内含肽C端序列变体及其应用的制作方法

内含肽c端序列变体及其应用
技术领域
1.本技术涉及生物医药领域，具体的涉及一种内含肽c端序列变体及其应用。


背景技术：

2.蛋白质剪接是一种翻译后成熟的过程，在此过程中，一种命名为“内含肽“的插入序列能进行自我剪接，以肽键连接两侧外蛋白子形成成熟蛋白质。
3.抗体药物虽然具有一定的疗效且高活性特异性靶向作用，但抗体药物作为单一药物对癌症特别是恶性肿瘤的疗效也不尽如人意；同时，有些高活性细胞毒类小分子化学药物由于靶向性差、治疗窗口窄和/或毒副作用大在临床失败而无法成药，为了解决这些问题，科学家将高活性细胞毒类小分子药物与抗体药物通过化学偶联技术开发出新一代靶向药物即抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，adc)。目前上市的抗体偶联药物主要以小分子通过共价键随机偶联至抗体的赖氨酸或半胱氨酸。
4.然而，随机偶联在工艺稳定性、偶联位点重现性、药效稳定性、代谢一致性等方面存在潜在的问题。因此亟待获得可以实现抗体偶联药物定点偶联的制备工艺，同时拓展应用范围，将抗体免疫治疗与光热治疗、蛋白降解等相结合，获得抗体偶联类药物。


技术实现要素：

5.本技术提供了一种内含肽c端序列变体及其应用。本技术所述的内含肽c端序列可以在还原条件下保留剪切活性。所述内含肽c端序列变体可以与相应的内含肽n端序列一起参与制备抗体偶联类药物。例如，通过所述内含肽c端序列变体，可以实现药物在抗体或其抗原结合片段上的定点偶联。例如，通过所述内含肽c端序列变体，可以解决抗体偶联类药物因随机偶联而产生的均一性和/或安全性问题。通过所述内含肽c端序列变体所制备的抗体偶联类药物，其与原始抗体或其抗原结合片段相比，可以对抗原的结合活性、对表达抗原的靶细胞(例如肿瘤细胞)的结合亲和力和/或对表达抗原的靶细胞(例如肿瘤细胞)的杀伤能力显著提高。
6.一方面，本技术提供了一种内含肽c端序列变体，其中与seq id no.1所示的氨基酸序列相比，所述内含肽c端序列变体包含至少一个位于选自下组的氨基酸位置处的突变：k2、k7、k11和k28。
7.在某些实施方式中，与seq id no.1所示的氨基酸序列相比，所述内含肽c端序列变体包含k2、k7、k11和k28氨基酸位置处的突变。
8.在某些实施方式中，所述k2处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
9.在某些实施方式中，所述k7处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
10.在某些实施方式中，所述k11处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
11.在某些实施方式中，所述k28处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
12.在某些实施方式中，所述k2处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为k2r、k2q、k2m、k2e或k2g。
13.在某些实施方式中，所述k7处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为k7r、k7q、k7m、k7e或k7g。
14.在某些实施方式中，所述k11处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为k11r、k11q、k11m、k11e或k11g。
15.在某些实施方式中，所述k28处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为k28r、k28q、k28m、k28e或k28g。
16.在某些实施方式中，所述的内含肽c端序列变体包含两个以上被取代为相同种类的氨基酸的所述氨基酸取代。
17.在某些实施方式中，所述的内含肽c端序列变体包含seq id no.2-6中任一项所示的氨基酸序列。
18.另一方面，本技术提供一种缀合物，其包含本技术所述的内含肽c端序列变体。
19.在某些实施方式中，所述缀合物用于制备抗体偶联类药物。
20.在某些实施方式中，所述缀合物包括抗体或其抗原结合片段。
21.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链。
22.在某些实施方式中，所述内含肽n端序列的n端与所述轻链的c端直接或间接连接。
23.另一方面，本技术提供一种分离的核酸分子，其编码本技术所述的内含肽c端序列变体。
24.另一方面，本技术提供一种制备抗体偶联类药物的方法，其包括以下的步骤：
25.(1)获得第一分子，其中所述第一分子包含与本技术所述的内含肽c端序列变体和所述药物，其中所述内含肽c端序列与所述药物直接或间接连接。
26.在某些实施方式中，所述方法包括以下的步骤：
27.(2)获得第二融合蛋白，其中所述第二融合蛋白包含本技术所述的内含肽c端序列变体所对应的内含肽n端序列与抗体或其抗原结合片段，其中所述的内含肽n端序列与抗体或其抗原结合片段直接或间接连接。
