一种小黑杨单倍体细胞系的获得方法

1.本发明属于生物技术领域，主要涉及通过组织培养获得一种适合悬浮培养且具有分化再生能力的小黑杨(populus simonii
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p.nigra)单倍体细胞系的方法。


背景技术：

2.植物细胞悬浮培养是指将质地松散、生长旺盛的植物愈伤组织转移至液体培养基中，通过不断振荡培养，获得具有一定细胞密度悬浮液的培养方法。由于悬浮细胞培养的营养和空气等条件很容易控制，能促使细胞快速增殖，可大大缩短研究周期，从而为植物生理学、细胞生物学、分子生物学等领域研究提供极大的帮助。但是植物细胞具有结团生长的特性，仅靠激素处理等方式很难获得良好的悬浮培养效果，且只有某些特定的基因型才可能赋予细胞系具有良好的悬浮培养特性，而且由于基因型的改变，通常也会产生一定的不利影响。目前最著名的植物细胞系是kato等在1972年发现的烟草by-2细胞系(kato等,society of fermentation technology,osaka,1972,pp,689-695)，以及拟南芥悬浮细胞系t87(ogawa等,plant and cell physiology,2008,49(2):242
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250)。这两种细胞系具有优异的液体悬浮生长及遗传学特征，尤其by-2细胞系，其悬浮培养具有分散性强，且接种一周细胞增殖量可达初始量的80-100倍(nagata等,international review of cytology.elsevier.1992:1-30)的优良特征，在当时作为世界上生长速度最快的植物细胞系，被誉为植物领域的hela细胞系，而受到研究者的广泛使用。
3.尽管如此，这两种悬浮细胞系都存在着一些明显缺陷，例如by-2细胞系基因组较大(约4.5gbp)，且为杂合度较高的四倍体，导致至今没有获得理想的基因组组装数据，且by-2细胞系不能产生叶绿体，也无法再生完整植株；拟南芥t87细胞系可以产生叶绿体，但无法再分化形成植株，而且作为草本细胞系，都无法代替木本植物细胞系，进行木材形成调控等领域的研究，从而限制了其在研究木本植物领域的广泛使用。
4.相对草本植物而言，木本植物典型的特征是可以保持持续的次生生长。在木本植物中，由于杨树适应性强，分布广泛，同时具有生长迅速、易繁殖等优点，成为当今世界上主要的造林树种。国内外不少团队利用杨树细胞悬浮培养技术进行了研究：利用白杨(populus alba l.)悬浮细胞系培养建立了植株再生体系，获得了完整的植株(park和son,plant cell rep.1988,7(7):567-570；ohmiya等,plant cell physiol.1995,36(4):607-614)；利用杂交杨(populus alba
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populus tremula var.glandulosa)悬浮细胞系进行盐胁迫下基因表达情况的分析(bae等,plant physiol biochem.2012,58:151-158)及纤维素生物合成机制研究(ohlsson等,protoplasma.2006,228(4):221-229)；利用青杨悬浮细胞系进行原生质体分离及培养研究(黄振,博士学位论文，北京：北京林业大学,2015)。但以上杨树细胞系因为存在生长速度慢、容易结块而悬浮效果不佳等缺点，导致不能被广泛、持续利用。
5.本发明基于植物单倍体群体具有非常高的遗传变异率这一理论，从获得的大量小黑杨单倍体细胞系群体中，筛选出生长快速、分散性优良适合悬浮培养的细胞系且具有植
株再生能力。本发明将为相关领域的研究提供强有力的实验工具。


