1.本发明涉及一种畜禽肠道益生菌剂的制备方法。
背景技术：
2.目前市场上有一种活性蛋白类饲料，采用生物技术将植物蛋白源同微生态技术结合在一起，利用酵母菌和乳酸菌所产生的丰富的酶系，将植物大分子蛋白降解为寡肽，使得产品既具有优质蛋白饲料的特性，又具有微生态制剂的功能。但其产品中的目标微生物在动物肠道中存活率低，无法抑制肠道内有害菌群的繁殖，只能靠产品中的为数不多的酶类和蛋白肽来提供生物功能，起不到增强机体免疫力的作用，治标而不治本。且该产品采用优质植物蛋白为发酵原料，生产成本较高，并且在饲料中的添加量达20％才能够看到效果。
3.安琪酵母公司生产的福邦高活性干酵母饲料，作为益生菌应用于饲料中，酵母菌的水分控制在4-6％，菌体处于“休眠状态”。这种酵母属于兼性厌氧菌，在动物胃肠道中能够消耗氧气，使肠道保持厌氧环境，能够促进有益菌群的繁殖，改善动物肠道微生态平衡，提高动物生产性能，属于活菌饲料。该产品活菌数每克不超过10,000个，酵母菌在动物胃的酸性环境中大部分受到抑制甚至杀死，由于活力低并且菌种品种单一，在肠道中无法形成生长优势，在健康动物体内有促进生长的作用，但作用不显著，一旦在动物肠道中有害菌群占主导地位，此为数不多的酵母将无法在肠道中定植下来，故起不到免疫调节作用。
4.亿隆达生物饲料是江西亿隆达生物科技开发有限公司生产的多菌种生物饲料。产品中主要是芽孢杆菌，光合细菌，硝化细菌形成的生物菌群，有效活菌数≥4.5
×
109cfu/ml，虽然产品中活菌数较高，但均为厌氧菌，在动物肠道中的存活率低，能够真正定植下来的微乎其微，故达不到益生菌的生物屏障作用。
技术实现要素：
5.本发明的目的是要解决现有生物饲料益生菌剂在动物肠道中的存活率低，无法抑制肠道内有害菌群的繁殖的问题，而提供高效培植畜禽肠道益生菌剂的制备方法。
6.高效培植畜禽肠道益生菌剂的制备方法，具体是按以下步骤制备的：
7.一、驯化：
①
、单独培养：对白地霉进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到白地霉菌种悬液；对谷氨酸棒杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到谷氨酸棒杆菌菌种悬液；对消化乳杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到消化乳杆菌菌种悬液；对枯草芽孢杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到枯草芽孢杆菌菌种悬液；对产朊假丝酵母进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于108个/ml为止，得到产朊假丝酵母菌种悬液；
②
、混合厌氧培养：将白地霉菌种悬液、谷氨酸棒杆菌菌种悬液、消化乳杆菌菌种悬液、枯草芽孢杆菌菌种悬液和产朊假丝酵母菌种悬液混合，然后在温度为35～39℃下厌氧培养5d～10d，得到厌氧培养后混合菌液；
③
、分离：对厌氧培养后混合菌液进行菌种分离，得到一次厌氧混合培养后白地霉、一次厌氧混合培养后产朊假丝酵母、一次厌氧混合培养后谷氨酸
棒杆菌、一次厌氧混合培养后消化乳杆菌和一次厌氧混合培养后枯草芽孢杆菌；
④
、以一次厌氧混合培养后白地霉、一次厌氧混合培养后产朊假丝酵母、一次厌氧混合培养后谷氨酸棒杆菌、一次厌氧混合培养后消化乳杆菌和一次厌氧混合培养后枯草芽孢杆菌分别代替白地霉、产朊假丝酵母、谷氨酸棒杆菌、消化乳杆菌和枯草芽孢杆菌按照步骤一
①
至
③
重复操作，共厌氧培养4～6次，得到厌氧混合驯化后白地霉、厌氧混合驯化后产朊假丝酵母、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌、厌氧混合驯化后消化乳杆菌和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌；
8.二、固液结合发酵：
①
、分别对厌氧混合驯化后白地霉、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌、厌氧混合驯化后消化乳杆菌和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到厌氧混合驯化后白地霉种子液、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌种子液、厌氧混合驯化后消化乳杆菌种子液和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌种子液；对厌氧混合驯化后产朊假丝酵母，培养至菌液中活菌数不低于108个/ml为止，得到厌氧混合驯化后产朊假丝酵母种子液；将厌氧混合驯化后白地霉种子液、厌氧混合驯化后产朊假丝酵母种子液、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌种子液、厌氧混合驯化后消化乳杆菌种子液和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌种子液混合后进行液态通风发酵，发酵至菌液中活菌数为108个/ml，得到液体发酵物；
