一种双特异性抗体及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种双特异性抗体及其应用。


背景技术：

2.pd1(程序性死亡蛋白-1)是由pdcd1基因编码的由288个氨基酸残基组成的50-55kda的i型跨膜糖蛋白，由细胞外igv结构域、跨膜结构区域以及细胞内尾部结构三部分构成。它可表达于活化的t细胞、b细胞、nk细胞等单核细胞及树突状细胞(dcs)表面。pd1作为负性共刺激分子与肿瘤细胞表达的pd-l1结合，可抑制t细胞增殖，并促进活化t细胞的凋亡；而pd1抗体则可以阻断pd1/pd-l1的结合，使效应t细胞发挥其肿瘤杀伤作用。
3.fgl1(fibrinogen-likeprotein1，纤维蛋白原样蛋白1，又名hps)在正常生理条件下，主要由肝细胞分泌，并参与其有丝分裂和代谢功能。2019年4月证明了fgl1是lag-3的抑制性功能配体，该配体独立于mhc-ii，且fgl1-lag-3信号通路独立于pd1通路。fgl1抑制抗原特异性t细胞活化，fgl1在小鼠体内的消除促进t细胞免疫。通过阻断fgl1-lag-3相互作用可以刺激肿瘤免疫并且以受体-配体相互依赖的方式治疗已建立的小鼠肿瘤。
4.在抗肿瘤免疫中，cd8阳性的细胞毒性t细胞的免疫应答发挥核心作用，其基本过程可分为抗原识别、细胞活化/增殖/分化和效应杀伤阶段。其中共抑制分子lag3和pd1分别在t细胞活化/增殖/分化阶段和效应杀伤阶段发挥重要的负向免疫调节作用。正常情况下，这两种分子在自体免疫耐受的维持中起重要作用，能防止自身免疫病的发生；然而在肿瘤患者体内，这两种分子可能起着抑制抗肿瘤免疫的作用。临床研究发现，抗fgl1抗体和抗pd1抗体联合应用比任一抗体单独使用具有更好的抗肿瘤活性。因此，研究出能同时阻断fgl1和pd1免疫抑制功能的双特异性抗体，从而更加有效地增强抗肿瘤免疫，这类高效抗肿瘤药物一直是本领域技术人员急待解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种抗fgl1/pd1双特异性抗体，该抗fgl1/pd1双特异性抗体对fgl1和pd1靶点均有较高的亲和力，能同时阻断fgl1和pd1免疫抑制功能，且具有良好的抗肿瘤活性。
6.本发明涉及一种能与pd1和fgl1特异性结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：(a)特异性结合第一抗原的第一抗体或其抗原结合片段；和(b)特异性结合第二抗原的第二抗体或其抗原结合片段；其中：所述第一抗原为pd1，并且所述第二抗原为fgl1；或者，所述第一抗原为fgl1，并且所述第二抗原为pd1。
7.在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；和所述第二抗体或其抗原结合片段包含vhh或scfv。
8.在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含重链可变区和重链恒定区，并且所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区；优选地，所述第一抗体为全长抗体。
9.在一些实施方案中，所述第一抗体的一条重链的重链可变区与一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位，另一条重链的重链可变区与另一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位。
10.在一些实施方案中，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个或多个所述的vhh或scfv。
11.在一些实施方案中，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个所述的scfv或一个所述的vhh，所述vhh或scfv连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的n端或c端。
12.在一些实施方案中，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和两个所述的scfv或两个所述的vhh。
13.在一些实施方案中，两个所述scfv或两个所述的vhh分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的n端。
14.在一些实施方案中，两个所述scfv或两个所述的vhh分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的c端。
15.在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其特征在于，对于所述每条多肽链：(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链；和(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链和所述vhh或scfv。