技术实现要素：

6.本发提供一种小黑杨单倍体细胞系的获得方法，具体内容如下：
7.首先，选取单核靠边期的花药，经消毒后接种到添加有2.0mg/l 2,4-d、1.0mg/l kt、30g/l蔗糖和3.0g/l gelrite(植物凝胶)的ms培养基中进行愈伤组织诱导，暗培养35d后获得大量愈伤组织系，并在相同条件下进行继代增殖后，通过流式细胞仪分析(fcm)筛选出单倍体愈伤组织系。这些愈伤组织系的颜色、质地(结块、粘稠)、生长快慢等特点上存在差异。将黄色、质地细腻的单倍体愈伤组织系，转移至添加有1.25mg/l 2,4-d、0.2mg/l kt、50g/l蔗糖的ms液体培养基中培养。细胞系在液体培养基中能自行分散，且随着培养时间的延长，细胞密度增大至近糊状。统计培养时间内的细胞数目，确定单倍体愈伤组织生长的最佳悬浮培养体系及培养周期。
8.取1g的细胞系接种至添加有1mg/l 6-ba、0.2mg/l naa、0.05mg/l tdz、25g/l蔗糖、3.0g/l gelrite的ms固体培养基中，进行光培养诱导不定芽产生。将诱导出的不定芽转移至ms+0.2mg/l iba+0.05mg/l naa+25g/l蔗糖+7.5g/l agar(植物凝胶)培养条件中诱导丛生芽生成。切取长为2.0cm的芽，转移至添加有0.4mg/l iba、0.02mg/l naa、25g/l蔗糖、7.5g/l agar的1/2ms培养基中诱导生根，形成再生植株。炼苗后移栽到土壤里转移至温室中，植株生长状态良好。
9.本发明涉及的培养基经常规处理：先调节ph值为6.0后经高压灭菌后使用；高压灭菌为：在0.15mpa，121℃下灭菌20min。培养室温度：25
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1℃。悬浮细胞系培养置于恒温摇床中培养，培养条件：培养条件为26℃，110rpm。
附图说明
10.附图1诱导小黑杨花药愈伤组织的情况
11.附图2单倍体愈伤组织系的fcm检测
12.(a)小黑杨供体树的fcm检测结果；(b)小黑杨纯合愈伤组织的fcm检测结果；(c)小黑杨供体树与纯合愈伤组织的fcm检测结果融合图
13.附图3获得的不同愈伤组织系
14.(a)浅黄色的愈伤组织系；(b)白色的愈伤组织系；(c)表面呈隆起状愈伤组织系
15.附图4细胞系悬浮培养
16.附图5悬浮培养细胞生长曲线
17.附图6单倍体细胞系的植株再生
18.(a-b)单倍体细胞系诱导的不定芽；(c)单倍体细胞系再生的植株
具体实施方式
19.实例1小黑杨花药愈伤组织系诱导及单倍体细胞系的获得
20.2016年4月中旬期间，利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色对小黑杨花粉发育时期进行不间断观察。在小孢子发育到单核靠边期时，从树上切取雄性花穗，并在超净工作台内经消毒(75％酒精浸泡30sec；1％次氯酸钠消毒3min；无菌水漂洗3次)，去除其外被
苞片，将花药分散接种到添加有2.0mg/l 2,4-d、1.0mg/l kt、30g/l蔗糖和3.0g/l gelrite的ms培养基中，黑暗培养35d诱导出若干愈伤组织，通过继代增殖获得3000个愈伤组织系。将获得的愈伤组织系利用fcm技术进行检测。最终获得300个单倍体愈伤组织系。不同愈伤组织系在生长速度、褐化程度、颜色等方面差异较大，表现出极高的遗传变异率，可为优良悬浮细胞系的筛选提供重要的遗传学基础。
21.实例2单倍体细胞系悬浮培养体系的建立
22.选取在固体培养基上生长旺盛的愈伤组织，接种到添加有2,4-d(0.42-2.5mg/l)和kt(0-0.4mg/l)的ms液体培养基(表1)中进行悬浮培养，接种浓度为0.023g/ml。悬浮暗培养18d后，统计细胞增殖情况，结果显示，ms液体培养基+1.25mg/l 2,4-d+0.2mg/l kt+50g/l蔗糖条件为最佳细胞悬浮培养条件。培养16d时细胞增殖量达到最高。
23.表1悬浮培养基激素配比及对悬浮细胞生长情况的影响
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实例3单倍体细胞系的植株再生体系建立
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取悬浮培养的小黑杨单倍体细胞系1g接种到诱导不定芽分化培养基中(表2)，每种处理重复3次。光培养一个月后观察到，愈伤组织均变硬变绿。将它们在原培养条件下进行3次继代培养，三个月后发现只有在添加1mg/l 6-ba、0.2mg/l naa、0.05mg/l tdz、25g/l蔗糖、3.0g/l gelrite的ms固体培养基中的愈伤组织可诱导出不定芽。将诱导出的不定芽转移至ms培养基+0.2mg/l iba+0.05mg/l naa+25g/l蔗糖+7.5g/l agar培养条件下，培养15天后有大量丛生芽生成。
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从丛生芽中选取长为2.0cm的芽，接种到含有iba(0.2-0.4mg/l)和naa(0.01-0.02mg/l)的生根培养基(表3)中进行生根培养。2周后对生根情况进行统计，结果显示，在添加有0.4mg/l iba、0.02mg/l naa、25g/l蔗糖、7.5g/l agar的1/2ms培养基为最适生根培养条件，形成再生植株。炼苗后移栽到土壤里转移至温室中，植株生长状态良好。
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表2诱导小黑杨单倍体细胞系不定芽分化的培养条件
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表3小黑杨单倍体细胞系的生根培养条件
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