②
、将液体发酵物进行固体扩大培养，培养至干重情况下固体培养基中总活菌种不低于4
×
109个/g，且干重情况下固体培养基中厌氧混合驯化后产朊假丝酵母的活菌数不低于4
×
108个/g，得到固体发酵产物；
9.三、干燥：对固体发酵产物进行低温真空干燥，且低温真空干燥中保证益生菌的灭活率控制在5％以内，生物酶及维生素的灭活率控制在2％以内，得到高效培植畜禽肠道益生菌剂。
10.本发明优点：
11.一、本发明高效培植畜禽肠道益生菌剂中总活菌种不低于4
×
109个/g，且厌氧混合驯化后产朊假丝酵母的活菌数不低于4
×
108个/g；远高于现有生物饲料益生菌剂。
12.二、本发明对白地霉、产朊假丝酵母、谷氨酸棒杆菌、消化乳杆菌和枯草芽孢杆菌采用混合厌氧培养形式进行驯化，多次重复混合厌氧培养和分离步骤，筛选出在厌氧环境下存活且能够快速繁殖的厌氧混合驯化后白地霉、厌氧混合驯化后产朊假丝酵母、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌、厌氧混合驯化后消化乳杆菌和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌；
13.二、本发明高效培植畜禽肠道益生菌剂中选择畜禽肠道中无拮抗的益生细菌(厌氧混合驯化后白地霉、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌、厌氧混合驯化后消化乳杆菌和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌)和益生酵母菌(厌氧混合驯化后产朊假丝酵母)共同发酵，在2h内益生细菌和益生酵母菌能够共同进入对数生长期，实现益生细菌和益生酵母快速定值；通过各种益生菌的协同作用使其逐渐形成生长优势并且在肠道中定植，在抑制有害菌生长的同时产生多种维生素、酶类、多肽及促生长因子和免疫活性物质，有效的增强了禽类、畜类机体免疫力，促进禽类、畜类快速生长。使禽类、畜类体质强健，免疫力增强，死亡率降低，生长速度增加，肉质优良，粪便无臭味，饲养场所周围易保持清洁卫生等。
14.三、本发明高效培植畜禽肠道益生菌剂应用于奶牛的饲料添加，在奶牛饲料中添加5％，5～7天后奶产量平均每天提高10％以上，同时大大降低了奶牛患乳房炎的几率，提高了无抗奶的产量。
具体实施方式
15.具体实施方式一：本实施方式是高效培植畜禽肠道益生菌剂的制备方法，具体是按以下步骤制备的：
16.一、驯化：
①
、单独培养：对白地霉进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到白地霉菌种悬液；对谷氨酸棒杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到谷氨酸棒杆菌菌种悬液；对消化乳杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到消化乳杆菌菌种悬液；对枯草芽孢杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到枯草芽孢杆菌菌种悬液；对产朊假丝酵母进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于108个/ml为止，得到产朊假丝酵母菌种悬液；
②
、混合厌氧培养：将白地霉菌种悬液、谷氨酸棒杆菌菌种悬液、消化乳杆菌菌种悬液、枯草芽孢杆菌菌种悬液和产朊假丝酵母菌种悬液混合，然后在温度为35～39℃下厌氧培养5d～10d，得到厌氧培养后混合菌液；
③
、分离：对厌氧培养后混合菌液进行菌种分离，得到一次厌氧混合培养后白地霉、一次厌氧混合培养后产朊假丝酵母、一次厌氧混合培养后谷氨酸棒杆菌、一次厌氧混合培养后消化乳杆菌和一次厌氧混合培养后枯草芽孢杆菌；
④
、以一次厌氧混合培养后白地霉、一次厌氧混合培养后产朊假丝酵母、一次厌氧混合培养后谷氨酸棒杆菌、一次厌氧混合培养后消化乳杆菌和一次厌氧混合培养后枯草芽孢杆菌分别代替白地霉、产朊假丝酵母、谷氨酸棒杆菌、消化乳杆菌和枯草芽孢杆菌按照步骤一
①
至
③
重复操作，共厌氧培养4～6次，得到厌氧混合驯化后白地霉、厌氧混合驯化后产朊假丝酵母、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌、厌氧混合驯化后消化乳杆菌和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌；
17.二、固液结合发酵：
①
