芫花根中分离的愈创木烷型倍半萜类化合物及其制备方法和应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及从植物芫花根中制备的愈创木烷型倍半萜类化合物及其制备方法，以及这类化合物在抗阿尔兹海默症方面的应用。


背景技术：

2.芫花根属于瑞香科(thymelaeaceae)瑞香属植物芫花(daphne genkwa sieb.et zucc.)的根部，是一味常用中药，其具有悠久的入药历史，性温，味辛、苦，平，有毒，有清热解毒，止咳平喘，消肿利尿之功效，分布于长江流域各省与黄河流域部分地区。常用于痈疮肿毒、荨麻疹、水肿、风湿性及类风湿性关节炎等疾病的治疗。药理学研究表明芫花根具有一定的抑菌作用、抗炎作用、神经保护活性、抗肿瘤作用，碳酸溶解部分对动物子宫有明显的兴奋作用。
3.随着全球人口老龄化加重，神经退行性疾病受到较多的关注，阿尔茨海默氏症和帕金森症等成为导致中老年人死亡的主要杀手。近年来研究表明，抑制乙酰胆碱酯酶可以延缓神经退行性疾病的进程，同时能够防止神经元发生病变，对于治疗神经退行性疾病有着很好的前景。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供13种从瑞香科瑞香属植物芫花[daphne genkwa sieb.et zucc.]根中分离得到的愈创木烷型倍半萜类化合物，结构如下所示：
[0005]
[0006][0007]
所述愈创木烷型倍半萜类化合物是从芫花根中提取分离得到，所述芫花根是指瑞香科瑞香属植物芫花的干燥根皮。
[0008]
本发明所述愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0009]
取干燥的芫花根以70％-80％工业乙醇提取，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯萃取，并将所得组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统100:0-0:100进行等度梯度洗脱，共收集到三个流份a-c。
[0010]
流份b经hp20柱色谱，以乙醇-水系统0:100-100:0进行梯度洗脱，得四个组分b1、b2、b3和b4。利用ods柱色谱将组分b1以乙醇-水系统10:90-90:10进行梯度洗脱，得五个组分a-e。
[0011]
所得组分b经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统100:1-10:1在tlc分析的基础上得到四个亚组分b1-b4。
[0012]
在制备性反相高效液相色谱上使用甲醇-水(70:30，v/v)的流动相来分离b1和b2得到化合物1-13。
[0013]
上述制备方法中，所述提取为回流提取，提取2-3次，每次2-3小时。
[0014]
所述芫花根为瑞香科瑞香属植物芫花[daphne genkwa sieb.et zucc.]的根。
[0015]
所得化合物经过系统结构鉴定结果如下：
[0016]
利用高分辨质谱，一维nmr、二维nmr、计算ecd及nmr技术对化合物1-13的结构鉴定(如图1-26)。
[0017]
daphnegenol a(1):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)，hresims给出准分子离子峰m/z 289.1415[m+na]
+
(calcd.for c
15h22
o4na 289.1410),结合1h和
13
c nmr确定其分子式为c
15h22
o4，计算其不饱和度为5。
[0018]1h nmr(600mhz,dmso-d6)中,δ
h 1.62(3h,s,h-15),1.14(3h,s,h-14),1.08(3h,s,h-12)为三个甲基信号，δ
h 3.56(1h,dd,j＝10.5,4.5hz,h-13a),3.11(1h,dd,j＝10.5,4.8hz,h-13b)为一对磁不等同的ch2上偕偶氢信号，δ
h 4.40(1h,s,oh-10),4.73(1h,t,j＝5.2hz,oh-13)为活泼氢信号。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)谱中共显示15个碳信号，结合hsqc谱分析，推测化合物中包括1个羰基碳信号δ
c 203.9(c-3)，2个烯烃碳信号δc136.2(c-4),166.9(c-5)，4个连氧碳信号δ
c 83.9(c-1),75.5(c-10),76.6(c-11),66.1(c-13)，1个次甲基碳信号δ
c 32.1(c-7)，4个亚甲基碳信号δ
c 47.3(c-2),24.6(c-6),22.3(c-8),36.0(c-9)以及3个甲基碳信号δ
c 24.2(c-12),24.8(c-14),7.8(c-15)。
13
c-nmr(150mhz,cdcl3)中共有29个碳信号，其中δ
c 176.5提示为羰基碳信号，δ
c 148.8,144.9,136.5,132.5,132.1,131.9,131.6,124.5,123.8,122.2,117.4,111.4为12个sp2杂化碳信号，结合其氢谱推测该结构中含有一个四取代的苯环和三个双键(包括一个顺式双键)。高场区给出16个脂肪族碳信号。通过二维谱数据分析进一步对其结构进行了确定。
[0019]
根据hmbc谱，δ
h 2.70,1.85(h-2)与δ
c 83.9(c-1),203.9(c-3),136.2(c-4),166.9
(c-5)，这表明结构中有一个五元环。δ
h 2.75,2.50(h-6)与δ
c 83.9(c-1),166.9(c-5),136.2(c-4),76.6(c-11)相关，δ
h 1.55,1.55(h-8)与δ
c 24.6(c-6),32.1(c-7),36.0(c-9),75.5(c-10)相关确定了化合物1为5/7二环骨架。δ
h 1.08(h-12)与δ
c 76.6(c-11),32.1(c-7),66.1(c-13)相关说明c-11与c-7,c-12,c-13相连，这组成了一个愈创木烷型倍半萜的骨架。δ
h 1.14(h-14)与δ
c 83.9(c-1),75.5(c-10),36.0(c-9)相关，δ
h 1.62(h-15)与δ
c 203.9(c-3),136.2(c-4),166.9(c-5)相关，确定了两个甲基分别连在10位和4位。根据hmbc信号δ
h 4.40(oh-10)与δ
c 83.9(c-1),75.5(c-10),36.0(c-9),24.8(c-14)相关，4.73(oh-13)与δ
c 66.1(c-13),76.6(c-11)相关确定了两个羟基分别连在10位与13位上。化合物1共有5个不饱和度，愈创木烷骨架占去2个不饱和度，双键和羰基各占1个不饱和度，还有一个不饱和度推测由c-1与c-11通过氧原子连接成环所得，由此确定了化合物1的平面构型。
