一种尿液来源的膀胱癌肿瘤细胞类器官培养方法与流程

一种尿液来源的膀胱癌肿瘤细胞类器官培养方法
1.本技术要求2022年06月17日提交的中国发明专利申请【cn2022106906508】、名称为“一种尿液来源的膀胱癌肿瘤细胞类器官培养方法”的优先权，该优先权发明专利申请以引用方式全文并入。
技术领域
2.本发明属于类器官培养技术领域，具体涉及一种从尿液中分离膀胱癌肿瘤细胞并培养为类器官的方法。


背景技术：

3.长期以来，学术界都利用动物模型来进行疾病研究和动物开发，随着干细胞技术的发展，利用新的培养方法，将多能干细胞、成体干细胞或肿瘤细胞诱导产生一些类似于体内组织或者器官的三维结构，即类器官。利用类器官进行临床前用药测试或者临床同步用药检测试验已成为一大主流，相比于2d培养的肿瘤细胞系或pdx小鼠模型等，类器官优势在于更加贴近患者本身的肿瘤组织特征，获取结果时间缩短，结果判读更加直观。
4.膀胱癌大多是膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell carcinoma,btcc),其诊断主要是以膀胱镜和尿脱落细胞学检查为主。膀胱癌患者中存在的肿瘤细胞可能是由于肿瘤粘附力低，在快速增殖扩增的过程中脱落后随着尿液一起排出体外的，因此，目前对于膀胱癌患者尿液中脱落的肿瘤细胞的利用，基本上都是用于膀胱癌的检测。然而基于尿液样本本身的特点，例如文献资料《膀胱癌尿脱落细胞学检查与尿液肿瘤标志物研究进展》(杨青，李俊)指出，临床工作中发现尿液脱落细胞一般比其它腔积液细胞量少，因此利用尿液中脱落的肿瘤细胞获得高质量的诊断结果一直是研究追求的目标。基于这样的现实，目前还没有见到将膀胱癌患者尿液中的肿瘤细胞分离出来进一步培养的研究报道。
5.另一方面，根据临床指南，膀胱癌晚期因极易造成全身性的转移而不建议患者进行手术治疗，而是直接进行放化疗，但放化疗过程中由于患者的差异性，最终均会产生耐药性或者先天耐药。如果能够使用患者的肿瘤组织在体外进行肿瘤细胞的3d培养后提前筛药，针对每个患者制定精准的治疗方案，不仅可以减少患者的风险，还可以提高膀胱癌晚期患者的存活率和提高生存质量。
6.综上所述，找到一个可以获取非手术患者肿瘤细胞的方法，并结合3d肿瘤细胞培养，进而针对每个肿瘤患者进行精准临床前筛药，可以缓解现有技术中存在的不足。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于从膀胱癌患者的尿液中获得肿瘤细胞，并培养为膀胱癌类器官，具体技术方案如下。
8.一种尿液来源的膀胱癌肿瘤细胞类器官培养方法，包括如下步骤：
9.1)获取膀胱癌患者新鲜尿液(一般来讲，10-100ml就可以实现)；
10.2)进行第一轮低速离心以获得尿液中的细胞成分；经过第一轮低速离心以后的细
胞成分主要为上皮细胞，包括肿瘤细胞和正常脱落的非肿瘤细胞，少量免疫细胞，由于膀胱病变可能还有少量的红细胞；
11.3)离心后弃上清液，用预冷到10℃以下含有y-27632和primocine的dmem/f12培养基重悬细胞，进行第二轮低速离心；
12.4)离心后弃上清液，沉淀中明显的红色用裂红液去除，以及用cd45磁珠吸附去除免疫细胞；
13.5)进行第三轮低速离心去除剩余的杂质细胞以获得膀胱癌肿瘤细胞；
14.6)将所述步骤5)中获得的膀胱癌肿瘤细胞与基质胶混合重悬，种植于孔板内，待基质胶凝固后加入适合类器官生长的培养基培养到形成可传代的类器官体积。
15.在上述培养方法中，步骤3)中加入的y-27632是rho激酶(rock)的抑制剂，能够减少细胞凋亡和有效维持细胞的增殖生长。primocine是抗真菌和细菌的抗菌剂，因为尿液中可能存在污染物，因此加入primocine可避免获得的细胞在类器官培养时被污染。
16.进一步，所述步骤2)中第一轮低速离心操作为300-600g离心10-30min。
17.进一步，所述步骤3)中第二轮低速离心操作为300-600g离心10-30min。
18.进一步，所述步骤5)中第三轮低速离心操作为200-400g离心5-10min。
19.进一步，所述步骤4)中cd45磁珠的用量比例为每2
×
107个细胞加入250ul体积的磁珠。
20.进一步，所述步骤6)中的基质胶为matrigel基质胶，所述适合类器官生长的培养基包括dmem/f12基础培养基、rspo1条件培养基和/或rspo3条件培养基中的一种或多种。
