一株地衣芽孢杆菌及其在降解白及多糖的应用的制作方法

1.本技术涉及白及多糖降解技术领域，尤其涉及一株地衣芽孢杆菌及其在降解白及多糖的应用。


背景技术：

2.白及为兰科白及属多年生草本植物，是我国传统的珍稀名贵中药材，具有极高的观赏价值、药用价值和经济价值。白及块茎中的化合物组成超过150种，其中白及多糖是其干块茎中组成最丰富的一类物质，含量最高可达60％。白及多糖是一种高分子粘性多糖，其化学成分为葡甘露聚糖(包括β-葡萄糖和β-甘露糖)，单糖残基以β-1，4-糖苷键连接，两者摩尔比约为1：4，分子量为70000～600000da。白及多糖具有抗菌活性、促进伤口愈合、抗肿瘤、抗纤维化、抗氧和抗消化道溃疡等生物活性，由于白及多糖的无刺激、无副作用，其在食品、化妆品等工业也有广泛的应用。白及多糖粘度大，水溶性差，在后续加工利用上带来很大的不便。鉴于多糖在白及块茎中的绝对占比，如何在保持多糖生物活性的同时有效降低其粘性，已成为白及产业当前面临的重大科学难题和产业瓶颈。
3.相较于白及多糖，聚合度更小的白及低聚糖(一般低于30)水溶性增加而粘度下降，且经口服进入肠道后更易发挥生物活性。目前，白及多糖降解为低聚糖的方法主要有化学(如酸、碱水解)、物理法(如超声)和生物法三大类，但化学法反应条件剧烈、难以质控，且环境污染较大，物理法则存在降解效率不高的难题，而生物法则可以有效避免这些问题。
4.微生物降解法是近年来发展的新兴多糖降解技术，采用特别微生物，将多糖高效降解成低聚寡糖，相比于传统的化学和物理方法，绿色环保，特别适用于低聚寡糖的规模化制备。
5.因此，寻找出一种能够高效降解白及多糖的微生物，成为解决上述技术问题的关键方法之一。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本技术实施例公开了一株地衣芽孢杆菌及其在降解白及多糖的应用，以解决或缓解了上述部分技术问题。
7.第一方面，本技术实施例公开了一株地衣芽孢杆菌，该菌株命名为bacillus licheniformis bj2022，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctcc no:m 2022816，保藏日期为2022年6月7日。
8.第二方面，本技术实施例公开了一种菌剂，应用于白及多糖的降解，其中，所述菌剂包含第一方面所述的地衣芽孢杆菌。
9.进一步地，所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌的活菌体，或者所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌的活菌体和死菌体的混合菌体。
10.优选地，当所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌的活菌体和死菌体的混合菌体时，活菌体的数量高于死菌体的数量。
11.更优选地，所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌的活菌体。
12.进一步地，所述菌剂为液态菌剂和/或固态菌剂。
13.优选地，所述菌剂的剂型为菌液或者冻干后的菌体。
14.第三方面，本技术实施例公开了第一方面所述地衣芽孢杆菌和/或第二面所述菌剂在降解甘露聚糖的应用；
15.其中，所述多糖包含β-1，4-糖苷键。
16.优选地，所述应用包括降解白及多糖。
17.第四方面，本技术实施例公开了第一方面所述地衣芽孢杆菌和/或第二面所述菌剂在发酵制备白及低聚糖的应用。
18.第五方面，本技术实施例公开了一种试剂盒，其包含第一方面所述地衣芽胞杆菌或第二方面所述菌剂。
19.第六方面，本技术实施例公开了第一方面所述地衣芽胞杆菌的筛选方法，包括：
20.取粪便样品并制备肠道菌群稀释液；
21.菌株的富集和筛选；
22.地衣芽孢杆菌株的分离、纯化；
23.以及菌株的鉴定。
24.进一步地，所述肠道菌群稀释液的制备方法为梯度离心法。
25.进一步地，所述地衣芽孢杆菌株的分离方法唯一碳源筛选法。
26.进一步地，所述菌株的鉴定方式为形态学特征验证及16s rdna测序鉴定。
27.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果之一：
28.本技术中涉及一株地衣芽孢杆菌及其在降解白及多糖的应用。所述地衣芽孢杆菌在用于甘露聚糖、异甘露聚糖和甘露寡糖的降解时，可断裂β-1，4-d-甘露糖苷键，产生低聚糖片段，白及多糖含有大量的β-1,4-d-甘露糖苷键，采用所述地衣芽胞杆菌，可有效将白及多糖降解为白及低聚糖。相比于采用物理法和化学法，采用本技术提供的地衣芽孢杆菌降解白及多糖及含有β-1，4-d-甘露糖苷键的多种甘露聚糖、异甘露聚糖和甘露寡糖时，效率高、绿色环保，适用于白及低聚糖及其它低聚糖的规模化制备。