[0020]
化合物1的相对构型由noesy谱与x-单晶衍射确定。h-12/h-6β存在noe相关，说明me-12和h-6β处于同侧，h-14/h-13存在noe相关，说明h-13与me-14处于同侧，结合x-单晶衍射结果，由此确定了化合物的相对构型和绝对构型。该化合物的通过计算ecd并与实测ecd相比较的方法验证其绝对构型，首先，利用spartan 14.0在mmff94力场下进行构象搜索，选择玻尔兹曼(boltzmann)分布大于1％的构象在b3lyp/6-31g(d)基组水平下优化后，进一步在b3lyp/6-311++g(2d,p)基组水平下进行激发态计算，最终使用specdis软件拟合ecd谱。化合物1与计算的1r,7r,10r,11s构型吻合较好，由此确定了化合物的绝对构型。
[0021]
daphnegenol b(2):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)，hresims给出准分子离子峰m/z 289.1412[m+na]
+
(calcd for c
15h22
o4na,289.1410)，结合1h-nmr和
13
c-nmr推断其分子式为c
15h22
o4，计算其不饱和度为5。
[0022]1h nmr(600mhz,dmso-d6)谱中显示有1个烯碳信号δ
h 5.96(1h,d,j＝1.2hz,h-9)，3个活泼氢信号δ
h 4.77(1h,s,oh-7),4.38(1h,o,oh-4),4.37(1h,o,oh-13)；2个甲基信号δh2.02(3h,d,j＝1.2hz,h-14),1.17(3h,s,h-15)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)谱中共显示15个碳信号，结合hsqc谱分析，推测化合物中包括1个羰基碳信号δ
c 202.1(c-8)，2个烯烃碳信号δ
c 172.7(c-10),127.5(c-9)，3个连氧碳信号δ
c 78.6(c-4),81.0(c-7),62.0(c-13)，1个sp3杂化的季碳信号δ
c 50.9(c-1)，2个次甲基碳信号δ
c 56.9(c-5),45.0(c-11)，5个亚甲基碳信号δ
c 32.2(c-2),39.9(c-3),33.6(c-6),30.5(c-12)以及2个甲基碳信号δ
c 22.3(c-14),26.3(c-15)。
[0023]
根据1h-1
h cosy谱，化合物2有两个自旋耦合体系，hmbc谱中δ
h 2.13(h-2)与δ
c 50.9(c-1),172.7(c-10),78.6(c-4),30.5(c-12)存在相关，δ
h 1.40(h-2)与δ
c 39.9(c-3),56.9(c-5),78.6(c-4)存在相关，δ
h 1.68(h-3)与δ
c 32.2(c-2),50.9(c-1),78.6(c-4)存在相关，确定了五元环片段。δ
h 5.96(h-9)与δ
c 22.3(c-14),50.9(c-1),81.0(c-7),172.7(c-10)存在相关,1.64(h-6)与δ
c 81.0(c-7),202.1(c-8)存在相关，1.51(h-6)与δ
c 50.9(c-1),81.0(c-7),56.9(c-5),202.1(c-8)存在相关，确定化合物含有一个七元环片段。δ
h 1.17(h-15)与δ
c 39.9(c-3),78.6(c-4),56.9(c-5)存在相关，δ
h 2.02(h-14)与δ
c 50.9(c-1),127.5(c-9),172.7(c-10)存在相关，由此确定了两个甲基的位置，δ
h 4.38(h-4)与δ
c 39.9(c-3),78.6(c-4),56.9(c-5),26.3(c-15)存在相关,δ
h 4.77(h-7)与δ
c 33.6(c-6),81.0(c-7),202.1(c-8),45.0(c-11)存在相关,δ
h 4.37(oh-13)与δ
c 45.0(c-11),62.0(c-13)存在相关，确定了三个羟基的位置，δ
h 2.91(h-13)与δc30.5(c-11),45.0(c-12)存在相
8),64.2(c-13)，2个sp3杂化的季碳信号δ
c 43.6(c-2),49.2(c-2)，1个次甲基碳信号δ
c 33.7(c-2),3个亚甲基碳信号δ
c 46.6(c-9),44.7,(c-3)33.9(c-6)和3个甲基碳信号δ
c 18.2(c-2),14.1(c-2),12.3(c-2)。
[0030]
hmbc谱中δ
h 2.47(h-3)与δ
c 204.9(c-2),176.5(c-5),143.6(c-1),33.7(c-4)和18.2(c-15)存在相关，δ
h 2.60(h-1)与δ
c 176.5(c-5),143.6(c-1),44.7(c-3)和18.2(c-15)存在相关，说明其为一个含有α,β-不饱和酮片段的五元环结构。δ
h 1.07(h-15)与δ
c 176.5(c-5),44.7(c-3)和33.7(c-4)相关，说明c-15连在c-4上。δ
h 2.67(h-6)与δ
c 176.5(c-5),143.6(c-1),83.5(c-7),76.8(c-8),49.2(c-11)和33.7(c-4)存在相关，δ
h 2.14(h-9)与δ
c 143.6(c-1),43.6(c-10)相关，说明存在一个七元环，δ
h 0.83(h-12)与δ
c 83.5(c-7),64.2(c-13),43.6(c-10),49.2(c-11)相关，δ
h 3.79(h-13)与δ
c 83.5(c-7),49.2(c-11),43.6(c-10)和12.3(c-12)相关，说明c-11与c-10,c-7相连，由此化合物平面结构得到确定。
[0031]
根据noesy谱图，h-15与h-6β相关，h-6β与h-12相关，同时结合x-单晶衍射，确定化合物的绝对构型为4s,7s,10r,11r.通过计算ecd与实测ecd相比较的方法验证了化合物3的绝对构型。故该化合物的绝对构型为4s,7s,10r,11r。
[0032]
daphnegenol d(4):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)，hresims给出准分子离子峰m/z 289.1412[m+na]
+
(calcd for c
15h22
o4na,289.1410)，结合1h-nmr和
13
c-nmr推断其分子式为c
15h22
o4，计算其不饱和度为5。
[0033]1h nmr(600mhz,dmso-d6)谱中，δ
h 5.64(1h,s,h-2)为一个烯碳信号，δ
h 5.05(1h,d,j＝3.9hz,8-oh),5.01(1h,s,7-oh),4.80(1h,s,13-oh)信号为3个活泼氢质子信号，δ