28.在某些实施方式中，所述方法包括以下的步骤：
29.(3)将所述第二融合蛋白与所述第一分子接触，所述内含肽c端序列变体与所述内含肽n端序列的反式剪接，获得包含所述抗体或其抗原结合片段和所述药物的抗体偶联类药物。
30.在某些实施方式中，所述第二融合蛋白包括抗体轻链，所述内含肽n端序列的n端与所述轻链的c端直接或间接连接。
31.在某些实施方式中，所述抗体偶联类药物中，所述轻链的c端与所述药物的n端直接或间接连接。
32.在某些实施方式中，所述间接连接包含使用连接子连接。
33.在某些实施方式中，所述抗体偶联类药物特异性结合肿瘤相关抗原。
34.另一方面，本技术提供根据本技术所述的方法制备的抗体偶联类药物。
35.在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与药物直接或间接连接。
36.在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段中轻链的c端与所述药物的n端间接连接。
37.在某些实施方式中，所述间接连接包含使用连接子连接。
38.在某些实施方式中，所述的抗体偶联类药物特异性结合肿瘤相关抗原。
39.在某些实施方式中，所述药物定点偶联于所述抗体或其抗原结合蛋白。
40.在某些实施方式中，所述的抗体偶联类药物的药物/抗体比率(dar)为2。
41.另一方面，本技术提供了本技术所述的内含肽c端序列变体在制备抗体偶联类药物中的应用。
42.另一方面，本技术提供了本技术所述的内含肽c端序列变体在向抗体或其抗原结合片段定点偶联类药物中的应用。
43.本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
44.本技术所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的抗体偶联药物(adc)示例性实施方式和附图能够更好地理解本技术所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
45.图1显示的是表达本技术所述第二融合蛋白的质粒图谱。
46.图2a-2c显示的是本技术所述第二融合蛋白的纯化结果。
47.图3a-3b显示的是本技术所述第二融合蛋白和his tag的连接情况。
48.图4显示的是本技术所述第一分子的质谱检测结果。
49.图5显示的是本技术所述抗体偶联药物抗体偶联类药物的sds-page电泳检测的结果。
50.图6a-6b显示的是本技术所述抗体偶联药物的亲和力检测的结果。
51.图7a-7b显示的是本技术所述抗体偶联药物对her2高表达细胞生长的抑制能力。
52.图8显示的是本技术所述抗体偶联药物的sds-page电泳检测的结果。
53.图9显示的是本技术所述内含肽c端序列变体用以制备抗体偶联药物的过程。
具体实施方式
54.以下由特定的具体实施例说明本技术发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本技术发明的其他优点及效果。
55.术语定义
56.在本技术中，术语“内含肽”通常是指能够进行自加工的多肽结构域。所述内含肽可以为能够通过蛋白质剪接进行自身切除并与蛋白质的剩余部分连接的一类蛋白质。所述内含肽可以包括整体内含肽和断裂型内含肽。其中所述整体内含肽的两个剪接区域可以共
同存在于同一个多肽片段上。所述断裂型内含肽的两个剪接区域可以分裂为两个或更多个片段。其中所述两个剪接区域可以存在于不同的多肽片段上。例如，可以根据所述内含肽的氨基酸序列，分别称为内含肽n端序列和内含肽c端序列。其中，所述内含肽的n端序列的n端可以与某一蛋白质的c端连接；其中所述内含肽的c端序列的c端可以与另一个蛋白质的n端连接。本技术中，所述内含肽可以参与蛋白质翻译后修饰。例如，内含肽基因不是一个独立的基因，需要插入于外显肽基因才能复制转录，可从前体蛋白中切除并将两侧外显肽连接起来成为成熟蛋白质。编码所述内含肽的核苷酸序列可以嵌合在宿主蛋白对应的核酸序列之中，与宿主蛋白基因存在于同一开放阅读框架内，并与宿主蛋白质基因进行同步转录和翻译，当翻译形成蛋白质前体后，内含肽从宿主蛋白质中切除，从而形成成熟的具有活性的蛋白。
57.在本技术中，术语“变体”通常是指指与天然生物活性蛋白质具有序列同源性的蛋白质分子。本技术所述的多肽变体包括通过添加(包含插入)、缺失、修饰和/或取代一个或多个氨基酸残基而具有改变的氨基酸序列的多肽，其同时保留亲本序列的至少一种治疗和/或生物活性而与亲本序列不同。例如，变体可与亲本蛋白具有至少0％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。序列同一性通常是指在比对序列后，查询序列中氨基酸残基或核苷酸与第二参考多肽序列或其部分中相同的残基所占百分比，必要时引入空位(gaps)以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸/核苷酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域已知的各种方式来实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如blast、blast-2、align、needle或megalign(dnastar)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。同一性百分比可以在整个确定的多肽/多核苷酸序列的长度上测定，或者可以在较短的长度上，例如在从较大的确定的多肽/多核苷酸序列中获得的片段的长度上测定变体可以天然存在或者是非天然存在的。在本技术中，可以使用本领域已知的技术来生成非天然存在的变体。多肽变体可以包含保守的或非保守的氨基酸替代、删除或添加。
