一种用于快速灵敏检测过氧硝酸盐的rhodol荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于荧光传感检测技术领域，具体涉及一种基于rhodol类衍生物，对过氧硝酸盐有快速、灵敏及高选择性的荧光增强检测的荧光探针。
背景技术：2.近年来，恶性肿瘤、糖尿病和心脑血管系统疾病等重大疾病的死亡率不断升高，严重危害身体健康和生活质量。寻找和开发相关疾病生物标记物的早期诊断方法，已经成为目前的一个研究热点。过氧亚硝酸盐(onoo-)是生理系统内一类重要的活性氮分子，主要由过氧阴离子(o2.-)和一氧化氮(no)反应得到，且主要产生于线粒体中。低浓度的onoo-参与生物体内的信号转导过程，维持正常的生理功能。然而，onoo-具有强氧化性，浓度过高时，会破坏核酸、蛋白质、脂质等生物大分子的结构和功能，从而与许多疾病的发病紧密相关，如炎症、心脑血管疾病、阿尔茨海默病、癌症、糖尿病和药物性肝损伤等。然而，截止目前，onoo-引发上述疾病的具体生理和病理过程尚未被完全了解清楚，因而，对onoo-的检测及生物成像的研究，对于许多疾病的诊断与治疗具有至关重要的意义。
3.对过氧亚硝酸盐的检测方法有电化学分析、电子自旋共振以及紫外分光光度计法等，但生物体内的过氧亚硝酸盐具有反应活性高、浓度低、半衰期短和对环境敏感等特点，目前这些方法不适应检测分析，相比之下，荧光探针方法检测具有灵敏度高、选择性高、响应速度快、操作简便等优点，适用于过氧亚硝酸盐的检测及其生物成像分析。现有的荧光探针存在响应时间慢，以及易受到h2o2干扰导致选择性差等问题，因此，设计开发出快速、灵敏及高选择性的过氧亚硝酸盐荧光探针具有重要意义。
技术实现要素：4.本发明针对上述过氧亚硝酸盐荧光探针中问题，提供了一种rhodol类荧光探针制备方法及其对过氧亚硝酸盐有快速、灵敏及高选择性的检测以及生物细胞成像应用。
5.一种rhodol类荧光探针，其结构式如下：
[0006][0007]
本发明的rhodol类荧光探针，在rhodol染料框架的醛基引入1,1-二甲基肼，得到易被过氧亚硝酸盐专一氧化破坏的1,1-二甲基腙为响应识别基团，并为避免ph变化对荧光信号的干扰，对rholol染料骨架的羧酸进行甲基化处理，从而得到荧光探针。通过与过氧亚硝酸盐独有的氧化断键反应，实现探针对过氧亚硝酸盐的快速、灵敏及高选择性检测。在测
试体系pbs缓冲溶液(20mm,ph 7.4)中，探针几乎没有荧光信号，加入过氧亚硝酸盐后，荧光信号迅速增强，1分钟内响应结束，探针的检测限为57nm，具有高选择性和快速灵敏检测，也可用于裸眼定性鉴别和荧光定量检测。
[0008]
本发明提供了一种所述的检测过氧硝酸盐的rhodol类荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0009]
4-二乙氨基酮酸1与2,4-二羟基苯甲醛在甲基磺酸中加热缩合，得到rhodol染料2，在甲醇中与浓硫酸进行酯化反应化合物3，最后，与1,1-二甲基肼盐酸盐在二氯甲烷/三乙胺中缩合，反应结束后经过后处理得到荧光探针。
[0010]
反应方程式如下：
[0011][0012]
本发明还提供了一种所述的rhodol类荧光探针在过氧硝酸盐检测和细胞成像方面的应用。
[0013]
本发明的rhodol类荧光探针，在pbs缓冲溶液(20mm,ph 7.4)中，用530nm光激发后几乎没有荧光信号，荧光量子效率测定为0.02，在过氧硝酸盐存在下，探针内的1,1-二甲基腙被氧化断裂，得到醛基rhodol染料，此时530nm激发，会产生发射峰为571nm强橙红色荧光，从而荧光增强定性检测过氧亚硝酸盐，检测反应如图1所示。
[0014]
本发明所述的荧光探针，在530nm光激发下，随过氧亚硝酸盐浓度的增加，在571nm处荧光发射强度逐渐增强，其荧光强度变化相对过氧亚硝酸盐浓度在一定范围内呈线性关系，可确定本发明所述的荧光强度变化可以定量检测过氧亚硝酸盐浓度，如图2和3所示。
[0015]