h 3.78(1h,dd,j＝11.1,2.3hz,h-13a),3.45(1h,dd,j＝11.1,5.5hz,h-13b),1.87(1h,dd,j＝12.1,8.7hz,h-6α),1.49(1h,dd,j＝12.1,12.1hz,h-6β)为两对偕耦亚甲基信号。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)谱中共显15个碳信号，结合hsqc谱的分析，δ
c 211.3(c-3),190.7(c-1),122.4(c-2)为α,β-不饱和酮信号，δ
c 83.1(c-7),75.1(c-8),64.5(c-13)提示结构中含有3个连氧sp3杂化碳，δ
c 50.2(c-11),46.4(c-10),42.9(c-9),42.6(c-4),38.3(c-5),30.8(c-6)提示结构中有6个sp3杂化碳，δ
c 17.1(c-14),13.0(c-12),12.6(c-15)提示结构中有3个甲基。
[0034]
hmbc谱中，δ
h 5.63(h-2)与δ
c 211.3(c-3),190.7(c-1),46.4(c-10),42.6(c-4),38.3(c-5)相关，表明结构中含有一个五元环，δ
h 4.33(h-8)与δ
c 83.1(c-7),46.4(c-10),42.9(c-9),36.8(c-6)存在相关，表明结构中含有一个七元环，δ
h 0.66(h-12)与δ
c 50.2(c-11),64.5(c-13),46.4(c-10),83.1(c-7)相关，证明c-11位与c-7，c-10和c-12相连，δ
h 1.04(h-14)与δ
c 190.7(c-1),50.2(c-11),42.9(c-9)存在相关，δ
h 0.96(h-15)与δ
c 211.3(c-3),38.3(c-5)确定了另外两个甲基的位置，以及结合1h-1
h cosy谱显示3个自旋系统，最终确定了化合物4的平面结构。
[0035]
化合物4的相对构型由noesy谱确定。h-14与h-12存在相关，h-12与h-15存在相关，h-5与h-9α存在相关，h-9β与h-14存在相关，再结合结合计算核磁和dp4+分析确定化合物4的相对构型为4r*,5s*,7s*,8r*,10s*,11r*。化合物4的绝对构型是通过计算ecd与实测ecd相比较的方法确定的，由此确定了化合物4的绝对构型为1r,7r,10s。
[0036]
表2化合物3和4的1h(600mhz)与
13
c(150mhz)nmr数据(dmso-d6)
[0037][0038][0039]
daphnegenol e(5):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)，hresims给出准分子离子峰289.1411[m+na]
+
(calcd for c
15h22
o4na,289.1410)，确定该化合物的分子式为c
15h22
o4,不饱和度为5。
[0040]1h nmr(600mhz,dmso-d6)谱中显示有3个羟基氢信号δ
h 4.99(1h,s,oh-7),4.99(1h,s,oh-8),4.80(1h,br.s,oh-13)；3个甲基质子信号δ
h 0.67(3h,s,h-12),1.03(3h,s,h-14),1.04(3h,o,h-15)；1个双键氢信号δ
h 5.64(1h,d,j＝1.8hz,h-2)；1组亚甲基氢信号3.79(1h,d,j＝11.1hz,h-13a),3.44(1h,d,j＝11.1hz,h-13b)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)谱中共显示15个碳信号，结合hsqc谱分析，推测化合物中包括1个羰基碳信号δ
c 209.4(c-3),2个双键碳信号δ
c 189.4(c-1),122.6(c-2),3个连氧脂肪碳信号δ
c 83.0(c-7),75.0(c-8),64.6(c-13)，6个脂肪碳信号δ
c 49.1(c-4),43.7(c-5),35.3(c-6),42.7(c-9),46.1(c-10),50.3(c-11)以及3个甲基碳信号δ
c 13.4(c-12),17.0(c-14),13.6(c-15)。
[0041]
hmbc谱中δ
h 5.64(h-2)与δ
c 209.4(c-3),189.4(c-1),46.1(c-10),49.1(c-4),43.7(c-5)相关，表明结构中含有一个五元环，δ
h 4.33(h-8)与δ
c 83.0(c-7),46.1(c-10),42.7(c-9),35.3(c-6)存在相关，表明结构中含有一个七元环，δ
h 0.67(h-12)与δ
c 50.3(c-11),64.6(c-13),46.1(c-10),83.0(c-7)相关，证明c-11位与c-7，c-10和c-12相连，δ
h 1.03(h-14)与δ
c 189.4(c-1),50.3(c-11),42.7(c-9)存在相关，δ
h 1.04(h-15)与δ
c 209.4(c-3),43.7(c-5)确定了另外两个甲基的位置，结合其1h-1
h cosy谱相关，可以连接出以下片段，因而确定了化合物5的平面结构。
[0042]
化合物5的相对构型由noesy谱与计算核磁确定。h-15/h-5,h-5/h-9α,h-9β/h-14,h-12/h-14,h-9β/h-13存在noe相关，结合计算核磁和dp4+分析确定了化合物的相对构型为4s*,5s*,7s*,8r*,10s*,11r*。该化合物的绝对构型是通过比较实测ecd与计算ecd的方法
确定的，故该化合物的绝对构型为4s,5s,7s,8r,10s,11r。
[0043]
daphnegenol f(6):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)。hresims给出准分子离子峰305.1394[m+na]
+
(calcd for c
15h22
o5na，305.1359)，确定该化合物的分子量为282，分子式为c
15h22
o5，计算不饱和度为5。
[0044]1h nmr(600mhz,dmso-d6)谱中，δ
h 2.09(3h,d,j＝2.5hz,h-14)，0.72(3h,d,j＝7.1hz,h-15)为两个甲基信号；δ
h 4.38(1h,s,oh-11)，4.46(1h,o,oh-13)，5.10(1h,d,j＝4.6hz,oh-8)为3个活泼氢信号。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)谱中共显示15个碳信号，结合hsqc谱分析，推断化合物中包括1个羰基碳信号δ
c 207.7(c-2)，2个烯碳信号δ