、分别对厌氧混合驯化后白地霉、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌、厌氧混合驯化后消化乳杆菌和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到厌氧混合驯化后白地霉种子液、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌种子液、厌氧混合驯化后消化乳杆菌种子液和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌种子液；对厌氧混合驯化后产朊假丝酵母，培养至菌液中活菌数不低于108个/ml为止，得到厌氧混合驯化后产朊假丝酵母种子液；将厌氧混合驯化后白地霉种子液、厌氧混合驯化后产朊假丝酵母种子液、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌种子液、厌氧混合驯化后消化乳杆菌种子液和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌种子液混合后进行液态通风发酵，发酵至菌液中活菌数为108个/ml，得到液体发酵物；
②
、将液体发酵物进行固体扩大培养，培养至干重情况下固体培养基中总活菌种不低于4
×
109个/g，且干重情况下固体培养基中厌氧混合驯化后产朊假丝酵母的活菌数不低于4
×
108个/g，得到固体发酵产物；
18.三、干燥：对固体发酵产物进行低温真空干燥，且低温真空干燥中保证益生菌的灭活率控制在5％以内，生物酶及维生素的灭活率控制在2％以内，得到高效培植畜禽肠道益生菌剂。
19.具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一
①
中所述白地霉的保藏编号：accc20016，所述产朊假丝酵母的保藏编号：accc20060，所述谷氨酸棒杆菌的保藏编号：accc10159，所述消化乳杆菌的保藏编号：accc10173，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号：accc10114。其他与具体实施方式一相同。
20.具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同点是：步骤一
②
中将等体积的白地霉菌种悬液、谷氨酸棒杆菌菌种悬液、消化乳杆菌菌种悬液、枯草芽孢杆菌
菌种悬液和产朊假丝酵母菌种悬液进行混合。其他与具体实施方式一或二相同。
21.具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：步骤一
②
中在温度为37℃下厌氧培养7d，得到厌氧培养后混合菌液。其他与具体实施方式一至三相同。
22.具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：步骤一
④
中共厌氧培养5次。其他与具体实施方式一至四相同。
23.具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：步骤二
①
中所述液态通风发酵过程中厌氧混合驯化后白地霉种子液、厌氧混合驯化后产朊假丝酵母种子液、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌种子液、厌氧混合驯化后消化乳杆菌种子液和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌种子液的接种量相等，接种量为50～80ml/500ml。其他与具体实施方式一至五相同。
24.具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：步骤二
②
中所述液态通风发酵相关工艺条件：温度为35～40℃，发酵液ph为7～8，通气比为1:(0.5～1.5)，发酵罐罐压为0.02mpa～0.03mpa。其他与具体实施方式一至六相同。
25.具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是：步骤二
②
中所述固体扩大培养过程中，液体发酵物的接种量为50～80ml/10g。其他与具体实施方式一至七相同。
26.具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同点是：步骤二
①
中所述固体扩大培养相关工艺条件：温度为35～40℃，发酵液ph为7～8，通气比为1:(0.5～1.5)，发酵罐罐压为0.02mpa～0.03mpa。其他与具体实施方式一至八相同。
27.具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同点是：步骤三中所述低温真空干燥相关工艺条件：温度为50～70℃，真空度为-0.09kpa～0.03kpa，干燥时间8h～24h。其他与具体实施方式一至九相同。
28.本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
29.采用下述试验验证本发明效果：
30.实施例1：高效培植畜禽肠道益生菌剂的制备方法，具体是按以下步骤制备的：
31.一、驯化：
①