附图说明
29.图1为本技术实施例提供的地衣芽孢杆菌bacillus licheniformis bj2022的格兰染色结果(1000
×
)及菌落照片。
30.图2为醒申请实施例提供的白及低聚糖的发酵过程参数测定；其中，a为地衣芽孢杆菌生长曲线，b为发酵液ph值的变化曲线，c为发酵液总糖含量变化曲线，d为发酵液还原糖含量变化曲线。
31.图3为本技术实施例提供的白及低聚糖结构鉴定图；其中a为hpgpc检测白及低聚糖单糖分子量，b、c为hplc检测的两种白及低聚糖单糖组成。
具体实施方式
32.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本技术，并不用于限
定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
33.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
34.第一方面，本技术实施例公开了一株地衣芽孢杆菌，该菌株命名为bacillus licheniformis bj2022，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2022816。
35.本技术实施例公开了上述地衣芽胞杆菌的筛选方法，其具体方法如下：
36.1、肠道菌群菌液的制备
37.本技术实施例粪便样品采集地为武汉，具体为5位健康志愿者(男:女＝3:2)。每位志愿者各取2g粪便，使用20ml厌氧pbs(含l-cysteine0.5g/l)充分震荡混匀后，1000rpm离心5min，除去食物残渣。粪便悬液6000rpm离心5min，使用20ml厌氧pbs重悬，既得10％肠道菌群菌液。
38.1、菌株的培养与分菌
39.按照10倍稀释法对肠道菌群菌液进一步稀释成10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
稀释度的样品悬液；
40.选取稀释度为10-4
、10-5
、10-6
稀释度的样品悬液，用1ml无菌吸管分别吸取0.1ml涂布于白及多糖碳源选择培养基(sm)平板上，将所述sm平板置于37℃恒温箱中培养24个小时，得到菌落。
41.2、地衣芽孢杆菌的分离、纯化
42.在sm平板上筛选3～4mm左右的中间有“边缘不整齐、白色、表面粗糙褶皱的扁平菌落；
43.将筛选的菌落通过营养肉汤培养基(lb)培养后，取新鲜菌液在光学显微镜100
×
倍～4.0μm、宽度为0.8～1.0μm、革兰氏染色呈蓝紫色或紫色的长杆菌；
44.将筛选出来的菌落于lb平板上划线纯化，然后保存于试管斜面备用。
45.3、地衣芽胞杆菌株的鉴定
46.本技术从上述筛选出的菌株中，提取了dna，并进行了16srdna检测，检测结果显示，可确定为地衣芽孢杆菌，命名为bacillus licheniformis bj2022，并于2022年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2022816。
47.第二方面，本技术实施例提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有上述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis bj2022)，所述菌剂应用于降解白及多糖或含有β-1，4-d-甘露糖苷键的甘露聚糖、异甘露聚糖和甘露寡糖。
48.在本技术中，对所述菌剂中地衣芽孢杆菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择。
49.在本技术中，所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌的活菌体和/或死菌体。优选地，所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis bj2022)的活菌体和死菌体的混合菌体。更优选地，所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis bj2022)的活菌体。当所述菌剂含有所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis bj2022)的活菌体和死菌体的混合菌体时，优选为活菌体的数量高于死菌体的数量。