c 138.0(c-1)，143.0(c-10)，5个连氧碳信号δ
c 67.2(c-8),81.1(c-9),75.0(c-11),64.2(c-12),62.4(c-13),3个次甲基碳信号δ
c 30.6(c-4)，39.1(c-7)，39.4(c-5)，2个亚甲基信号δ
c 29.4(c-6)，48.7(c-3)，2个甲基碳信号δ
c 15.6(c-15)，18.5(c-14)。
[0045]
hmbc谱中δ
h 2.45(h-3)与δ
c 30.6(c-4),15.6(c-15),207.7(c-2),138.0(c-1),39.4(c-5)存在相关，δ
h 2.14(h-4)与δ
c 207.7(c-2),138.0(c-1)存在相关，说明其存在一个五元环片段。δ
h 0.72(h-15)与δ
c 48.7(c-3),39.4(c-5),30.6(c-4)存在相关，说明c-15连在c-4上。δ
h 1.73(h-6)与δ
c 39.1(c-7),75.0(c-11)存在相关，δ
h 4.46(h-8)与δ
c 143.0(c-10),81.1(c-9),39.1(c-7),29.4(c-6)存在相关，δ
h 4.06(h-9)与δ
c 143.0(c-10),138.0(c-1),67.2(c-8),62.4(c-12),39.1(c-7),18.5(c-14)存在相关，说明存在一个七元环。δ
h 3.32(h-12)与δ
c 81.1(c-9),75.0(c-11),39.1(c-7)存在相关，与c-9(δ
c 81.1),c-12(δ
c 62.4)的化学位移值，说明了六元氧环结构片段的存在。δ
h 2.09(h-14)与δ
c 207.7(c-2),143.0(c-10),138.0(c-1),81.1(c-9)存在相关，说明c-14连在c-10上。δ
h 3.31(h-13)与δ
c 39.1(c-7),62.4(c-12),75.0(c-11)存在相关，说明c-13与c-11相连。由此可确定化合物6的平面结构。
[0046]
化合物6的相对构型由noesy谱与计算核磁共同确定。h-7/h-9,h-7/oh-8,h-9/oh-8,oh-8/h-5,h-13/h-6之间存在noe相关。对(4s*,5s*,7s*,8r*,9r*,11s*)-6和(4r*,5s*,7s*,8r*,9r*,11s*)-6进行计算核磁，确定化合物6的相对构型为4s*,5s*,7s*,8r*,9r*,11s*。该化合物的绝对构型是通过比较实测ecd与计算ecd的方法确定的，故该化合物的绝对构型为4s,5s,7s,8r,9r,11s。
[0047]
表3化合物5和6的1h(600mhz)与
13
c(150mhz)nmr数据((dmso-d6)
[0048]
[0049][0050]
daphnegenol g(7):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)，hresims给出准分子离子峰m/z 291.1525[m+na]
+
(calcd for c
15h24
o4na,291.1567)，结合1h nmr和
13
c nmr推断其分子式为c
15h24
o4，计算其不饱和度为4。
[0051]1h nmr(600mhz,dmso-d6)谱中显示有3个活泼氢信号δ
h 5.20(1h,s,10-oh),4.42(1h,s,13-oh),3.99(1h,s,11-oh)；3个甲基信号δ
h 0.95(3h,s,h-12),1.56(3h,s,h-15),0.61(3h,d,j＝7.0hz,h-14)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)谱中共显示15个碳信号，结合hsqc谱分析，推测化合物中包括1个羰基碳信号δ
c 204.3(c-3)，2个烯碳信号δc173.2(c-5),136.3(c-4)，3个连氧碳信号δ
c 81.3(c-1),73.9(c-11),67.6(c-13)，2个次甲基碳信号δ
c 39.2(c-10),41.2(c-7)，4个亚甲基碳信号δ
c 23.6(c-8),30.6(c-6),31.0(c-9),50.7(c-2)以及3个甲基碳信号δ
c 20.3(c-12),14.4(c-14),7.6(c-15)。
[0052]
通过1h-1
h cosy谱发现，化合物7有一个自旋耦合体系，根据hmbc谱中δ
h 2.42(h-2)与δ
c 81.2(c-1),204.3(c-3),39.2(c-10),136.3(c-4)，δ
h 1.56(h-15)与δ
c 204.3(c-3),136.3(c-4),173.2(c-5)存在相关，结合
13
c nmr确定化合物中包含一个五元环片段，c-15连在c-4上。δ
h 1.35(h-9)与δ
c 81.2(c-1),39.2(c-10),31.0(c-9),23.6(c-8)和41.2(c-7)存在相关，δh2.65(h-6)与δ
c 23.6(c-8)存在相关,确定了七元环的结构。δ
h 5.20(oh-1)与δ
c 40.4(c-10),δc81.3(c-1),δ
c 173.2(c-5)存在相关；δ
h 3.99(oh-11)与δ
c 73.9(c-11),δ
c 67.6(c-13),δ
c 20.3(c-12)存在相关；δ
h 3.30(oh-13)与δ
c 20.3(c-12),δ
c 73.9(c-11)存在相关，确定了三个羟基的位置；δ
h 0.95(h-12)与δ
c 41.1(c-7)，δ
c 73.9(c-11),δ
c 67.6(c-13)的相关说明甲基连在c-12上，由此，确定了化合物7的平面结构。
[0053]
化合物7的相对构型由noesy谱确定。h-2α和h-14存在相关，h-2β和oh-1之间的存在相关，说明me-14和oh-1处于异面。通过计算核磁和dp4+分析确定其相对构型为1r*,7r*,10s*,11s*。该化合物的绝对构型是通过比较实测ecd与计算ecd的方法确定的，计算的1r,7r,10s,11s构型与实测的ecd的图谱吻合度较高，故确定该化合物的绝对构型为1
′
s,1"r,4"s,6"r。
[0054]
daphnegenol h(8):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)，hresims给出准分子离子峰m/z 289.1415[m+na]
+
(calcd for c
15h22
o4na,289.1410)，结合1h-nmr和
13
c-nmr推断其分子式为c
15h22
o4，计算其不饱和度为5。
[0055]1h nmr(600mhz,dmso-d6)谱中显示有3个活泼氢信号δ
h 5.25(1h,s,oh-1),4.80(1h,t,j＝5.5hz,oh-13),4.45(1h,s,oh-10)；2个甲基信号δ