16.在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其特征在于，对于所述每条多肽链：(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链和所述vhh或scfv；和(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链。
17.在一些实施方案中，两条第一多肽链相同或不同，和/或两条第二多肽链相同或不同。
18.在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的fab区被能够特异性结合pd1的vhh替换。
19.在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含两条多肽链，其特征在于，对于所述每条多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段和所述scfv。
20.在一些实施方案中，两条多肽链相同或不同。
21.在一些实施方案中，所述scfv的重链可变区与轻链可变区通过连接子l1连接。
22.在一些实施方案中，所述scfv通过连接子l2与所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的n端或c端连接。
23.在一些实施方案中，所述作为第二抗体或其抗原结合片段的vhh通过连接子l2与所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的n端或c端连接。
24.在一些实施方案中，所述连接子l1和连接子l2相同或不同。在一些实施方案中，所述连接子l1和/或连接子l2具有如(g4s)
x
所示的氨基酸序列，x为选自1-6的整数；优选地，所述连接子l1和/或连接子l2为(g4s)2、(g4s)3或(g4s)4。
25.在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含第一fc区和第二fc区。在一些实施方案中，第一fc区和第二fc区是相同的或不同的。在一些实施方案中，所
述fc区选自igg、iga、igd、ige、igm及其变体。在一些实施方案中，所述fc区选自igg1、igg2、igg3、igg4及其变体。在一些实施方案中，所述fc区包含一个或多个氨基酸突变，优选氨基酸置换、插入或缺失。
26.在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合pd1，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的hcdr1如seq id no：1所示，或为与seq id no：1具有至少80％同一性的序列；hcdr2如seq id no：2所示，或为与seq id no：2具有至少80％同一性的序列；hcdr3如seq id no：3所示，或为与seq id no：3具有至少80％同一性的序列；lcdr1如seq id no：4所示，或为与seq id no：4具有至少80％同一性的序列；lcdr2如seq id no：5所示，或为与seq id no：5具有至少80％同一性的序列；lcdr3如seq id no：6所示，或为与seq id no：6具有至少80％同一性的序列。
27.在一些实施方案中，所述vhh特异性结合fgl1，所述vhh的hcdr1如seq id no：7所示，或为与seq id no：7具有至少80％同一性的序列；hcdr2如seq id no：8所示，或为与seq id no：8具有至少80％同一性的序列；hcdr3如seq id no：9所示，或为与seq id no：9具有至少80％同一性的序列。
28.在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合pd1，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链可变区如seq id no：11所示，或为与seq id no：11具有至少80％同一性的序列；轻链可变区如seq id no：12所示，或为与seq id no：12具有至少80％同一性的序列。
29.在一些实施方案中，所述vhh特异性结合fgl1，所述vhh如seq id no：13所示，或为与seq id no：13具有至少80％同一性的序列。
30.在一些实施方案中，所述的双特异性抗体包含seq id no：17所示的第一多肽链和如seq id no：18所示的第二多肽链。
31.本发明还涉及一种分离的核酸分子，其包含编码上述实施方案中任一所述的双特异性抗体的核苷酸序列。优选地，所述分离的核酸分子包含编码权利上述实施方案中任一所述的双特异性抗体的多肽链的核苷酸序列。
32.本发明还涉及一种多功能融合蛋白，其包含上述实施方案中任一所述的双特异性抗体。
33.在一些实施方案中，所述的多功能融合蛋白还包含一个或多个与其他抗原特异性结合的第三抗体或其抗原结合部分。
34.在一些实施方案中，所述结合第三抗体或其抗原结合部分的抗原选自肿瘤相关抗原(taa)或免疫检查点。