21.进一步，所述培养基中还可以加入适合类器官培养的生长因子，所述生长因子包括penicillin/streptomycin、primocine、glutamax、b27、n-acetylcysteine、egf、fgf10、y27632和/或a8301中的一种或多种。
22.上述培养方法培养的膀胱癌肿瘤细胞类器官。
23.上述膀胱癌肿瘤细胞类器官在制备膀胱癌药物筛选模型中的应用。
24.进一步，所述膀胱癌肿瘤细胞类器官可用于判断抗膀胱肿瘤药物的耐药性，所述药物包括吉西他滨、顺铂和5-氟尿嘧啶(5-fu)。本发明还可以筛选一些fda批准，但并没有纳入此类肿瘤治疗指南的药物，以获得更加有效和具有前瞻性的治疗方案。
25.本发明所述的“耐药性”，是指患者的肿瘤组织对药物的应答程度。
26.有益技术效果
27.1)根据膀胱癌患者的特性，本发明团队从患者的尿液中提取膀胱癌肿瘤细胞，由于尿液样品极易获得，因此采样方便且避免了造成患者的创伤(与穿刺取样相比)。本发明的方法只需采集10-100ml尿液就可以实现膀胱癌肿瘤细胞的分离提取。
28.2)膀胱癌患者的尿液中包括红细胞，白细胞和上皮细胞(包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞)。本发明方法先利用低速梯度离心，获得尿液中的全部细胞，然后再多次利用低速梯度离心并结合裂红液和cd45磁珠，去除掉大量的红细胞、免疫细胞、杂质细胞等，获得纯净的膀胱癌肿瘤细胞。最后进一步对膀胱癌肿瘤细胞进行富集和扩增将其培养为膀胱癌类器官，再利用培养好的膀胱癌类器官进行肿瘤药物的筛选。
29.3)由于肿瘤的异质性，不同患者对不同的化疗药物的反应，甚至对同一种药物的反应或反应程度都是不同的。现在并没有一个很明确的指南可以在用药前告知医生每个患
者对某种药物的反应程度，因此有可能使用某种药物后能够有效抑制肿瘤生长，有可能只是一定程度的抑制但不完全，还有可能甚至是完全无反应。本发明通过提取患者的尿液获取患者的肿瘤细胞，然后培养为对应的类器官(又称为3d肿瘤细胞团)，在短时间内对此类器官进行体外药物种类和药物浓度测试，能够及时看出患者对药物的反应程度，对后续的临床治疗起到一定的指导作用。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
31.图1为从尿液中提取膀胱癌肿瘤细胞、富集及培养流程图；
32.图2为本发明培养的膀胱肿瘤类器官白光图；
33.图3为本发明培养的膀胱癌肿瘤类器官苏木精-伊红染色；
34.图4为本发明尿液样品来源的膀胱肿瘤类器官筛选不同药物结果。
具体实施方式
35.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
37.在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
38.实施例一
39.膀胱癌晚期患者尿液样品中肿瘤细胞的分离及三维培养
40.1)取肿瘤患者50ml左右新鲜尿液于离心管中；
41.2)低速300-600g，离心10-30min；
42.3)离心后弃上清，用5ml预冷到10℃以下含有10μm y-27632和0.1mg/ml primocine的dmem/f12重悬细胞，低速300-600g，离心10-30min
43.4)弃上清，沉淀中见明显红色可选择性使用裂红液裂解去除红细胞；
44.5)用cd45吸附免疫细胞，未吸附的细胞悬液收集于15ml离心管内，低速离心200-400g，5-10min；
45.6)去上清后置于冰上用60μl基质胶重悬，种植于48孔板内，每孔30μl，种两孔。待基质胶凝固后即可加入150μl适合膀胱癌肿瘤细胞类器官生长的培养基，置于37度，5％co2的细胞孵箱内培养。培养基如下；
46.在上述表格中，penicillin/streptomycin和primocine均用于防止细胞污染；hepes是一种缓冲液，用于调节培养基ph值，使培养基处于中性状态(即人体内的中性ph)，适宜细胞生长，不会因为过酸或过碱导致细胞死亡；glutamax可显著减少有毒氨的积累，改善细胞活力和生长情况，在很宽的温度范围内保持稳定；n-acetylcysteine用于抑制细胞的ros；rspo1用于维持细胞的干性；b27早期适用于神经细胞的培养，维持细胞的生长；egf，即表皮生长因子，有助于表皮细胞或者上皮细胞的生长；fgf10用于促进和维持细胞的分裂和增殖；a8301是tgf-β通路的抑制剂，用于维持细胞的活性与增殖。