58.在本技术中，术语“突变”通常是指对序列(核酸或氨基酸序列)的任何类型的改变或修饰，包括氨基酸或核苷酸的缺失、截短、失活、破坏、取代或易位。在本技术中，氨基酸突变可以是氨基酸取代，术语“取代”通常是指用不同的“替换”氨基酸残基来替换预先确定的亲本氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。该一个或多个被替换的氨基酸残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码)。
59.在本技术中，术语“带正电荷的氨基酸”通常是指带有正电荷侧链的氨基酸。所述带正电荷的氨基酸可以包括精氨酸(arg,r)、组氨酸(his,h)和赖氨酸(lys,k)。
60.在本技术中，术语“不带电荷但具有极性的氨基酸”通常是指侧链不带有电荷的极性氨基酸。所述不带电荷但具有极性的氨基酸可以包括丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、天冬酰胺(asn，n)、谷氨酰胺(gln，e)、半胱氨酸(cys，c)和甘氨酸(gly，g)。
61.在本技术中，术语“与k的侧基大小相近的氨基酸”通常是指侧链的大小与赖氨酸的侧基大小相近的氨基酸。所述与k的侧基大小相近的氨基酸可以包括谷氨酰胺(gln,q)和/或甲硫氨酸(met,m)。
62.在本技术中，术语“抗体偶联类药物”通常是指与一个或多个化学药物连接的结合
蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)。所述化学药物可以为任意的治疗剂和/或细胞毒性药物。所述抗体偶联类药物可以具有从1-8任何数目的与抗体偶联的药物，例如可以包括2、4、6或8的载药种类(drug loaded species)。在本技术中，所述药物可以包括有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、用于基因疗法的载体、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢物、含硼剂、化疗保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光敏治疗剂、寡核苷酸、放射性核素剂、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或放射致敏剂。例如，本技术的抗体偶联类药物可以包括但不限于抗体偶联药物、抗体偶联超分子纳米纤维(如光热治疗icg等)、抗体偶联蛋白降解剂(如protac分子)。
63.在本技术中，术语“抗体”通常是指由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(l)链和一条“重”(h)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循kabat sequences of proteins of immunological interest(national institutes of health,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。
64.在本技术中，术语“抗原结合片段”通常是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，her2)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，fundamental immunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，raven press,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab和互补决定区(cdr)片段、单链抗体(例如，scfv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如单克隆抗体2e12)获得抗体的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。
65.在本技术中，术语“药物/抗体比率”通常是指与adc的抗体连接的药物的数目。adc的dar范围可以为1-8，也可以为更高载量(例如10)，dar的范围可以取决于抗体上连接位点的数目。在本技术中，所述dar可以为负载到单个抗体上的药物的数目。所述dar也可以为一组adc的平均或均值dar。