35.在一些实施方案中，所述的多功能融合蛋白，其特征在于，所述结合第三抗体或其抗原结合部分的抗原选自gpc3、cd19、cd20(ms4a1)、cd22、cd30、cd33、cd38、cd40、cd123、cd133、cd138、cdk4、cea、claudin18.2、afp、alk、bage蛋白质、bcma、birc5(存活素)、birc7、β-连环蛋白(β-catenin)、brc-ab1、brca1、boris、ca9、ca125、碳酸酐酶ix、半胱天冬酶-8(caspase-8)、calr、ccr5、na17、nkg2d、ny-br1、ny-br62、ny-br85、ny-eso1、ox40、p15、p53、pap、pax3、pax5、pcta-1、plac1、prlr、prame、psma(folh1)、rage蛋白质、周期素-b1、cyp1b1、egfr、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、erbb4、etv6-aml、epcam、epha2、fra-1、folr1、gage蛋白、gd2、gd3、globoh、gm3、gp100、her2、hla/b-raf、hla/k-ras、hla/mage-a3、htert、
il13rα2、lmp2、κ-light、ley、mage-1、mage-2、mage-3、mage-4、mage-6、mage-12、mart-1、间皮素、ml-iap、mov-γ、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5、muc16、mum1、ras、rgs5、rho、ror1、sart-1、sart-3、steap1、steap2、tag-72、tgf-β、tmprss2、汤-诺氏抗原、trp-1、trp-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3、5t4、pd-l1、ctla4、pd-l2、pd1、cd47、tigit、gitr、tim3、ilt4、trem2、lag3、cd27、cd24、b7h3或b7h4。
36.在一些实施方案中，所述的多功能融合蛋白还包含细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子选自il-1、il-2、il-2rα、il-2rβ、il-3、il-3rα、il-4、il-4rα、il-5、il-5rα、il-6、il-6rα、il-7、il-7rα、il-8、il-9、il-9rα、il-10、il-10r1、il-10r2、il-11、il-11rα、il-12、il-12rα、il-12rβ2、il-12rβ1、il-13、il-13rα、il-13rα2、il-14、il-15、il-15rαsushi、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-20r1、il-20r2、il-21、il-21rα、il-22、il-23、il-23r、il-27r、il-31r、tgf、vegf、ifnγ、ifnα或gm-csf。
37.在一些实施方案中，上述实施方案任一所述的多功能融合蛋白在制备治疗癌症的药物中的用途。
38.在一些实施方案中，所述癌选自人脑星形胶质母细胞瘤、人咽头癌、肾上腺肿瘤、aids-相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤性肿瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、肾转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌或子宫癌。
39.在一些实施方案中，上述实施方案中任一双特异性抗体或上述方案中任一多功能融合蛋白在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
40.在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病选自移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、结肠炎、牛皮癣、自身免疫性葡萄膜炎、天疱疮、大疱性表皮松解症或i型糖尿病。
41.在一些实施方案中，所述用途通过肿瘤免疫疗法、细胞疗法或基因疗法中的一种或多种来实现。
42.本发明还涉及一种药物组合物，其包含上述实施例方案中任一所述的双特异性抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
43.本发明还涉及一种药物组合物，其包含上述实施例方案中任一所述的多功能融合蛋白和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
44.本发明还涉及一种抗体药物偶联物，其包含上述实施例方案中任一所述的双特异性抗体。
45.在一些实施方案中，所述偶联药物选自细胞毒素、小分子化学药物或免疫毒素。
附图说明
46.图1：本发明中构建抗fgl1/pd1双特异性抗体的结构示意图。
47.图2：elisa检测抗体对pd1受体蛋白的结合活性。
48.图3：elisa检测抗体对fgl1蛋白的结合活性。