将本发明所述的荧光探针加入到hela活细胞中为实验组，以及在加探针之前加入3-吗啉吡啶亚胺盐酸盐(sin-1)预处理(提供onoo-)和外加尿酸(onoo-清除剂)的两个对照组细胞染色；如图6所示，实验组中细胞荧光通道有微弱信号，sin-1处理的对照组细胞荧光通道荧光很强，而另外对照组中，加入尿酸处理后，荧光信号显着降低。细胞荧光成像变化明显，表明探针可用作活细胞外源性onoo-成像检测工具。
[0016]
细胞内源性onoo-荧光成像：hepg2细胞用lps+ifn-γ培育后，再加入探针后处理成像；以及对比组，细胞经lps+ifn-γ培育后，再加入活性氮清除剂gsh和tempo处理后，最后加入探针，进行共聚焦细胞成像检测。如图7所示，探针在细胞内荧光信号很弱，经过lps+ifn-γ培育后，细胞内荧光信号很强，而经活性氮清除剂gsh或tempo处理后的细胞中荧光信号又很弱降低。结果表明，探针可用于细胞内源产生的onoo-荧光检测成像。
[0017]
本发明的有益效果为：该荧光探针合成简易，操作简单，合成成本低；可快速、灵敏和高选择性检测过氧亚硝酸盐。随过氧亚硝酸盐浓度的增加，探针的荧光发射强度在571nm
处增强，并且荧光强度与过氧亚硝酸盐浓度在一定范围内呈线性关系，检测限为57nm，响应在1分钟之内，不受h2o2,clo-等其他活性氧干扰影响。该荧光探针不仅可以定量检测溶液体系中的过氧亚硝酸盐，而且能够用于活细胞内过氧亚硝酸盐的成像检测。
附图说明
[0018]
图1为本发明荧光探针与onoo-作用的结构变化。
[0019]
图2为本发明荧光探针与不同浓度onoo-作用的荧光发射变化图。
[0020]
图3为本发明荧光探针强度对不同浓度onoo-作用后的荧光强度变化(f
571nm
)谱图。
[0021]
图4为本发明荧光探针对不同浓度onoo-(0，25及50μmol/l)作用后在571nm处荧光强度变化(f
571nm
)随时间变化谱图。
[0022]
图5为本发明荧光探针对不同干扰物作用后的荧光强度变化(f
571nm
)谱图。
[0023]
图6为本发明荧光探针在hela细胞中对外源性onoo-的荧光成像图。
[0024]
图7为本发明荧光探针在细胞中对内源性onoo-的荧光成像图。
[0025]
图8为实施例3制备的荧光探针纯品核磁氢谱图(400mhz，cdcl3)。
[0026]
图9为实施例3制备的荧光探针纯品核磁碳谱图(100mhz，cdcl3)。
具体实施方式
[0027]
实施例1
[0028]
称取4-二乙氨基酮酸1(3.7g，10mmol)溶于甲基磺酸中(10ml)，再冰水浴中加入2,4-二羟基-苯甲醛(1.4g，10mmol)，在氮气氛围下加热90℃下搅拌3h。反应结束后，将反应液到入冰水中，过滤后得到固体，再硅胶柱层析纯化得到化合物2(产率，62％)。
[0029]
实施例2
[0030]
在冰水浴下向化合物2(80mg,0.25mmol)的甲醇(15ml)溶液中加入浓h2so4(1ml)。反应在氮气氛围下回流6h。冷却后，旋干溶剂，并在残渣加入nahco3溶液，二氯甲烷萃取，收集有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化得化合物3(67mg，52％)，1h nmr(400mhz),cdcl3):δ10.42(s,1h),8.26(dd,j＝8.0hz,1.2hz,1h),7.66-7.75(m,2h),7.44(s,1h),7.44(s,1h),7.28(d,j＝5.2hz,1h),6.80(d,j＝9.2hz,1h),6.51-6.59(m,3h),3.67(s,3h),3.47-3.53(m,4h),1.27(t,j＝7.2hz,6h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3):δ192.1,183.2,165.4,159.4,157.7,156.4,153.9,134.4,132.8,131.2,3.9,130.5.,9,132.,113.4,111.8,110.9,107.0,96.6,52.2,45.4,12.6。
[0031]
实施例3
[0032]