66.在本技术中，术语“连接子”通常是指用于进行连接的化学部分。所述连接子可以包括一个偶联成分，或者可以包括多个偶联成分。例如，所述连接子可以为插入第一分子(例如所述药物)和第二分子(例如所述抗体或其抗原结合片段)之间的用于进行连接的化学部分。所述连接子可以为肽连接子。所述连接子可以不具有免疫原性，和/或，不引起免疫反应。在某些情况下，所述肽连接子可以为柔性多肽连接子。所述连接子可以包含可以共价结合两个以上部分的官能团。
67.在本技术中，术语“肿瘤”通常是指哺乳动物中通常特征是不受调节的细胞生长的生理状况。所述肿瘤包括一个或多个癌性细胞。所述肿瘤可以包括实体瘤和/或非实体瘤。
68.在在本技术中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
69.在本技术中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
70.发明详述
71.内含肽c端序列变体
72.一方面，本技术提供了一种内含肽c端序列变体，其中与seq id no.1所示的氨基酸序列相比，所述内含肽c端序列变体包含至少一个位于选自下组的氨基酸位置处的突变：k2、k7、k11和k28。
73.在本技术中，所述内含肽可以进行自我剪接，从而以肽键连接两侧的蛋白质形成成熟的蛋白质。在某些情况下，编码所述内含肽的基因可以在特定位点处断裂为n端片段(例如可以称为内含肽n端序列，简称in)和c端片段(例如可以称为内含肽c端序列，简称ic)。一般而言，所述内含肽n端序列和所述内含肽c端序列在单独存在时可以没有活性。所述内含肽n端序列和所述内含肽c端序列混合时，两者可以相互识别(例如可以通过重建催化活性中心)，并可以介导蛋白质的反式剪切。
74.例如，本技术所述内含肽c端序列变体可以为在npu dnae内含肽基础上获得的变体。所述内含肽c端序列可以包含至少一个(例如1个、2个、3个或4个)选自下组的氨基酸位置处的突变：k2、k7、k11和k28。
75.在本技术中，所述氨基酸位置可以为在seq id no.1所示的氨基酸序列中的氨基酸的位置。例如，seq id no.1中，自n端起，其中第2位氨基酸为k，第7位氨基酸为k，第11位氨基酸为k，和/或第28位氨基酸为k。
76.例如，与seq id no.1所示的氨基酸序列相比，所述内含肽c端序列变体可以包含k2、k7、k11和k28氨基酸位置处的突变。
77.在本技术中，所述k2处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
78.在本技术中，所述k7处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
79.在本技术中，所述k11处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
80.在本技术中，所述k28处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
81.其中，所述带正电荷的氨基酸可以包括r、h和/或k。
82.所述不带电荷但具有极性的氨基酸可以包括s、t、y、n、e、c和/或g。
83.所述与k的侧基大小相近的氨基酸可以包括q和/或m。
84.在本技术中，所述k2处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为k2r、k2q、k2m、k2e或k2g。
85.在本技术中，所述k7处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为k7r、k7q、k7m、k7e或k7g。
86.在本技术中，所述k11处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为k11r、k11q、k11m、k11e或k11g。
87.在本技术中，所述k28处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为k28r、k28q、k28m、k28e或k28g。
88.在本技术中，所述k2处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为k2r、k2q、或k2m。
89.在本技术中，所述k7处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为k7r、k7q、或k7m。
90.在本技术中，所述k11处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为k11r、k11q、或k11m。
91.在本技术中，所述k28处可以包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代可以为k28r、k28q、或k28m。