49.图4：elisa检测抗体对pd1和fgl1双靶点的结合活性。
50.图5：抗体pd1端阻断活性-报告基因法。
51.图6：抗体的抗肿瘤生物活性。
具体实施方式
52.下面结合实施例对本发明作进一步说明，实施例用于描述本发明的一些具体实施方案，而非用于限制本发明的保护范围。
53.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本技术的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。在矛盾的情况下，以专利说明书为准。
54.本领域中有多种方法/系统来定义和描述cdr，这些系统和/或定义已经开发和精制多年，包括kabat、chothia、imgt、abm和contact。kabat是最常用的，基于序列变异性定义cdr；chothia基于结构循环区域的位置基于序列变异性定义cdr；imgt系统基于可变域结构内的序列变异性和位置定义cdr；abm是基于牛津分子公司的abm抗体建模软件进行定义，是kabat和chothia之间的折衷；contact基于对复杂晶体结构的分析定义cdr，在多个方面与chothia类似。本发明中氨基酸位置的编号(例如fc区的氨基酸残基)和目标区域(例如cdr)，使用kabat系统。
55.术语“抗体”通常是指包含一个或多个基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白质。免疫球蛋白基因可以包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。如本文所用，轻链可被分类为κ或λ。重链可被分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白类别：igg、igm、iga、igd和ige。本技术中使用的抗体可具有包含四聚体的结构单元。每个四聚体可由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kd)和一条“重链”(约50-70kd)。每个成员的n末端可以界定约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。如本文中所用，术语轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)通常分别指轻链和重链的这些区域。抗体可作为完整免疫球蛋白存在或作为通过用各种肽酶消化或从头表达产生的许多充分表征的片段存在。
56.术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，而与修饰(例如磷酸化或糖基化)无关。术语多肽包括蛋白质及其片段。多肽可以是“外源的”，意指它们是“异源的”，即是所利用的宿主细胞外来的，例如由细菌细胞产生的人多肽。本文将多肽公开为氨基酸残基序列。那些序列按氨基末端到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列以三字母或单字母代码命名。
57.术语“抗体”还可包括通过修饰整个抗体或使用重组dna方法从头合成产生的抗体片段，包括但不限于fab'2、igg、igm、iga、ige、scfv、dab、纳米抗体、单抗体和双链抗体。在一些实施方案中，抗体包括但不限于fab'2、igg、igm、iga、ige和单链抗体，例如单链fv
(scfv)抗体，其中可变重链和可变轻链(直接地或通过肽接头)连接在一起以形成连续的多肽。
58.术语“scfv”是指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(vh)和抗体轻链可变结构域(vl)的分子。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-连接子-vh-cooh或nh2-vh-连接子-vl-cooh。合适的现有技术连接子由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-6个重复的ggggs氨基酸序列或其变体。
59.术语“vhh”是指源自天然不含轻链的重链分子的可变结构域，以区别于四链免疫球蛋白的常规vh。这种vhh分子可以源自在骆驼科物种例如骆驼、美洲驼羊、骆马、单峰骆驼、羊驼和原驼中产生的抗体。骆驼科以外的其它物种可以产生天然缺乏轻链的重链分子，并且这样的vhh在本技术的范围内。
60.术语“fab”由完整的l链以及h链的可变区结构域(vh)和一条重链的第一恒定域(ch1)组成。各fab片段对于抗原结合是单价的，即，其具有单一抗原结合位点。例如，可以重组产生或通过全长抗体的木瓜蛋白酶消化产生fab片段。
61.术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，以及各种类型的润湿剂。
62.术语“同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与对照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如blast软件或fasta程序包。