h 0.82(3h,s,h-14),1.53(3h,s,h-15)；一组末端双键质子信号δ
h 4.96(1h,d,j＝1.6hz,h-12a),4.84(1h,d,j＝1.6hz,h-12b)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)谱中共显示15个碳信号，结合hsqc谱分析，推测化合物中
包括1个羰基碳信号δ
c 205.2(c-3)，4个烯烃碳信号δc171.5(c-5),136.4(c-4),155.9(c-11),106.5(c-12)，3个连氧碳信号δ
c 84.4(c-1),75.2(c-10),63.0(c-13)，1个次甲基碳信号δ
c 36.9(c-7)，4个亚甲基碳信号δ
c 48.1(c-2),36.4(c-6),31.1(c-8),39.5(c-9)以及2个甲基碳信号δc22.5(c-14),7.5(c-15)。
[0056]
根据1h-1
h cosy谱，化合物8显示有一个自旋耦合体系。hmbc谱中δ
h 2.13(h-2)与δ
c 75.2(c-10),84.4(c-1),136.4(c-4),171.5(c-5),205.3(c-3)存在相关,确定化合物含有一个五元环。δ
h 2.84(h-7)与δ
c 31.3(c-8),36.4(c-6),63.0(c-13),106.5(c-12),155.9(c-11)存在相关，δ
h 1.29(h-8)与δ
c 36.9(c-7),39.5(c-9),75.2(c-10),155.9(c-11)存在相关，说明存在七元环的结构片段。δ
h 0.82(h-14)与δ
c 39.5(c-9),75.2(c-10),155.9(c-11)存在相关，δ
h 1.53(h-15)与δ
c 136.4(c-4),171.5(c-5),205.3(c-3)存在相关，由此确定了两个甲基的位置，δ
h 5.25(oh-1)与δ
c 75.2(c-10),84.4(c-1),48.1(c-2),171.5(c-5)存在相关,δ
h 4.45(oh-10)与δ
c 84.4(c-1),39.5(c-9),75.2(c-10),22.5(c-14)存在相关，δ
h 4.80(oh-13)与δ
c 155.9(c-11),63.0(c-13)存在相关，确定了三个羟基的位置；δ
h 4.84(h-12)与δ
c 36.9(c-7),155.9(c-11),63.0(c-13)存在相关，δ
h 3.94(h-13)与δ
c 36.9(c-7),155.9(c-11),106.5(c-12)的相关说明侧链在c-7位置上，是3-羟基-2-甲基丙烯醇。由此确定了化合物8的平面结构。
[0057]
通过计算核磁的方法和dp4+分析确定其相对构型为1r
*
,7r
*
,10s
*
。在noesy谱中h-7/h-9α,h-9β/h-14之间存在相关，佐证了化合物8的相对构型。化合物8与计算的1r,7r,10s构型吻合较好，由此确定了化合物的绝对构型。
[0058]
表4化合物7和8的1h(600mhz)与
13
c(150mhz)nmr数据(dmso-d6)
[0059][0060]
[0061]
daphnegenol i(9):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)，hresims给出准分子离子峰289.1400[m+na]
+
(calcd for c
15h22
o4na，289.1410)，确定该化合物的分子量为266，分子式为c
15h22
o4，计算不饱和度为5。
[0062]1h nmr(600mhz,dmso-d6)谱中δ
h 1.05(3h,d,j＝7.3hz),1.58(3h,s)为两个甲基信号，δ
h 4.98(1h,d,j＝1.6hz,h-12a),4.86(1h,d,j＝1.6hz,h-12b)为一组末端双键上的质子信号，δ
h 5.12(1h,s,oh-1),4.56(1h,s,oh-10),4.82(1h,t,j＝5.5hz,oh-13)为三个活泼氢信号。
13
c nmr(150mhz,dmso)谱中共显示15个碳信号，结合hsqc谱分析，推断结构中包含1个羰基碳信号δ
c 206.1(c-3)，4个烯烃碳信号δc173.6(c-5),135.5(c-4)，155.0(c-11),106.7(c-12)，3个连氧碳信号δ
c 80.7(c-1),72.7(c-10),62.8(c-13)，1个次甲基碳信号δ
c 41.6(c-7)，4个亚甲基碳信号δ
c 46.6(c-2),30.4(c-6),27.9(c-8),34.9(c-9)以及2个甲基碳信号δ
c 25.4(c-14),7.2(c-15)。
[0063]
hmbc谱中δ
h 2.53(h-2)与δ
c 206.1(c-3),173.6(c-5),135.5(c-4),80.7(c-1),72.7(c-10)存在相关，说明其为一个存在α,β-不饱和酮片段的五元环结构。δ
h 1.58(h-15)与δ
c 206.1(c-3),135.5(c-4),173.6(c-5)存在相关，说明c-15连在c-4上。δ
h 2.69(h-6)与δ
c 173.6(c-5),135.5(c-4),80.7(c-1),41.6(c-7),27.9(c-8)相关，δ
h 1.85(h-8)与δ
c 72.7(c-10),41.6(c-7)相关，δ
h 1.90(h-9)与δ
c 80.7(c-1),72.7(c-10),41.6(c-7),25.4(c-14)存在相关，说明存在一个七元环片段。δ
h 1.05(h-14)与δ
c 80.7(c-1),72.7(c-10),34.9(c-9)存在相关，说明c-14连在c-10上。δ
h 4.98(h-12)与δ
c 41.6(c-7),62.8(c-13),155.0(c-11)存在相关，δ
h 3.95(h-13)与δc155.0(c-11),106.7(c-12),41.6(c-7)存在相关，说明c-11与c-12,c-7,c-13相连，并且通过δ
c 155.0(c-11),106.7(c-12)可判断c-11与c-12通过双键连接，综合以上信号确定该化合物平面结构为愈创木烷型倍半萜，确定了该化合物的平面结构。
[0064]
相对构型由noesy谱与计算核磁共同确定。h-7/h-14存在noe相关，说明h-7和me-14为α构型，oh-10为β构型。结合计算核磁，确定化合物9的相对构型为1r*,7r*,10s*。该化合物的绝对构型是通过计算ecd与实测ecd相比较的方法确定，此化合物的绝对构型为1r,7r,10s。
[0065]
daphnegenol j(10):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)，hresims给出准分子离子峰289.1407[m+na]