92.例如，在所述的氨基酸位置处，所述的内含肽c端序列变体可以包含两个以上(例如，可以为2个、3个或4个)被取代为相同种类的氨基酸的所述氨基酸取代。例如，所述内含肽c端序列变体中，至少2个(例如，可以为2个、3个或4个)氨基酸取代可以为均被取代为e、g、q、m或r。例如，所述内含肽c端序列变体中，至少2个(例如，可以为2个、3个或4个)氨基酸取代可以为均被取代为q、m或r。
93.在本技术中，所述的内含肽c端序列变体可以包含seq id no.2-6中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述的内含肽c端序列变体可以包含seq id no.4-6中任一项所示的氨基酸序列。
94.缀合物、抗体偶联类药物及其制备方法
95.另一方面，本技术提供一种缀合物，其包含本技术所述的内含肽c端序列变体。
96.例如，所述内含肽c端序列变体的c端可以与药物直接或间接连接，从而获得包含所述内含肽c端序列变体和所述药物的第一分子。
97.在本技术中，所述药物可以用于治疗肿瘤。例如，所述药物可以为小分子药物。例如，所述药物可以包括化疗药物。
98.例如，所述内含肽c端序列变体所对应的内含肽n端序列的n端可以与抗体或其抗原结合片段直接或间接连接(例如，可以与所述抗体或其抗原结合片段的c端直接或间接连接)，从而获得包含所述内含肽n端序列和所述抗体或其抗原结合片段的第二融合蛋白。
99.在某些情况下，所述内含肽n端序列的n端可以与抗体或其抗原结合片段的轻链(例如所述轻链的c端)直接或间接连接。例如，所述抗体中，所述轻链可以与所述重链以共价键的形式连接。在某些情况下，所述第二融合蛋白可以包含完整的抗体和所述内含肽n端
序列。例如，其中所述内含肽n端序列的n端可以与所述完整的抗体中的所述轻链的c端直接或间接连接。
100.例如，所述间接连接可以包括通过连接子连接。
101.在本技术中，所述抗体或其抗原结合片段可以特异性结合肿瘤相关抗原。例如，所述抗体或其抗原结合片段可以特异性结合表达所述肿瘤相关抗原的肿瘤细胞。例如，所述抗体或其抗原结合片段可以特异性杀伤表达所述肿瘤相关抗原的肿瘤细胞。
102.例如，所述肿瘤相关抗原可以包括her2。
103.在本技术中，当所述第一分子与所述第二融合蛋白接触时，所述第一分子中的所述内含肽c端序列变体可以与所述第二融合蛋白中的所述内含肽n端序列进行反式剪接。例如，通过所述反式剪接可以获得包含所述药物和所述抗体或其抗原结合蛋白的抗体偶联类药物。
104.在本技术中，所述缀合物可以用于制备抗体偶联类药物。例如，本技术的抗体偶联类药物可以包括抗体偶联药物、抗体偶联超分子纳米纤维(如光热治疗icg等)、抗体偶联蛋白降解剂(如protac分子)
105.在本技术中，所述缀合物可以包括抗体或其抗原结合片段。
106.另一方面，本技术提供一种分离的核酸分子，其编码本技术所述的内含肽c端序列变体。
107.在某些情况下，本技术所述的核酸分子可以根据密码子简并性和/或宿主细胞的表达偏好性而调整其核苷酸序列，只要其可以编码所述的内含肽c端序列变体。
108.例如，所述核酸分子可以包含于质粒，以方便转染细胞并表达所述内含肽c端序列变体。
109.例如，所述核酸分子可以进一步包含可以编码本技术所述的第一分子的核酸序列。
110.例如，所述核酸分子可以进一步包含可以编码本技术所述的第二融合蛋白的核酸序列。
111.在某些情况下，包含编码所述第一分子的核酸序列的质粒可以与包含编码所述第二融合蛋白的核酸序列的质粒共同转染细胞。
112.在某些情况下，所述核酸分子可以与编码所述第二融合蛋白的核酸序列位于同一质粒中。
113.另一方面，本技术提供一种制备抗体偶联类药物的方法，其包括以下的步骤：
114.(1)获得第一分子，其中所述第一分子包含与本技术所述的内含肽c端序列变体和所述药物，其中所述内含肽c端序列与所述药物直接或间接连接。
115.在本技术中，所述方法可以包括以下的步骤：
116.(2)获得第二融合蛋白，其中所述第二融合蛋白包含本技术所述的内含肽c端序列变体所对应的内含肽n端序列与抗体或其抗原结合片段，其中所述的内含肽n端序列与抗体或其抗原结合片段直接或间接连接。
117.在本技术中，所述方法可以包括以下的步骤：
118.(3)将所述第二融合蛋白与所述第一分子接触，所述内含肽c端序列变体与所述内含肽n端序列的反式剪接，获得包含所述抗体或其抗原结合片段和所述药物的抗体偶联类
药物。
119.在本技术中，所述第二融合蛋白可以包括抗体轻链，所述内含肽n端序列的n端可以与所述轻链的c端直接或间接连接。
120.在本技术中，所述抗体偶联类药物中，所述轻链的c端可以与所述药物的n端直接或间接连接。
121.在本技术中，所述间接连接可以包含使用连接子连接。
122.在本技术中，所述抗体偶联类药物可以特异性结合肿瘤相关抗原。
123.在本技术中，所述方法的过程可以参见图9。
124.另一方面，本技术提供根据本技术所述的方法制备的抗体偶联类药物。
125.在本技术中，抗体或其抗原结合片段可以与药物直接或间接连接。
126.在本技术中，所述抗体或其抗原结合片段中轻链的c端可以与所述药物的n端间接连接。
127.在本技术中，所述间接连接包含可以使用连接子连接。
128.在本技术中，所述的抗体偶联类药物可以特异性结合肿瘤相关抗原。
