取重组质粒cp8-pucm-t vector，进行测序，测序正确的阳性质粒采用酶标仪测定浓度，换算拷贝数，-18-22℃保存备用，即得。所得的标准品质粒浓度为24ng/μl，换算其拷贝数为2.37
×
10
10
copies/μl。