+
(calcd for c
15h22
o4na,289.1410)，确定该化合物的分子量为266，分子式为c
15h22
o4，计算不饱和度为5。
[0066]1h nmr(600mhz,dmso-d6)谱中，给出两个甲基质子信号δ
h 1.07(3h,s,h-15),0.97(3h,d,j＝7.3hz,h-14)，一组末端双键上的质子信号δ
h 4.99(1h,d,j＝1.6hz,h-12a),4.89(1h,d,j＝1.6hz,h-12b)和三个羟基质子信号δ
h 5.60(1h,d,j＝6.2hz,oh-3),5.23(1h,s,oh-4),4.86(1h,t,j＝5.0hz,oh-13)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)谱中共显示15个碳信号，可归属为一个羰基碳信号δ
c 202.2(c-2)和两组烯碳信号δ
c 171.8(c-5),155.4(c-11),141.2(c-1),106.8(c-12)；三个连氧碳信号δ
c 81.1(c-3),77.9(c-4),63.0(c-13)；两个次甲基碳信号δ
c 41.2(c-7),25.9(c-10)；三个亚甲基碳信号δ
c 32.5(c-6),32.2(c-9),30.6(c-8)；两个甲基碳信号δ
c 22.4(c-15),16.6(c-14)。
[0067]
在hmbc谱中，δ
h 2.53(h-3)与δ
c 202.2(c-2),77.9(c-4),22.4(c-15)存在相关，说
明该化合物中存在一个α,β-不饱和酮的五元环结构片段。δ
h 1.07(h-15)与δ
c 171.8(c-5),81.1(c-3),77.9(c-4)存在相关，δ
h 5.60(oh-3)与δ
c 202.2(c-2),81.1(c-3),77.9(c-4)存在相关，δ
h 5.23(oh-4)与δ
c 171.8(c-5),77.9(c-4),22.4(c-15)存在相关,说明c-15与c-4相连,且两个羟基分别连在c-3和c-4上。δ
h 2.42(h-6)与δ
c 171.8(c-5),155.4(c-11),141.2(c-1),41.2(c-7),30.6(c-8)相关，δ
h 1.70(h-9)与δ
c 16.6(c-14),41.6(c-7)相关，说明该化合物中存在一个七元环。δ
h 0.97(h-14)与δ
c 141.2(c-1),32.2(c-9),25.9(c-10)存在相关，说明c-14与c-10相连。δh4.89(h-12)与δ
c 155.4(c-11),63.0(c-13),41.2(c-7)存在相关，δ
h 3.96(h-13)与δ
c 155.4(c-11),106.8(c-12),41.2(c-7)存在相关，说明c-11与c-12,c-7,c-13相连，综合以上信号确定了该化合物的平面结构。
[0068]
相对构型由noesy谱与计算核磁共同确定。h-6β与h-14存在noe相关，说明h-6β和me-14为β构型；h-6α与h-15存在noe相关，则h-6α与me-15为α构型，oh-4为β构型。结合计算核磁，确定化合物10的相对构型为3r*、4r*、7r*、10s*。通过计算ecd与实测ecd相比较的方法结合确定绝对构型为3r,4r,7r,10s。
[0069]
表5化合物9和10的1h(600mhz)与
13
c(150mhz)nmr数据(dmso-d6)
[0070][0071][0072]
daphnegenol k(11):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)，hresims给出准分子离子峰289.1415[m+na]
+
(calcd for c
15h22
o4na,289.1410)，确定该化合物的分子式为c
15h22
o4,不饱和度为5。
[0073]1h nmr(600mhz,dmso-d6)谱中显示有4个羟基氢信号δ
h 5.47(1h,s,oh-1),5.28(1h,d,j＝5.6hz,oh-8),4.70(1h,s,oh-10),4.90(1h,t,j＝5.4hz,oh-13)；2个甲基质子信
号δh1.17(3h,s,h-14),1.60(3h,s,h-15)；1个末端双键氢信号δ
h 5.00(2h,s)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)谱中共显示15个碳信号，结合hsqc谱分析，推测化合物中包括1个羰基碳信号δ
c 205.1(c-3),4个双键碳信号δ
c 136.5(c-4),171.8(c-5),153.3,(c-11)108.2(c-12),4个连氧sp3杂化碳信号δ
c 83.8(c-1),76.1(c-10),71.6(c-8),63.3(c-13)，4个sp3杂化碳信号δ
c 47.8(c-2),29.3(c-6),41.5(c-7),44.2(c-9),以及2个甲基碳信号δ
c 27.3(c-14),7.8(c-15)。
[0074]
hmbc谱中δ
h 2.71(h-2)与δ
c 205.1(c-3),136.5(c-4),171.8(c-5)以及83.8(c-1)存在相关，由此确定了五元环片段的存在；δ
h 1.60(h-15)与δ
c 136.5(c-4),205.1(c-3)以及171.8(c-5)存在相关，表明c-4位被甲基取代；δ
h 2.46(h-6)与δ
c 136.5(c-4),171.8(c-5),41.5(c-7),71.6(c-8)存在相关，δ
h 3.98(h-8)与δ
c 44.2(c-9),76.1(c-10)存在相关,δ
h 1.17(h-14)与δ
c 44.2(c-9),76.1(c-10)以及83.8(c-1)存在相关,表明5/7二环骨架的存在，且c-10位被甲基取代；δ
h 3.95(h-13)与153.4(c-11),108.2(c-12),41.5(c-7)存在相关，说明c-12，c-13以及c-11相连，且所构成的取代基取代在c-7位，结合其1h-1
h cosy谱相关，因而确定了化合物11的平面结构。
[0075]
相对构型由noesy与计算核磁确定，oh-1/h-7,h-9α/h-7,h-9β/h-14存在noe相关，说明h-7与oh-1以及oh-10处于同侧。确定相对构型为1s*,7r*,8s*,10r*。通过计算ecd与实测ecd相比较的方法确定绝对构型为1s,7r,8s,10r。
[0076]
daphnegenol l(12):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)，根据1h和
13
c nmr，推断分子式为c
15h22
o4，不饱和度为5。
[0077]1h nmr(600mhz,dmso-d6)谱中，δ