50.在本技术中，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，如液态菌剂和/或固态菌剂，并添加相应的赋形剂等成分。优选地，所述菌剂的剂型为菌液或者冻干后的菌体。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。
51.第三方面，本技术实施例公开了第一方面所述地衣芽孢杆菌和/或第二面所述菌剂在降解多糖的应用；
52.其中，所述多糖包含β-1，4-糖苷键。
53.优选地，所述应用包括降解白及多糖。
54.根据本技术，分别验证上述地衣芽孢杆菌或上述菌剂在降解多糖的应用，其中，所述多糖包括白及多糖、洋槐豆胶、瓜尔胶、黄芪多糖、黄精多糖、黄原胶、灰树花多糖、纤维素、魔芋胶及茯苓多糖。
55.配置2.5mg/ml的多糖溶液，称取50mg多糖(白及多糖、洋槐豆胶、瓜尔胶、黄芪多糖、黄精多糖、黄原胶、灰树花多糖、纤维素、魔芋胶、茯苓多糖)，定容至20ml。
56.根据本技术，所述地衣芽孢杆菌和/或所述菌剂中的菌体数至少为107cfu(降解50mg多糖的菌体数，若多糖质量变化，则菌体数相应变化)，优选地，所述地衣芽孢杆菌和/或所述菌剂中的活菌体数至少为107cfu。在本技术中，菌体数可以按照gb4789.2-94进行测定。
57.根据本技术，所述降解的条件包括：温度为35℃，ph值为8，时间为2h。
58.实验结果：地衣芽孢杆菌和/或所述菌剂对不同的多糖进行降解的结果，如表1所示：
59.表1
[0060][0061]
从表1中可以看出，本技术所述地衣芽孢杆菌和/或菌剂对白及多糖和魔芋胶有很高的活性，其中对白及多糖的降解率略高于魔芋胶。
[0062]
分析：白及多糖是一种高分子粘性多糖，其化学成分为葡甘露聚糖(包括β-葡萄糖
和β-甘露糖)，单糖残基以β-1，4-糖苷键连接；魔芋胶是由d-甘露糖与d-葡萄糖连接而成的多糖，d-甘露糖与d-葡萄糖的比为1：1.6，单糖也通过β-1，4-糖苷键相连；本技术所述地衣芽孢杆菌和/或菌剂可有效断裂β-1，4糖苷键，作用底物为甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等，因此，地衣芽孢杆菌和/或菌剂对白及多糖和魔芋胶有很高的降解率。同理，我们可以得出结论，本技术所述地衣芽孢杆菌和/或菌剂对含有β-1，4糖苷键的多糖均有较高的降解率。
[0063]
第四方面，本技术实施例公开了第一方面所述地衣芽孢杆菌和/或第二面所述菌剂在发酵制备白及低聚糖的应用。
[0064]
在本技术实施例中，提供了一种利用地衣芽孢杆菌发酵制备白及低聚糖的方法，具体实施步骤如下：
[0065]
(1)取30g白及，加入至1l缓冲液(ph 7.5)中(溶液包括0.2g(nh4)2so4，0.2g kh2po4，0.4g nacl，0.04gmgso4)，低温浸泡12h。使用破壁机进行打浆处理。
[0066]
(2)将步骤(1)得到的混合液转移至5l发酵罐中，在115℃条件下杀菌15min。
[0067]
(3)将步骤(2)灭菌后的发酵罐放置于全自动发酵系统上，将活化后的地衣芽孢杆菌菌液按5％的比例接种至发酵罐中。将发酵参数设置为：溶氧量10％、转速100rpm、温度37℃，通气发酵72h。发酵过程中定时监测培养基od600、ph、总糖、还原糖的变化，结果如图2所示。
[0068]
(4)步骤(3)所述发酵液取出，8000rpm离心5min，取上清液浓缩至料液比为1:5，加入无水乙醇至乙醇浓度为80％，4℃静置12h后，收集沉淀。
[0069]
(5)步骤(4)所述沉淀蒸馏水复溶后于旋转蒸发仪上浓缩，收集所有糖液进行冷冻干燥，获取白及低聚糖粉末。
[0070]
结果：如图3所示，经检测该白及及低聚糖平均分子量为3000da，单糖组成为葡萄糖与甘露糖。
[0071]
第五方面，本技术实施例公开了一种试剂盒，其包含上述地衣芽胞杆菌和/或上述菌剂。
[0072]
综上所述，通过以上实施例结果可知，本技术提供的地衣芽孢杆菌应用于甘露聚糖、异甘露聚糖和甘露寡糖的降解时，可断裂β-1，4-d-甘露糖苷键，产生低聚糖片段，白及多糖含有大量的β-1，4-d-甘露糖苷键，采用所述地衣芽胞杆菌，可有效将白及多糖降解为白及低聚糖。相比于采用物理法和化学法，采用本技术提供的地衣芽孢杆菌降解白及多糖及含有β-1，4-d-甘露糖苷键的多种甘露聚糖、异甘露聚糖和甘露寡糖时，效率高、绿色环保，适用于白及低聚糖及其它低聚糖的规模化制备。
[0073]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。