129.在本技术所述的抗体偶联类药物中，所述药物可以定点偶联于所述抗体或其抗原结合蛋白。例如，所述药物可以定点偶联于所述抗体的轻链的c端。
130.例如，所述的抗体偶联类药物的药物/抗体比率(dar)可以为2。即在所述抗体偶联类药物中，每一个所述抗体或其抗原结合片段上可以定点偶联2个药物(例如可以分别定点偶联于所述抗体的两条轻链的c端)。
131.另一方面，本技术提供了本技术所述的内含肽c端序列变体在制备抗体偶联类药物中的应用。
132.另一方面，本技术提供了本技术所述的内含肽c端序列变体在向抗体或其抗原结合片段定点偶联类药物中的应用。
133.在本技术中，利用本技术所述的内含肽c端序列变体可以使药物定点偶联在抗体或其抗原结合片段的指定位置。从而可以解决制备所述抗体偶联类药物中药物随机偶联而产生的不一致、安全性缺陷等问题。试验证明利用本技术所述的内含肽c端序列变体所制备得到的抗体偶联类药物，其与原始的所述抗体或其抗原结合片段相比，可与所述药物产生协同作用而显著提高杀伤肿瘤细胞的功能；可以保持特异性结合表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的能力；和/或，可以保持高亲和力结合表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的能力。本技术所述的内含肽c端序列变体的应用场景广泛，可以用于多种蛋白，或者蛋白与其他分子的偶联。
134.技术方案
135.1.内含肽c端序列变体，其中与seq id no.1所示的氨基酸序列相比，所述内含肽c端序列变体包含至少一个位于选自下组的氨基酸位置处的突变：k2、k7、k11和k28。
136.2.根据技术方案1所述的内含肽c端序列变体，其中与seq id no.1所示的氨基酸序列相比，所述内含肽c端序列变体包含k2、k7、k11和k28氨基酸位置处的突变。
137.3.根据技术方案1-2中任一项所述的内含肽c端序列变体，其中所述k2处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
138.4.根据技术方案1-3中任一项所述的内含肽c端序列变体，其中所述k7处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
139.5.根据技术方案1-4中任一项所述的内含肽c端序列变体，其中所述k11处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
140.6.根据技术方案1-5中任一项所述的内含肽c端序列变体，其中所述k28处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为带正电荷的氨基酸，或者不带电荷但具有极性的氨基酸，或者与k的侧基大小相近的氨基酸。
141.7.根据技术方案1-6中任一项所述的内含肽c端序列变体，其中所述k2处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为k2r、k2q、k2m、k2e或k2g。
142.8.根据技术方案1-7中任一项所述的内含肽c端序列变体，其中所述k7处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为k7r、k7q、k7m、k7e或k7g。
143.9.根据技术方案1-8中任一项所述的内含肽c端序列变体，其中所述k11处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为k11r、k11q、k11m、k11e或k11g。
144.10.根据技术方案1-9中任一项所述的内含肽c端序列变体，其中所述k28处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为k28r、k28q、k28m、k28e或k28g。
145.11.根据技术方案3-10中任一项所述的内含肽c端序列变体，其包含两个以上被取代为相同种类的氨基酸的所述氨基酸取代。
146.12.根据技术方案1-11中任一项所述的内含肽c端序列变体，其包含seq id no.2-6中任一项所示的氨基酸序列。
147.13.缀合物，其包含技术方案1-12中任一项所述的内含肽c端序列变体。
148.14.根据技术方案13所述的缀合物，其用于制备定点偶联的抗体偶联类药物(adc)。
149.15.根据技术方案13-14中任一项所述缀合物，其包括抗体或其抗原结合片段。
150.16.根据技术方案15所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链。
151.17.根据技术方案16所述缀合物，其中所述内含肽n端序列的n端与所述轻链的c端直接或间接连接。
152.18.分离的核酸分子，其编码技术方案1-12中任一项所述的内含肽c端序列变体。
153.19.一种制备定点偶联的抗体偶联类药物的方法，其包括以下的步骤：
154.(1)获得第一分子，其中所述第一分子包含与技术方案1-12中任一项所述的内含肽c端序列变体和所述药物，其中所述内含肽c端序列与所述药物直接或间接连接。