、单独培养：对白地霉进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到白地霉菌种悬液；对谷氨酸棒杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到谷氨酸棒杆菌菌种悬液；对消化乳杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到消化乳杆菌菌种悬液；对枯草芽孢杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到枯草芽孢杆菌菌种悬液；对产朊假丝酵母进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于108个/ml为止，得到产朊假丝酵母菌种悬液；
②
、混合厌氧培养：将白地霉菌种悬液、谷氨酸棒杆菌菌种悬液、消化乳杆菌菌种悬液、枯草芽孢杆菌菌种悬液和产朊假丝酵母菌种悬液混合，然后在温度为37℃下厌氧培养7d，得到厌氧培养后混合菌液；
③
、分离：对厌氧培养后混合菌液进行菌种分离，得到一次厌氧混合培养后白地霉、一次厌氧混合培养后产朊假丝酵母、一次厌氧混合培养后谷氨酸棒杆菌、一次厌氧混合培养后消化乳杆菌和一次厌氧混合培养后枯草芽孢杆菌；
④
、以一次厌氧混合培养后白地霉、一次厌氧混合培养后产朊假丝酵母、一次厌氧混合培养后谷氨酸棒杆菌、一次厌氧混合培养后消化乳杆菌和一次厌氧混合培养后枯草芽孢杆菌分别代替白地霉、产朊
假丝酵母、谷氨酸棒杆菌、消化乳杆菌和枯草芽孢杆菌按照步骤一
①
至
③
重复操作，共厌氧培养5次，得到厌氧混合驯化后白地霉、厌氧混合驯化后产朊假丝酵母、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌、厌氧混合驯化后消化乳杆菌和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌；
32.二、固液结合发酵：
①
、分别对厌氧混合驯化后白地霉、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌、厌氧混合驯化后消化乳杆菌和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌进行液体培养，培养至菌液中活菌数不低于109个/ml为止，得到厌氧混合驯化后白地霉种子液、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌种子液、厌氧混合驯化后消化乳杆菌种子液和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌种子液；对厌氧混合驯化后产朊假丝酵母，培养至菌液中活菌数不低于108个/ml为止，得到厌氧混合驯化后产朊假丝酵母种子液；将厌氧混合驯化后白地霉种子液、厌氧混合驯化后产朊假丝酵母种子液、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌种子液、厌氧混合驯化后消化乳杆菌种子液和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌种子液混合后进行液态通风发酵，发酵至菌液中活菌数为108个/ml，得到液体发酵物；
②
、将液体发酵物进行固体扩大培养，培养至干重情况下固体培养基中总活菌种不低于4
×
109个/g，且干重情况下固体培养基中厌氧混合驯化后产朊假丝酵母的活菌数不低于4
×
108个/g，得到固体发酵产物；
33.三、干燥：对固体发酵产物进行低温真空干燥，且低温真空干燥中保证益生菌的灭活率控制在5％以内，生物酶及维生素的灭活率控制在2％以内，得到高效培植畜禽肠道益生菌剂。
34.实施例1步骤一
①
中所述白地霉的保藏编号：accc20016，所述产朊假丝酵母的保藏编号：accc20060，所述谷氨酸棒杆菌的保藏编号：accc10159，所述消化乳杆菌的保藏编号：accc10173，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号：accc10114。
35.实施例1步骤一
②
中将等体积的白地霉菌种悬液、谷氨酸棒杆菌菌种悬液、消化乳杆菌菌种悬液、枯草芽孢杆菌菌种悬液和产朊假丝酵母菌种悬液进行混合
36.实施例1步骤二
①
中所述液态通风发酵过程中厌氧混合驯化后白地霉种子液、厌氧混合驯化后产朊假丝酵母种子液、厌氧混合驯化后谷氨酸棒杆菌种子液、厌氧混合驯化后消化乳杆菌种子液和厌氧混合驯化后枯草芽孢杆菌种子液的接种量相等，接种量为65ml/500ml。
37.实施例1步骤二
②
中所述液态通风发酵相关工艺条件：温度为37℃，发酵液ph为7.3，通气比为1:1.2，发酵罐罐压为0.03mpa。
38.实施例1步骤二
②
中所述固体扩大培养过程中，液体发酵物的接种量为70ml/10g。
39.实施例1步骤二
①
中所述固体扩大培养相关工艺条件：温度为37℃，发酵液ph为1.3，通气比为1:1.2，发酵罐罐压为0.03mpa。
40.实施例1步骤三中所述低温真空干燥相关工艺条件：温度为60℃，真空度为0.01kpa，干燥时间12h。
41.添加效果测试：将实施例1制备的高效培植畜禽肠道益生菌剂应用于奶牛的饲料添加，在奶牛饲料中添加5％，通过记录和计算，5天后奶产量平均每天提高10.6％，6天后奶产量平均每天提高11.1％，7天后奶产量平均每天提高11.4％。