称取化合物3(80mg,0.25mmol)溶解在二氯甲烷(15ml)中。加入et3n(0.2ml)和1,1-二甲基肼盐酸盐(30mg,0.5mmol)并将混合物在室温下搅拌6h。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂至油状物，使用硅胶柱色谱纯化残余物，得到探针(30mg,46％)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ8.27(d,j＝8.0hz,1h),7.75-7.79(m,1h),7.67-7.71(m,1h),7.49(s,1h),7.34(d,j＝7.2hz,1h),7.21(s,1h),6.90(d,j＝9.2hz,1h),6.68-6.74(m,3h),3.63(s,3h),3.52-3.57(m,4h),2.93(s,6h)),1.27(t,j＝7.2hz,6h)；
13
cnmr(100mhz，cdcl3)：δ165.7、156.0、155.1、153.4、134.4、132.8、131.2、130.7、130.0、130.0、129.7、115.3、112.8、105.0、104.6、104.6、96.5、96.5、52.4、52.4、45.6、45.6、42.7、12.7、12.7。
[0033]
实施例4
[0034]
探针对不同浓度的onoo-荧光发射变化谱图：配置探针为5μmol/l的pbs缓冲溶液(20mm,ph 7.4)，加入不同浓度的onoo-溶液，待平衡后，测定荧光发射光谱，结果见图2，其在571处的荧光强度i
571nm
变化如图3.
[0035]
从图2和3所知，加入onoo-后，探针的荧光发射显著增强，并在571nm处荧光发射强度与onoo-在0-40μmol/l范围内成线性关系，因此探针可以作为onoo-荧光传感器对其定量检测。
[0036]
实施例5
[0037]
探针对onoo-的荧光检测响应时间变化：配置探针为5μmol/l的pbs缓冲溶液(20mm,ph 7.4)，不加或加入onoo-溶液(25及50μmol/l)，测定荧光发射光谱，整理571nm处荧光强度随时间变化如图4所示。
[0038]
由图4可知，探针自身比较稳定，而且对onoo-的检测响应很灵敏，在1分种内响应完全。
[0039]
实施例6
[0040]
探针对不同干扰物作用后的荧光强度i
571nm
变化：配置浓度为5μmol/l探针的pbs缓冲溶液(20mm,ph 7.4)，然后加入100μmol/l的不同干扰物后，测定荧光发射光谱，整理结果见图5。
[0041]
结果显示，仅onoo-对探针的荧光有显著增强变化，其他干扰物影响很小，表明探针对onoo-有优异的检测选择性。
[0042]
实施例7
[0043]
外源性onoo-的细胞荧光成像测试：将三组hela细胞转移到用于共聚焦成像的培养皿中培育24h后，第一组直接用探针(10μm)培育30分钟，经pbs洗涤三次后进行共聚焦细胞成像检测，第二组细胞先用sin-1预处理培育30分钟后，再加探针培育30分,经pbs洗涤三次进行共聚焦细胞成像，最后一组，先用尿酸预处理细胞后，再加探针(10μm)培育30分钟，用pbs洗涤三次进行共聚焦细胞成像检测。所用激发波长为488nm，荧光通道收集波长为520-620nm，如见图6。
[0044]
由图6可知，仅用探针的细胞荧光信号很弱，但经过onoo-供体sin-培育后，细胞内荧光信号很强，而最后经onoo-清除剂(尿酸)预处理后，荧光信号显着降低。结果表明，探针可用于外源性onoo-细胞荧光检测成像。
[0045]
实施例8
[0046]
内源性onoo-的细胞荧光成像测试：细胞用lps+ifn-γ培育后，再加入探针，后处理成像；以及对比组，细胞经lps+ifn-γ培育后，再加入活性氮清除剂gsh和tempo处理后，再加入探针后进行共聚焦细胞成像检测。所用激发波长为488nm，绿色通道收集波长为520-620nm，如见图7。
[0047]
由图7可知，探针在细胞内荧光信号很弱，但经过lps+ifn-γ培育后，细胞内荧光信号很强，而经活性氮清除剂gsh和tempo处理后的细胞中荧光信号又很弱降低。结果表明，探针可用于细胞内源产生的onoo-荧光检测成像。