155.20.根据技术方案19所述的方法，其包括以下的步骤：
156.(2)获得第二融合蛋白，其中所述第二融合蛋白包含技术方案1-12中任一项所述的内含肽c端序列变体所对应的内含肽n端序列与抗体或其抗原结合片段，其中所述的内含肽n端序列与抗体或其抗原结合片段直接或间接连接。
157.21.根据技术方案20所述的方法，其包括以下的步骤：
158.(3)将所述第二融合蛋白与所述第一分子接触，所述内含肽c端序列变体与所述内含肽n端序列的反式剪接，获得包含所述抗体或其抗原结合片段和所述药物的抗体偶联类
药物。
159.22.根据技术方案20-21中任一项所述的方法，其中所述第二融合蛋白包括抗体轻链，所述内含肽n端序列的n端与所述轻链的c端直接或间接连接。
160.23.根据技术方案22所述的方法，其中所述抗体偶联类药物中，所述轻链的c端与所述药物的n端直接或间接连接。
161.24.根据技术方案19-23中任一项所述的方法，其中所述间接连接包含使用连接子连接。
162.25.根据技术方案19-24中任一项所述的方法，其中所述抗体偶联类药物特异性结合肿瘤相关抗原。
163.26.根据技术方案19-25中任一项所述的方法制备的抗体偶联类药物。
164.27.根据技术方案26所述的抗体偶联类药物，其中抗体或其抗原结合片段与药物直接或间接连接。
165.28.根据技术方案26-27中任一项所述的抗体偶联类药物，其中所述抗体或其抗原结合片段中轻链的c端与所述药物的n端间接连接。
166.29.根据技术方案27-28中任一项所述的抗体偶联类药物，其中所述间接连接包含使用连接子连接。
167.30.根据技术方案26-29中任一项所述的抗体偶联类药物，其特异性结合肿瘤相关抗原。
168.31.根据技术方案26-30中任一项所述的抗体偶联类药物，其中所述药物定点偶联于所述抗体或其抗原结合蛋白。
169.32.根据技术方案26-31中任一项所述的抗体偶联类药物，其药物/抗体比率(dar)为2。
170.33.技术方案1-12中任一项所述的内含肽c端序列变体在制备抗体偶联类药物中的应用。
171.34.技术方案1-12中任一项所述的内含肽c端序列变体在制备抗体或其抗原结合片段定点偶联类药物中的应用。
172.不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本技术发明的各个技术方案，而不用于限制本技术发明的范围。
173.实施例
174.实施例1获得第二融合蛋白
175.为将内含肽n端序列(其氨基酸序列如seq id no.7所示)融合于herceptin的轻链的c末端，将编码内含肽n端序列的核酸分子连接在编码herceptin的轻链的核酸分子的3’端，并将这些核酸分子插入pm09质粒，从而得到能够表达目的蛋白的质粒pm09-her2-lc-intein n。质粒her2-lc的质粒图谱参见图1。同时构建另一个编码herceptin的重链序列的核酸分子质粒pm09-her2-hc。
176.将经过测序验证正确的所述质粒pm09-her2-lc-intein n与pm09-her2-hc共转染hek293e细胞，一周后活率下降约50％时收集上清进行纯化，得到内含肽n端序列融合于herceptin的轻链的c末端的第二融合蛋白。
177.其中，第二融合蛋白的纯化结果参见图2a-2c。其中，图2a显示了sds-page电泳检
测第二融合蛋白的结果，数字2、4、5分别表示纯化后所收集首400μl、末400μl与氢氧化钠洗脱的样品。对照表示纯化前的样品；ft表示流穿样品；其中，herceptin的轻链的大小为约34kd；herceptin的重链的大小为约55kd。图2b显示了纯化过程中以od
280
检测流过组分的结果；图2c显示了图2b中洗脱峰部分放大示意图。
178.将野生型的内含肽c端序列(其氨基酸序列如seq id no.1所示)和内含肽c端序列变体r(其氨基酸序列如seq id no.6所示)的c端分别连接his tag，得到连接his tag的野生型的内含肽c端序列和连接his tag的内含肽c端序列变体r。
179.在还原条件(2mm dtt)下，将1μm纯化的所述第二融合蛋白分别与连接his tag的野生型的内含肽c端序列和连接his tag的内含肽c端序列变体r在37℃下过夜反应。
180.通过western blot分别检测所述第二融合蛋白和连接his tag的内含肽c端序列的条带。结果参见图3a-3b。其中图3a显示了检测连接his tag的内含肽c端序列的结果；图3b显示了检测所述第二融合蛋白的结果。1-5分别为：1：所述第二融合蛋白与连接his tag的内含肽c端序列变体r的反应结果；2：所述第二融合蛋白与连接his tag的野生型的内含肽c端序列的反应结果；3：所述第二融合蛋白的检测结果；4：所述连接his tag的内含肽c端序列变体r的检测结果；5：所述连接his tag的野生型的内含肽c端序列的检测结果。其中，图3a(以anti-his-hrp二抗孵育并显色)的箭头从上到下依次显示剪接成功掉落内含肽n端并连有his tag的轻链和连接his tag的内含肽c端序列的条带；图3b(以anti-hclc-hrp二抗孵育并显色)的箭头从上到下依次显示抗体的重链，连接内含肽n端的轻链和剪接成功掉落内含肽n端并连有his tag的轻链。