47.以下对本发明提供的分离方法进行效果验证。
48.表1尿液样品红细胞白细胞其他免疫细胞肿瘤细胞其他第一轮离心++++++++第二轮离心++++++-裂红液-+++++-磁珠分选
‑‑
++-第三轮离心
‑‑‑
+-其中，“+”代表细胞团块的数量，其中以大约105为一个“+”值；
“‑”
代表低于102。
49.表2
50.需要注意的是，离心力和时间是相对的，可以低速长时间的离心，但时间越久细胞活性越低，因此不能简单的进行长时间低速离心操作。
51.实施例二
52.膀胱肿瘤类器官苏木精-伊红染色
53.苏木精-伊红染色是临床上用于诊断肿瘤病理类型的“金标准”。对培养的类器官进行苏木精-伊红染色，与对应的来源的肿瘤组织进行对比，可以判断出培养的类器官是否是对应患者来源的肿瘤。另外，还可以直接通过类器官判断患者肿瘤的病理类型。
54.1)培养后的肿瘤类器官生长到直径达30-50μm时吸去培养基，加入1ml 4％pfa溶液，室温固定过夜；
55.2)去掉4％fa后，将细胞转移至1.5ml离心管中，进行乙醇梯度脱水，依次加入1ml的70％乙醇，80％乙醇，95％乙醇，无水乙醇，各15min；
56.3)加入二甲苯进行透明化5min；
57.4)加入融化后的石蜡，浸蜡过夜；
58.5)包埋后切成5μm厚度贴于粘附载玻片上，置于65度烘片机，15min-30min；
59.6)将玻片依次浸入二甲苯，100％乙醇，95％乙醇，各三次，每次3min，再浸入超纯水，一次3min；
60.7)苏木精滴于类器官组织位置，10s后立即用流水冲洗数分钟；
61.8)浸入盐酸-酒精溶液1min,流水冲洗2-3min后，浸入1％碳酸氢钠溶液中1min，再次用流水冲洗1min；
62.9)伊红浸染10s,流水冲洗至无浮色；
63.10)将玻片依次浸入95％乙醇，100％乙醇，二甲苯，各三次，每次3min；
64.11)用中性树脂封片可长期保存。
65.本发明图3中的苏木精-伊红染色照片中，从细胞核的形态(形态各异，不规则，具有异质性)可判定为肿瘤细胞。由于是从罹患膀胱癌的患者尿液中提取的细胞，培养基成分有只适合于上皮细胞生长，所以几乎可以肯定其富集获得并培养出来的类器官为膀胱癌类器官。
66.实施例三
67.利用培养的膀胱肿瘤类器官进行临床前药物处理检测药物反应情况
68.本实施例利用尿液中分离提取的肿瘤细胞进行类器官的培养不仅能进行有效的扩增，而且利用扩增后的肿瘤类器官可以进行药物敏感性检测，为患者提供临床前用药指导。
69.1)培养后的肿瘤类器官生长到直径达50-100μm时可进行传代；
70.2)用tryple重悬后转移至15ml离心管中，吹打50次，置于37度水浴锅中5min，反复多次直至消化为单细胞；
71.3)利用传统的血细胞计数板计数，每孔为2000个的细胞密度，5μl每孔重悬细胞种植于96孔板内；
72.4)待基质胶凝固后加入培养基，培养基同实施例一；
73.5)培养第二天，利用培养基配制药物浓度，设置多个浓度梯度(0.01,0.1,1,10,100um,共五个浓度梯度)，每种浓度梯度有三个复孔，依次加入药物培养基混合溶液，培养
48-72h；本实施中加入的药物包括吉西他滨、顺铂和5-氟尿嘧啶。
74.6)去除药物培养基混合溶液，用pbs轻柔涮洗类器官培养孔，加入配制的cck8溶液，避光37度孵育1小时左右。
75.cck8是常用的细胞活性检测试剂盒。加入药物后，检测出的数值可以定量的反映细胞的活性，通过与未加药组进行对比，计算出细胞对此药物的反应浓度，五个浓度梯度，可以画出一条曲线，通过软件可以计算出ic50值。
76.7)用酶标仪测量波长为405nm处的吸光度值，记录并分析。结果如下表：
77.表3表3
78.可以从结果看出，三种药物虽然都是常见的化疗药物，但最终获得的ic50值不一样，吉西他滨ic50为156.5um，顺铂的ic50为11.05um，5-fu为13.04um。ic50越大说明杀死一半细胞所用的药物浓度就越高，而顺铂的ic50比5-fu低，表明顺铂的杀伤效果最好，因此该患者对顺铂最敏感，对吉西他滨反应程度最低，后续化疗用药可以首选顺铂和5-fu。
79.可以理解的是，本实施例使用的是常规膀胱癌临床用药，但并不限于后续可以使用本发明从尿液样品获取的肿瘤类器官大规模筛选非常规的fda批准用药。
80.上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。