63.术语“至少80％同一性”是指候选序列中与对照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率为80％以上，包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
64.术语“特异性”表示参与特异性结合的分子之一不显示任何与不同于结合伙伴分子中的一个或数个的分子的显著结合。此外，在含抗体可变区的结构域对抗原中的多个表位中的特定表位具有特异性时，也使用该术语。当含抗体可变区的结构域所结合的表位被包含在数个不同抗原中时，包含含抗体可变区的结构域的抗原结合分子可以结合具有所述表位的各种抗原。
65.术语“表位”是指抗原中的抗原决定簇，并且是指在本说明书中公开的包含抗体可变区的抗原结合分子的结构域所结合的抗原位点。因此，可以根据其结构来定义表位。另外，也可以根据识别该表位的抗原结合分子中的抗原结合活性来定义该表位。当抗原是肽或多肽时，表位可以由形成表位的氨基酸残基指定；当表位是糖链时，表位可以通过其特定的糖链结构来确定。
66.术语“宿主细胞”通常包括可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包含本技术公开的多核苷酸，或表达本技术的双特异性抗体。宿主细胞可以包括单个宿主细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态上或在基因组总dna互补体上)。宿主细胞可包括用本技术公开的载体在体外转染的细胞。宿主细胞可以是细菌细胞(例如大肠杆菌(e.coli))、酵母细胞或其它真核细胞，例如cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞或骨髓瘤细胞。
67.术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸
分子转移至宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移。该术语可包括主要用于将dna或rna插入细胞的载体，主要用于dna或rna的复制的载体，以及用于dna或rna的转录和/或翻译的表达载体。还包括提供不止一种上述功能的载体。“表达载体”是当被引入合适的宿主细胞时可被转录并翻译成多肽的多核苷酸。
68.术语“治疗”是指获得有益或所需的结果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的方法。如本文中所用，治疗益处通常是指根除或减轻所治疗的潜在病症的严重性。此外，通过根除、减轻严重性或减少与潜在病症相关的一种或多种生理症状的发生率，以使得在受试者中观察到改善(尽管受试者仍然可能受到潜在病症折磨)来实现治疗益处。对于预防益处，可向处于发展特定疾病的风险中的受试者，或报告疾病的一种或多种生理症状的受试者施用组合物，即使可能尚未进行该疾病的诊断。
69.术语“试剂”通常是指生物部分、药物部分或化合物或其它部分。非限制性实例包括简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生物、碳水化合物、毒素或化疗化合物。可以合成各种化合物，例如小分子和寡聚物(例如，寡肽和寡核苷酸)和基于各种核心结构的合成有机化合物。另外，各种天然来源可提供用于筛选的化合物，诸如植物或动物提取物等。
70.术语“阴性对照”是指在同一实验中，使用与实验样品相同种属来源、相同亚型、相同剂量、相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白、相同标记等，用于消除实验中非特异结合样品对实验数值产生的实验背景影响，作为一种更加说明实验效果的对照。
71.术语“体内”通常是指在受试者体内发生的事件。
72.术语“体外”通常是指发生在受试者体外的事件。例如，体外测定包括在受试者外进行的任何测定。体外测定包括其中使用死细胞或活细胞的基于细胞的测定。体外测定还包括其中不使用完整细胞的无细胞测定。
73.术语“受试者”通常是指人或非人动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、牛、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
74.实施例1核苷酸序列
75.本发明抗体的pd1结合部分和fgl1结合部分之间的接头序列为seq id no:10；pd1结合部分的重链可变区序列为seq id no:11，轻链可变区序列为seq id no:12，cl序列为seq id no:14，ch1序列为seq id no:15，fc区序列为seq id no:16；fgl1结合部分的序列为seq id no:13；第一多肽链序列为seq id no:17，第二多肽链序列为seq id no:18。将上述各目标氨基酸序列转化为核苷酸序列，并针对可能影响抗体在哺乳动物细胞中表达的一系列参数：密码子偏好性、gc含量(即dna的4种碱基中鸟嘌呤g和胞嘧啶c所占的比率)、cpg岛(即cpg双核苷酸在基因组中密度较高的区域)、mrna的二级结构、拼接位点、前成熟polya位点、内部chi位点(基因组中一段短的dna片段，在该位点附近发生同源重组的几率增加)或者核糖体结合位点、rna不稳定序列、反向重复序列及可能干扰克隆的限制性酶切位点等进行优化；同时增加了可能会提高翻译效率的相关序列，例如kozak序列、sd序列，以及终止密码子。设计得到分别编码上述抗体的第一多肽链基因和第二多肽链基因，另外在第一多肽链和第二多肽链的5’端分别设计上根据氨基酸序列优化而得的编码信号肽的核苷酸序列；此外，还对第一多肽链和第二多肽链核苷酸序列的3’端分别加上终止密码子。最终获得优化后编码本发明抗体的核苷酸序列，其中编码第一多肽链的核苷酸序列为seq id no:
19，编码第二多肽链的核苷酸序列为seq id no:20。
76.实施例2基因合成与表达载体的构建
77.采用pcdna3.1-g418载体作为表达所述抗体的第一多肽链和第二多肽链的专用载体。pcdna3.1-g418载体含有第一多肽链所使用的启动子cmv promoter、真核筛选标记g418标签和原核筛选标签ampicilline。基因合成分别得到抗体表达的第一多肽链、第二多肽链编码基因的核苷酸序列(即目的基因)，用hindiii和xhoi对载体和目的片段进行双酶切，回收后通过dna连接酶进行酶连，并转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，挑选出阳性克隆并进行质粒提取和酶切验证，获得含所述抗体第一多肽链、第二多肽链编码基因的重组质粒。
78.实施例3质粒抽提
79.根据《分子克隆实验指南》(2002年，科学出版社)所述方法，将含有上述各目的基因的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞dh5α中，将转化细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上培养，挑选质粒克隆至液体lb培养基中培养，260rpm摇菌14h，由无内毒素质粒大抽试剂盒抽提质粒，用无菌水溶解并用核酸蛋白定量仪进行浓度测定。
80.实施例4质粒转染、瞬转表达与抗体纯化
81.在37℃、8％co2、100rpm下培养expicho至细胞密度6
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106个/ml。使用脂质体分别将构建的载体质粒按照质量浓度1:1转染到上述细胞中，转染质粒浓度为1mg/ml，脂质体浓度参照expicho
tm expression system试剂盒确定，在32℃、5％co2，100rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和第5天之间分别补料一次。将上述培养产物置于离心机中，以4000g转速离心，0.22μm滤膜过滤并收集培养基上清液，采用proteina、离子柱纯化所得的抗体蛋白并收集洗脱液。proteina、离子柱纯化的具体操作步骤为：细胞培养液经过高速离心后取上清，利用ge的proteina层析柱进行亲和层析。层析使用平衡缓冲液为1
×
pbs(ph7.4)，细胞上清上样结合后利用pbs洗涤至紫外线回到基线，然后利用洗脱缓冲液0.1m甘氨酸(ph 3.0)洗脱目的蛋白，利用tris调节ph至中性保存。将亲和层析所得产物调节ph至低于或者高于等电点pi 1-2个ph单位，适当稀释以控制样本电导在5ms/cm以下。利用合适的对应ph缓冲液如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等条件，利用本领域内常规的离子交换层析方法如阴离子交换或者阳离子交换进行对应ph条件下nacl梯度洗脱，根据sds-page选择目的蛋白所在的收集管合并保存。然后，将纯化后所得的洗脱液超滤换液至缓冲液中。
82.实施例5 elisa检测抗体对pd1的结合活性
83.采用ph 7.4的pbs缓冲液将human pd1-his(购于acro-biosystems)稀释至0.2μg/ml，每孔100μl加入到96孔elisa板中，4℃包被过夜。用1％bsa封闭液封闭1小时后。pbst洗板3次后，将纯化得到的抗体用0.5％bsa样品稀释液稀释至10μg/ml，以此为起始浓度，进行3倍梯度稀释，共11个梯度，并设无关抗体(赫赛汀)阴性对照，每孔100μl，37℃孵育1h。再用pbst洗板3次，将hrp标记的山羊抗人igg fc用样品稀释液按1:20000稀释，每孔加入100μl，室温孵育1h。pbst洗板4次后，每孔加入100μl tmb底物，室温避光孵育10min，每孔加入100μl 1m hcl液终止显色反应。在多功能酶标仪上选择波长450nm，参比波长570nm测定96孔板中各孔的吸光值，每孔吸光值(od)＝od450nm-od570nm。将抗体的浓度取对数后作为横坐标，测得的每孔吸光值为纵坐标，选用sigmoidal dose-response(variable slope)方式(graphpad prism软件，graphpad software，san diego，california)进行非线性回归，得到目标抗体与pd1蛋白的结合曲线。抗体的elisa结果如图2所示，抗体在多浓度范围下均可
与pd1结合。
84.实施例6 elisa检测抗体对fgl1的结合活性