181.图3的结果说明，内含肽c端序列变体r不会影响内含肽剪接反应的正确发生。
182.实施例2获得第一分子
183.将内含肽c端序列变体r(其氨基酸序列如seq id no.6所示)与连接子和小分子药物(smcc-dm1)(其cas号为1228105-51-8)进行化学修饰，得到smcc-dm1连接于内含肽c端序列变体r的c端的第一分子smcc-dm1-r。
184.用质谱检测第一分子smcc-dm1-r的分子量，结果参见图4。第一分子smcc-dm1-r的分子量为5686.97。
185.实施例3制备抗体偶联药物
186.加入2μm实施例1制备的所述第二融合蛋白与6μm实施例2制备的第一分子smcc-dm1-r，在还原剂dtt(终浓度2mm)存在条件下，37℃水浴过夜反应后加入终浓度0.3％过氧化氢氧化1小时，产物进行纯化，除去内含肽片段与其他残存试剂，得到抗体偶联药物。
187.图5显示了对抗体偶联药物进行sds-page电泳检测的结果。其中“流穿”的条带对应的是反应后断裂的内含肽。
188.实施例4亲和力分析
189.对实施例3制备的抗体偶联药物进行亲和力分析。使用生物素化her2抗原结合sa探针(购自pall corporation)，分别与实施例3制备的抗体偶联药物以及对照抗体herceptin做亲和力测试实验，结果分别如图6a-6b所示。
190.图6的结果证实通过本技术所述内含肽c端序列变体制备获得的抗体偶联药物能够保持与抗体相同的抗原结合亲和力水平。
191.实施例5体外活性分析
192.对实施例3制备的抗体偶联药物进行体外活性分析。选择两株her2高表达的细胞系skov3(购自american type culture collection)和skbr3(购自american type culture collection)，检测抗体偶联药物对这些细胞生长活性的抑制水平。
193.skov3和skbr3细胞于实验前一天铺板，各浓度梯度下给药实施例3制备的抗体偶联药物5天后进行检测，结果如图7a-7b所示。图7a-7b分别显示了实施例3制备的抗体偶联药物以及对照抗体herceptin对skov3和skbr3细胞的细胞活性的影响。图7a中，实施例3制备的抗体偶联药物以及对照抗体herceptin的ic50分别为2.8nm和n.a.；图7b中，实施例3制备的抗体偶联药物以及对照抗体herceptin的ic50分别为0.3205nm和0.4896nm。
194.图7的结果说明，与对照抗体相比，实施例3制备的抗体偶联药物对her2高表达的细胞具有更强的抑制能力。
195.实施例6制备抗体偶联药物
196.将内含肽c端序列变体e(其氨基酸序列如seq id no.2所示)与连接子和小分子药物(smcc-dm1)(其cas号为1228105-51-8)进行化学修饰，得到smcc-dm1连接于内含肽c端序列变体e的c端的第一分子smcc-dm1-e。
197.将内含肽c端序列变体g(其氨基酸序列如seq id no.3所示)与连接子和小分子药物(smcc-dm1)(其cas号为1228105-51-8)进行化学修饰，得到smcc-dm1连接于内含肽c端序列变体g的c端的第一分子smcc-dm1-g。
198.将内含肽c端序列变体q(其氨基酸序列如seq id no.4所示)与连接子和小分子药物(smcc-dm1)(其cas号为1228105-51-8)进行化学修饰，得到smcc-dm1连接于内含肽c端序列变体q的c端的第一分子smcc-dm1-q。
199.将内含肽c端序列变体m(其氨基酸序列如seq id no.5所示)与连接子和小分子药物(smcc-dm1)(其cas号为1228105-51-8)进行化学修饰，得到smcc-dm1连接于内含肽c端序列变体m的c端的第一分子smcc-dm1-m。
200.按照实施例3记载的方法，将实施例1制备的所述第二融合蛋白和上述第一分子smcc-dm1-e、smcc-dm1-g、smcc-dm1-q或smcc-dm1-m进行剪切反应，分别得到抗体偶联药物-e、抗体偶联药物-g、抗体偶联药物-q和抗体偶联药物-m。
201.图8显示了对上述抗体偶联药物进行sds-page电泳检测的结果。其中1-6分别表示实施例3制备的抗体偶联药物、抗体偶联药物-q、抗体偶联药物-g、抗体偶联药物-e、抗体偶联药物-m和实施例1制备的第二融合蛋白。其中，hc表示抗体重链；lc表示抗体轻链(大小约为26kd)；lc-in表示包含所述内含肽n端序列和herceptin的轻链的分子(大小约为37kd)。
202.图8的结果说明，实施例3制备的抗体偶联药物、抗体偶联药物-q和抗体偶联药物-m的结构完整，可见内含肽c端序列变体r、内含肽c端序列变体q和内含肽c端序列变体m可以参与制备抗体偶联药物的定点偶联。而内含肽c端序列变体e和内含肽c端序列变体g则不行。
203.前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本技术所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。