h 5.24(1h,s,1-oh),4.80(1h,s,13-oh),4.30(1h,s,10-oh)，提示存在3个活泼氢质子信号，δ
h 4.95(1h,d,j＝1.7hz,h-12a),4.82(1h,d,j＝1.7hz,h-12b)，提示存在1个末端双键质子信号，δ
h 3.94(2h,s,h-13)，提示存在1个连氧亚甲基质子信号，δ
h 2.79(1h,d,j＝17.3hz,h-2a),2.06(1h,d,j＝17.3hz,h-2b)位1对亚甲基质子信号，δ
h 1.53(3h,s,h-15),1.19(3h,s,h-14)为2个甲基质子信号。
13
c-nmr(150hz,dmso-d6)谱给出15个碳信号，其中δ
c 205.4(c-3)提示结构中含有1个羰基基团，δ
c 172.1(c-5),156.0(c-11),106.2(c-12),136.7(c-4)提示结构中含有2个双键基团，δ
c 83.2(c-1),73.9(c-10),62.9(c-13)提示结构中含有3个连氧sp3杂化碳，δ
c 47.8(c-2),38.9(c-9),37.7(c-7),35.5(c-6),29.2(c-8),27.6(c-14),8.0(c-18)为7个sp3杂化碳信号。
[0078]
hmbc谱和1h-1
h cosy谱确定化合物12具有2个自旋系统，末端双键质子δ
h 4.95(h-12a),4.82(h-12a)与碳信号δ
c 62.9(c-13),37.7(c-7)存在相关，确定双键在11位并且是2-烯丙醇结构侧链，亚甲基质子δ
h 2.79(h-2a),2.06(h-2b)与δ
c 205.3(c-3),172.1(c-5),136.7(c-4),83.2(c-1),73.9(c-10)存在相关，确定五元环的结构，δ
h 2.64(h-7)与δ
c 172.1(c-5),38.8(c-9)存在相关，δ
h 1.49(h-9)与δ
c 83.2(c-1)存在相关，确定七元环的结构，δ
h 1.53(h-15)与δ
c 205.4(c-3),172.1(c-5)存在相关，五元环在4位有甲基取代，δ
h 1.19(h-14)与δ
c 83.2(c-1),38.8(c-9)存在相关，确定me-14取代在c-10位，由此，确定化合物12的平面结构。
[0079]
相对构型通过nosey谱结合dp4+分析共同确定，nosey谱中，根据h-7与h-9α存在相关，h-14与h-9β存在相关，因此确定了h-7与me-14异面，c-1位相对构型通过dp4+分析确定，
最终确定化合物12的相对构型为1r*，7r*，14r*。化合物的绝对构型是通过计算ecd与实测ecd相比较的方法确定，此化合物的绝对构型为1s,7s,10s。
[0080]
表6化合物11和12的1h(600mhz)与
13
c(150mhz)nmr数据(dmso-d6)
[0081][0082][0083]
daphnegenol m(13):黄色油状物(甲醇)，易溶于甲醇、dmso等溶剂。(c 0.10meoh)，根据1h和
13
c nmr推断其分子式为c
15h20
o4，计算其不饱和度为6。
[0084]1h nmr(600mhz,dmso-d6)谱中，给出两个甲基质子信号δ
h 0.94(3h,d,j＝7.3hz,h-15),2.22(3h,d,j＝1.3hz,h-14)，两个末端双键上的质子信号δ
h 5.25(1h,dd,j＝2.0,2.0hz,h-13a),5.15(1h,dd,j＝2.0,2.0hz,h-13b)，一个双键上的质子信号δ
h 5.89(1h,dd,j＝1.3hz,h-9)和三个羟基质子信号δ
h 5.41(1h,d,j＝6.1hz,oh-12),5.11(1h,s,oh-7),4.67(1h,d,j＝3.7hz,oh-2)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)谱中共显示15个碳信号，包括一个羰基碳信号δ
c 200.3(c-8)和两组烯碳信号δ
c 169.9(c-10),151.4(c-11),127.6(c-9),109.2(c-12)，3个连氧碳信号δ
c 81.0(c-7),72.9(c-2),71.0(c-12)，1个季碳信号δ
c 62.1(c-1)，2个次甲基碳信号δ
c 41.6(c-5),31.9(c-4)，2个亚甲基碳信号δ
c 41.4(c-3),30.2(c-6)和2个甲基碳信号δ
c 26.1(c-14),17.7(c-15)。
[0085]
在hmbc谱中，δ
h 1.85,1.59(h-3)与δ
c 72.9(c-2),62.1(c-1),41.6(c-5),31.9(c-4),26.1(c-14)存在相关，说明化合物中存在一个五元环结构片段。δ
h 4.17(h-12)与δ
c 169.9(c-10),151.4(c-11),109.2(c-12),72.9(c-2),62.1(c-1)存在相关，δ
h 1.73,1.42(h-6)与δ
c 200.3(c-8),151.4(c-11),81.0(c-7),62.1(c-1),41.6(c-5),31.9(c-4)存在相关，说明化合物存在一个六元环的结构片段，δ
h 5.89(h-9)与δ
c 81.0(c-7),62.1(c-1),26.1(c-14)存在相关，说明存在一个α,β-不饱和酮七元环的结构片段，形成5/6/7三环骨
架。δ
h 2.22(h-14)与δ
c 169.9(c-10),127.6(c-9),62.1(c-1)存在相关，δ
h 0.94(h-15)与δ
c 41.4(c-3),31.9(c-4),41.6(c-5)存在相关确定了两个甲基的连接位置。综合以上信号确定该化合物为变构后的愈创木烷型倍半萜，确定了该化合物的平面结构。
[0086]
相对构型通过nosey谱结合dp4+分析共同确定，最终确定化合物13的相对构型为1r*,2s*,4s*,5s*,7s*,12s*。化合物的绝对构型是通过计算ecd与实测ecd相比较的方法确定，此化合物的绝对构型为1r,2s,4s,5s,7s,12s。
[0087]
表7化合物13的1h(600mhz)与
13
c(150mhz)nmr数据(dmso-d6)
[0088][0089]
一种药物组合物，包含所述愈创木烷型倍半萜类化合物1-13，以及药学上可接受的载体。
[0090]
本发明还提供所述的愈创木烷型倍半萜类化合物1-13或包含上述化合物的药物组合物在抗阿尔兹海默症药物中的应用。
[0091]
对本发明所述13个新愈创木烷型倍半萜类化合物的抗乙酰胆碱酯酶活性进行了考察，并以阳性对照多奈哌齐碱作为参照评价了这些化合物是否存在乙酰胆碱酯酶抑制活性，化合物6，11-13在100μm下的抑制率高于阳性药，化合物12和13在10μm下的抑制率接近或高于阳性药。因此本发明所述的愈创木烷型倍半萜类化合物具有进一步开发预防和治疗抗阿尔兹海默症药物的前景。