85.采用ph 7.4的pbs缓冲液将human fgl1-his(购于acro biosystems)稀释至0.5μg/ml，每孔100μl加入到96孔elisa板中，4℃包被过夜。用1％bsa封闭液封闭1小时后。pbst洗板3次后，将纯化得到的抗体用0.5％bsa样品稀释液稀释至10μg/ml，以此为起始浓度，进行3倍梯度稀释，共11个梯度，并设无关抗体(赫赛汀)阴性对照，每孔100μl，37℃孵育1h。再用pbst洗板3次，将hrp标记的山羊抗人igg fc用样品稀释液按1:20000稀释，每孔加入100μl，室温孵育1h。pbst洗板4次后，每孔加入100μl tmb底物，室温避光孵育10min，每孔加入100μl 1m hcl液终止显色反应。在多功能酶标仪上选择波长450nm，参比波长570nm测定96孔板中各孔的吸光值，每孔吸光值(od)＝od450nm-od570nm。将抗体的浓度取对数后作为横坐标，测得的每孔吸光值为纵坐标，选用sigmoidal dose-response(variable slope)方式(graphpad prism软件，graphpad software，san diego，california)进行非线性回归，得到目标抗体与fgl1蛋白的结合曲线。抗体的elisa结果如图3所示，抗体在多浓度范围下均可与fgl1结合。
86.实施例7 elisa检测抗体对fgl1和pd1的双靶点结合活性
87.采用ph 7.4的pbs缓冲液将human fgl1-his(购于acro biosystems)稀释至0.5μg/ml，每孔100μl加入到96孔elisa板中，4℃包被过夜。用1％bsa封闭液封闭1小时后。pbst洗板3次后，将纯化得到的抗体用0.5％bsa样品稀释液稀释至10μg/ml，以此为起始浓度，进行3倍梯度稀释，共11个梯度，并设无关抗体(赫赛汀)阴性对照，每孔100μl，37℃孵育1h。再用pbst洗板3次，采用ph 7.4的pbs缓冲液将biotinylated human pd1(购于acro biosystems)稀释至0.5μg/ml，每孔100μl，37℃孵育1h，再用pbst洗板3次。将hrp-sa用样品稀释液按1:10000稀释，每孔加入100μl，室温孵育1h。pbst洗板4次后，每孔加入100μl tmb底物，室温避光孵育10min，每孔加入100μl 1m hcl液终止显色反应。在多功能酶标仪上选择波长450nm，参比波长570nm测定96孔板中各孔的吸光值，每孔吸光值(od)＝od450nm-od570nm。将抗体的浓度取对数后作为横坐标，测得的每孔吸光值为纵坐标，选用sigmoidal dose-response(variable slope)方式(graph pad prism软件，graph pad software，san diego，california)进行非线性回归，得到目标抗体与fgl1和pd1蛋白的双靶点结合曲线。抗体的elisa结果如图4所示，抗体在多浓度范围下均可在与fgl1结合情况下与pd1结合。
88.实施例8抗体pd1端阻断活性-报告基因法
89.将5
×
104/孔chok1-pdl-1细胞铺于96孔板中37℃过夜孵育。用1640完全培养基将待测样品以250nm为起始浓度，5倍稀释10个梯度。将孵育过夜的96孔板取出，吸掉上清，加入稀释好的抗体，50μl/孔。将jurkat-nfat-pd1细胞以5
×
104/孔铺于96孔板中，37℃孵育6h。将bio-lite tm检测试剂(vazyme：dd1201-02)平衡至室温后，100μl/孔加入每个样品孔。抗体的结果如图5所示，抗体在多浓度范围下均可阻断pdl-1和pd1的结合，阻断能力与keytruda类似。
90.实施例9抗体体内抗肿瘤活性
91.通过将5
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106的小鼠直结肠癌细胞系mc38细胞皮下注射至雌性fgl1人源化小鼠(购自百奥赛图)右后背以建立皮下移植肿瘤模型，肿瘤平均体积达到60mm3时开始分组给药。120ug抗体、5mpk抗鼠pd1抗体(j43)或等体积pbs进行腹腔注射治疗，每3天给药一次，每
周给药两次，共给药6次。实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周三次测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：v＝0.5a
×
b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。结果如图6所示，其中横坐标表示给药后的天数，纵坐标表示肿瘤体积。开始细胞接种4天后，达到60mm3进行分笼与给药，给药22天后，pbs对照组的小鼠平均荷瘤体积达到577.39
±
96.27mm3，抗鼠pd1抗体治疗组小鼠荷瘤体积仅为37.05
±
21.54mm3，而抗体+抗鼠pd1抗体联合治疗组的小鼠荷瘤体积仅为1.98
±
1.98mm3，肿瘤生长受到显著抑制，抗体治疗组的大部分小鼠出现肿瘤消退。该抗体显示出良好的抗肿瘤活性。
92.应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。