[0092]
本发明的优点在于，所述化合物均为新化合物，结构新颖，且均为立体构型确定的光学纯化合物，同时其抗阿尔兹海默症作用强，具有进一步开发的价值。
附图说明
[0093]
图1化合物1的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0094]
图2化合物1的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0095]
图3化合物2的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0096]
图4化合物2的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0097]
图5化合物3的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0098]
图6化合物3的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0099]
图7化合物4的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0100]
图8化合物4的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0101]
图9化合物5的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0102]
图10化合物5的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0103]
图11化合物6的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0104]
图12化合物6的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0105]
图13化合物7的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0106]
图14化合物7的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0107]
图15化合物8的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0108]
图16化合物8的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0109]
图17化合物9的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0110]
图18化合物9的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0111]
图19化合物10的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0112]
图20化合物10的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0113]
图21化合物11的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0114]
图22化合物11的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0115]
图23化合物12的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0116]
图24化合物12的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)；
[0117]
图25化合物13的1h-nmr谱(600mhz,dmso-d6)；
[0118]
图26化合物13的
13
c-nmr谱(150mhz,dmso-d6)。
具体实施方式
[0119]
下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0120]
实施例1
[0121]
芫花根中分离愈创木烷型倍半萜类化合物1-13的制备方法，具体操作步骤如下：
[0122]
取50kg干燥的芫花根以70％工业乙醇(每次100l)回流提取2次，每次2h，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯萃取并将所得组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统100:0,90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80,10:90,0:100(v/v)进行等度梯度洗脱，共收集到3个流份a-c。
[0123]
流份b经hp20柱色谱，以乙醇-水系统0:100,10:90,20:80,30:70,40:60,50:50,60:40,70:30,80:20,90:10,100:0(v/v)进行梯度洗脱，得四个组分b1、b2、b3和b4。利用ods柱色谱将组分b1以乙醇-水系统10:90,20:80,30:70,40:60,50:50,60:40,70:30,80:20,90:10(v/v)进行梯度洗脱，得五个组分a-e。
[0124]
所得组分b经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统100:1,80:1,60:1,40:1,20:1,10:1(v/v)在tlc分析的基础上得到四个亚组分b1-b4。
[0125]
在制备性反相高效液相色谱上使用甲醇-水(70:30，v/v)的流动相来分离b1和b2得到了化合物1-13，其中，分离得到化合物1-13的量依次分别为3.2mg，8.3mg，10.1mg，13.1mg，2.1mg，5.6mg，8.7mg，11.0mg，2.3mg，3.6mg，5.1mg，8.3mg，2.8mg。
[0126]
实施例2
[0127]
芫花根中分离愈创木烷型倍半萜类化合物1-13的乙酰胆碱酯酶抑制活性考察。
[0128]
将实施例1中制得的愈创木烷型倍半萜类化合物1-13用含1％dmso的pbs缓冲液配置成浓度为1mg/ml的储备液待用。dtnb作为底物能够被乙酰胆碱酯酶水解，水解产物会与显色剂atci反应显黄色，在412nm下有吸收。在96孔板中按测试方法加反应试剂，空白对照组、阴性对照组、样品组、样品对照组冷藏过夜后，加入0.5mm atci，反应5min后用酶标仪测定412nm处的吸光度。
[0129][0130]a以多奈哌齐碱作为阳性对照药。